Involvement of cholecystokinin in chronic pain mechanisms and endogenous antinociception

Abstract

Current thesis explored the chronic pain phenotype of the CCK2 receptor deficient mice and tried to match some neurochemical correlates to the phenotype. First, we established that the CCK2-/- mice displayed hyposensitivity in the von Frey mechanical sensitivity testing model. The involvement of CCK-opioid reciprocal regulation was confirmed in this effect, because the hyposensitivity phenotype was reversed by administrating naloxone (0.1…10 mg/kg), antagonist of opioid receptors and, on the other hand, hyposensitivity was induced in the wild-type mice by administering L-365260 (0.01…1 mg/kg), a CCK2 receptor antagonist. Second, we established insensitivity to neuropathic pain in the CCK2-/- mice – only minor hypersensitivity was seen in these mice after conducting chronic constriction injury, as opposed to development of extensive hypersensitivity in wild-type animals. Gene expression analysis demonstrated disturbances in opioid peptide or opioid receptor gene expression in the mutant mice. We conclude that disruption of the CCK signal through the CCK2 receptor upregulates endogenous opioids to a degree that no apparent neuropathic pain symptoms develop. In the second part of the thesis we explored gene expression changes in the CCK2-/- mice in brainstem and midbrain, following induction of neuropathic pain, using Affymetrix mouse gene expression chips. We established strong activation of MAPK pathway as a response to peripheral nerve injury, regardless of the genotype in both CNS areas. We did not establish strong genotype x peripheral nerve injury interactions, the most interesting genotype effect (ANOVA genotype main effect) being Tlr4, a lipopolysaccharide recognizing gene. This again supports immune activation in the brainstem and midbrain following peripheral nerve injury and suggests that CCK2 receptor is implicated in interactions between immune system activation and CNS. Third, we studied stress-induced analgesia and the role of CCK and endocannabinoids. Stress-analgesia is an important manifestation of adaptational mechanisms. In addition, studying stress-analgesia provides us with information about endogenous analgesic mechanisms that could be used in clinical practice. We used electric foot-shock (0.6 mA, 3 min) as a stress model and measured pre-stress and post-stress analgesia levels with tail flick. We established that the CCK2-/- mice developed smaller analgesia to the same amount of stress. This implies that eliminating CCK2 signal disrupts some endogenous analgesic mechanisms. We administered opioid antagonist naloxone (0.01…10 mg/kg) and cannabinoid CB1 receptor antagonist rimonabant (0.1…3 mg/kg) and tested the effect on stress-induced analgesia. Naloxone blocked the analgesia in both CCK2-/- and wild-type mice. In contrast, rimonabant blocked the stress-analgesia only in wild-type animals and did not modify the knockout response. This result is in good agreement with subsequent gene expression profiling that demonstrated extensive activation of cannabinoid system in the wild-type mice in response to stress. This stress-related cannabinoid activation was largely absent in the mutant mice. We conclude that the signalling of CCK through CCK2 receptor is necessary for the stress-related endocannabinoid activation, as the CCK2-/- mice lack the endocannabinoid component of the stress-analgesia. Finally, we analysed the previously described Affymetrix gene chip data from the neuropathic animals from a different angle. Studying only the genotype effect (i.e. omitting the nerve injury factor) we observed that majority of the genotype differences (i.e. genes differentially expressed in CCK2-/- animals) mapped in close proximity (40 Mbp area) to the CCK2 gene in the mouse genome. Almost all genes with changed expression between the genotypes were in knockout-low direction. The genes clustered together by genomic location, but not by gene function. We confirmed that these genes were of 129sv parent line origin that were not lost even through extensive backcrossing to the C57BL/6 background. We conclude that mouse gene knockouts generated to the mixed background is not as clean model as historically thought and the observed phenotype of these mice may not be the result of only disruption of the single target gene. Käesoleva dissertatsiooni käigus uuriti CCK2 retseptori puudulike (CCK2–/–) hiirte kroonilise valu fenotüüpi ja üritati sellele fenotüübile leida ka neurokeemilisi korrelaate. Esiteks leidsime, et CCK2–/– hiirtel esines von Frey mehaanilise tundlikkuse testimise mudelis hüposensitiivsus. Selle leiu põhju­seks leiti olevat CCK ja opioidide vastastikune regulatsioon, sest hüposensitiiv­suse fenotüübi sai blokeerida opioidi retseptorite antagonisti naloksooni (0.1…10 mg/kg) manustamisega ja teisalt sai metsiktüüpi loomadel esile kutsuda hüposensitiivsuse CCK2 antagonisti L-365260 (0.01…1 mg/kg) manusta­misega. Teiseks kirjeldasime CCK2–/– hiirtel tundetust neuropaatilise valu suhtes, sest pärast kroonilise kompressiooni vigastust (chronic constriction injury) tekkis neil loomadel ainult minimaalne ülitundlikkus, vastandina metsik­tüüpi loomadele, kellel tekkis väga tugev ülitundlikkus. Geeniekspressioon-analüüs näitas mutantsetel hiirtel häireid opioidsete peptiidide ja opioidiretsep­torite geeniekspressioonis. Sellest järeldame, et CCK signaali häirimine läbi CCK2 retseptori võimendab opioidisüsteemi sellisel määral, et nähtavaid neuropaatilise valu sümptomeid ei teki. Käesoleva töö teises osas uurisime kroonilise kompressiooni vigastuse tekitamise järgselt CCK2–/– hiirte geeniekspressiooni muutusi ajutüves ja keskajus, kasutades Affymetrix'i hiire geeniekspressiooni kiipe. Leidsime, et vastuseks närvivigastusele, sõltumata genotüübist tekib tugev MAPK raja aktivatsioon mõlemas KNS piirkonnas. Me ei leidnud tugevaid genotüübi x perifeerse närvi vigastuse interaktsioone. Kõige huvitavam genotüübist sõltuv (genotüübi ANOVA peaefekt) kandidaatgeen oli Tlr4, lipopolüsahhariidile reageeriv geen. Ka see tulemus näitab perifeerse närvi vigastuse järgset immuun­­aktivatsiooni ajutüves ja keskajus ja lubab oletada, et CCK2 retseptor on seotud immuunsüsteemi aktivatsiooni ja KNS vaheliste interaktsioonidega. Kolmandaks uurisime stress-analgeesiat ja CCK ja endokannabinoidide rolli selles. Stress-analgeesia on oluline adaptatsioonimehhanismide näitaja. Lisaks sellele võimaldab stress-analgeesia uurimine endogeensetest analgeetilistest mehhanismidest rohkem teada saada ja seda teadmist kliinilises praktikas kasutada. Stressimudelina kasutasime elektrišokki jalgadele (0.6 mA, 3 min) ja analgeesia tasemeid enne ja pärast stressi mõõtsime tail flick meetodiga. Leidsime, et CCK2–/– hiirtel tekkis samale stressile vastuseks väiksem anal­geesia. See lubab oletada, et CCK2 signaali elimineerimine häirib mõningaid endogeense analgeesia mehhanisme. Järgmiseks manustasime loomadele opioidiretseptorite antagonisti naloksooni (0.01…10 mg/kg) ja kannabinoidi CB1 retseptori antagonisti rimonabanti (0.1…3 mg/kg) ja uurisime nende toimet stress-analgeesiale. Naloksoon pärssis analgeesiat mõlemal genotüübil, nii CCK2–/– kui ka metsiktüüpi hiirtel. Erinevalt naloksoonist pärssis rimonabant stress-analgeesiat ainult metsiktüüpi loomadel ja ei mõjutanud knockout hiirte vastust. See tulemus sobib hästi kokku järgnevalt teostatud geeniekspressiooni analüüsiga, milles leiti metsiktüüpi hiirtel vastuseks stressile ulatuslik kanna­bi­noidisüsteemi aktivatsioon. See stressiga seotud aktivatsioon suuresti puudus mutantsetel loomadel. Kokkuvõtteks, CCK toime läbi CCK2 retseptorite on vajalik stressiga seotud endokannabinoidide aktivatsiooni jaoks, sest CCK2–/– hiirtel puudub stress-analgeesia kannabinoidne komponent. Viimaseks analüüsisime ülalmainitud Affymetrix'i geeniekspressiooni kiibi neuropaatiliste loomade andmeid teise nurga alt. Uurides ainult genotüübi efekti (st jättes närvivigastuse faktori analüüsist välja) nägime, et enamus genotüübi erinevusi (st erinevalt ekspresseerunud geene CCK2–/– hiirtel) paiknes genoomis ühel konkreetsel regioonil, moodustades 40 Mbp ala CCK2 geeni ümber. Pea­aegu kõik genotüübi efektina muutunud ekspressiooniga geenid olid knockout-madala ekspressioonisuunaga. Need geenid klasterdusid genoomse asukoha, mitte aga geeni funktsiooni järgi. Me tegime kindlaks, et need geenid pärinevad 129sv vanemliinist ning need ei olnud kadunud isegi pärast paljukordset tagasiristamist C57BL/6 tausta. Sellest järeldame, et segatausta tekitatud geenipuudulikkused ei võimalda geenifunktsiooni uurida nii puhtalt nagu varasemalt arvatud ja et sellistel hiirtel kirjeldatud fenotüüp ei pruugi olla ainult ühe geeni väljalülitamise tagajärg.