Diamine oxidase-based biosensors: construction and working principles

Date

2011-05-16

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Doktoritöö eesmärgiks oli uurida diamiini oksüdaasil baseeruvate biosensorite kontrueerimist biogeensete amiinide määramiseks toiduainetes. Selleks puhastati herne idudest diamiini oksüdaas ning uuriti selle ensüümi selektiivsust erinevate amiinide suhtes. Selgus, et diamiini oksüdaasi selektiivsus on kõige kõrgem kadaveriini ja putrestsiini suhtes, mis oli heaks eelduseks biogeensete amiinide biosensori konstrueerimiseks. Biogeensete amiinide koosmõju uurimiseks biosensori väljundsignaalile viidi läbi mõõtmised lahustes, mis sisaldasid samaaegselt kahte või enamat amiini. Selgus, et kadaveriin ja putrestsiin elimineerivad osaliselt teineteise individuaalset mõju väljundsignaalile. Histamiini leidumise korral lahustes selgus, et kadaveriini ja/või putrestsiini olemasolul ei avalda histamiin biosensori väljundsignaalile detekteeritavat mõju. Erinevate amiinide mõjude osakaalude kirjeldamiseks biosensori väljundsignaalile pakuti välja mitme muutujaga mudel, mis võimaldas iseloomustada biosensori väljundsignaali mitut substraati sisaldavates segudes ja biosensori kalibreerimist nende määramisel. Korrelatsioon katsetulemuste ja mudeli abil leitud tulemuste vahel oli kõrge (standardhälve 0,097 ja korrelatsioonikordaja 0,93). Diamiini oksüdaasi stabiliseerimiseks immobiliseeriti see nailonniidile. Immobiliseeritud ensüüm oli stabiilne vähemalt 3 kuud 4oC juures või 120 mõõtmise jooksul. Immobiliseeritud ensüümi eriaktiivsus oli (4,6 ± 0,4) × 10-4 IU/cm, mis oli piisav biosensori kontrueerimiseks. Konstrueeritud biosensorit, mis koosnes 90 cm pikkusest diamiini oksüdaasi-sisaldavast nailonniidist ja hapnikuandurist, kasutati edukalt kala (hõbeheigi) proovide värskuse hindamiseks. Kadaverini ja putrestsiini sisaldus määrati eelnevalt töötlemata kala (hõbeheigi) proovides 5 minuti jooksul ning saadud tulemused olid heas kooskõlas kõrgefektiivse vedelikkromatograafiaga saadud tulemustega.
The aim of the thesis was to construct a diamine oxidase-based biosensor for the detection of biogenic amines in foodstuff. Diamine oxidase was isolated and purified from pea seedlings and it showed highest selectivity towards cadaverine and putrescine, which formed a solid base for the construction of diamine oxidase-based biosensor for a rapid detection of these biogenic amines. The interaction of cadaverine and putrescine in the mixtures of several amines partially eliminated their individual impacts on the signal, causing the decrease of the resulting signal output. In the presence of cadaverine and/or putrescine, histamine did not cause any detectable signal. For the examination of individual impacts of the studied substrates into the biosensor output signal, multivariate correlation analysis was used to construct a model enabling the characterization of the biosensor output and biosensor calibration towards several substrates in the mixtures of different biogenic amines. A good correlation of the proposed model with the experimental data was established (standard deviation 0.097 and correlation coefficient 0.93). Diamine oxidase was successfully immobilized onto nylon threads. The immobilized enzyme was stable for at least 3 months at 4oC or 120 measurements. The specific activity of the immobilized enzyme was (4.6 ± 0.4) × 10-4 IU/cm, which was sufficient for the construction of a biosensor. A simple biosensor, comprising 90 cm long diamine oxidase-containing nylon threads and an oxygen sensor was an effective option for the detection of biogenic diamines. With this biosensor we could successfully evaluate the quality of fish (hake) probes within 5 minutes and the obtained results were in good correlation with the outcome of HPLC analyses.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.

Keywords

biosensorid, amiinid, oksüdaasid, ensüümitehnoloogia, toiduainete kontroll, dissertatsioonid, biosensors, amines, oxidases, enzyme technology, food isnpection

Citation