Diversity of key catabolic genes at degradation of phenol and p-cresol in pseudomonads

Abstract

Biodegradatsiooniradade tuvastamine ja nendes osalevaid võtmeensüüme kodeerivate geenide uurimine võimaldab välja selekteerida ekstreemsetes tingimustes vastupidavad ja kõrgema bio-degradatsiooni efektiivsusega tüved, kasutamaks neid bioremediatsioonis. Sellest tulenevalt oli käesoleva töö eesmärkideks uurida pideva fenoolse reostusega veest eraldatud geneetiliselt erinevate pseudomonaadide kui enimlevinud biodegradatiivsete bakterite fenooli ja p-kresooli katabolismi võtmeensüüme kodeerivate geenide struktuuri ja avaldumise regulatsiooni, iseloomustada valitud tüüptüvede kataboolset aktiivsust nii üksiksubstraatidel kui ka substraatide segudes ning nende vastupidavust segapopulatsioonidena. Töös esitatud tulemused võib kokku võtta järgnevalt: 1) uuritud fenooli ja p-kresooli lagundajate konsortsiumis on enimlevinud multikomponentset fenooli hüdroksülaasi omavad bakteritüved; 2) P. fluorescens biotüübis C ja F ning paljudes P. putida tüvedes toimub esmane fenooli lagundamine ühekomponentse fenooli hüdroksülaasi ja katehhooli 1,2-dioksügenaasi abil (kodeeritud pheBA operoni poolt). Selgus, et 2 tüve (P. putida PC16 ning P. fluorescens P69) omavad nii ühe- kui ka multikomponentset fenooli hüdroksülaasi, kusjuures ekspresseerub vaid ühekomponentne fenooli hüdroksülaas; 3) erineva katabolismitüübiga fenooli ja p-kresoolilagundajaid baktereid P. mendocina PC1, P. fluorescens PC18 ja PC24 iseloomustavad oluliselt erinevad kineetilised kasvuparameetrid; 4) fenooli ja p-kresooli lagundatakse nende substraatide segudest samaaegselt juhul, kui lagundamine toimub samatüübilistes degradatsiooniradades (tüved PC1 ja PC24), ja üle diauksia, kui lagundamisrajad on erinevad (tüvi PC18); 5) tüvede PC18 ja PC24 erinev p-kresooli metüülhüdroksülaasi induktsioon on tingitud regulaatorvalkude PchR järjestuste erinevustest; 6) biodegradatiivse efektiivsuse uurimine poolkoksi leovett ning põlevkivi toorõli sisaldavates mikrokosmkatsetes tüüptüvedest koosneva segapopulatsiooniga näitas, et erinevates mikrokosmides domineerivad kindlate aromaatsete ühendite lagundamisradadega populatsioonid.Bioavailability of pollutants as well as survival and catabolic activity of introduced microorganisms play important roles in bioremediation technologies. Therefore, before applying the bioaugmentation, it is necessary to isolate, identify and characterise pollutant-degrading indigenous bacterial strains and analyse their activity in situ. The first scope of the current thesis was to analyse the structure and regulation of expression of the key enzymes in catabolic pathways of phenol and p-cresol degradation in pseudomonads isolated from river water continuously polluted with phenolic compounds. The second aim of the thesis was to characterise catabolic activity of the specific types of strains in single as well as mixed substrate cultivations, and longevity of these strains in mixed populations. Based on results presented in the thesis, following conclusions were made: 1) in the studied natural consortium of phenol and p-cresol degraders the strains bearing multicomponent phenol hydroxylases were most abundant; 2) P. fluorescens strains from biotypes C and F were shown to possess the pheBA operon, which was also detected in the majority of P. putida biotype B strains. The strains P. putida PC16 and P. fluorescence P69 possessed both, single and multicomponent phenol hydroxylases, but only single component phenol hydroxylase activity was expressed; 3) the strains P. mendocina PC1, P. fluorescens PC18 and PC24, representing different catabolic types, have different whole-cell kinetic parameters; 4) the degradation of phenol and p-cresol from their mixtures by bacteria occurred simultaneously in cases where these substrates were degraded via the same pathway (strains PC1 and PC24); and via diauxie if different degradative pathways were involved (PC18); 5) the expression of p-cresol methylhydroxylase genes in strains PC18 and PC24 was induced differently because of changes in amino acid sequences of the PchR regulators; 6) the microcosm experiments using mixed bacterial cultures on phenolic leachate, and oil-amended microcosms to investigate biodegradation efficiency indicated that specific bacterial populations were selected in both experiments.