Application of isothermal amplification methods for detection of Chlamydia trachomatis directly from biological samples

Abstract

Praeguseks on teada enam kui 30 erinevat sugulisel teel levivat bakterit, viirust ja parasiiti, kes kõik võivad nakatada kahjustades reproduktiivorganeid. Üheks peamiseks probleemiks on nenede patogeenidega nakatamise aladiagnoos, sest valdavalt kulgevad suguhaigused asümptomaatiliselt. Avastamata ja ravimata suguhaigused võivad põhjustada pikaajalisi ebamugavusi või viia hoopis tervistkahjustavate tagajärgedeni, näiteks tekitada põletikku emakakaelas, munajuhas või kusitis, suurendada emakaväliseraseduse ja isegi viljatuse tõenäosus. Selleks, et võimalikke tüsistusi vähendada on oluline haiguse õigeaegne ravi. Selleks on vajalik patogeenide kiire ja täpne diagnoosimine. Antud projekti eesmärgiks oli arendada ja optimeerida kiire, täpne ning usaldusväärne isotermilise amplifikatsiooni meetod sugulisel teel leviva bakteri C. trachomatise tuvastamiseks otse uriinist, mida oleks võimalik tulevikus rakendada kodukasutuseks mõeldud kiirtestides. Kuna tänapäeval puuduvad täpsed ning usaldusväärsed kiirtestid C. trachomatise tuvastamiseks otse uriinist (tundlikkus on 40% ulatuses, sõltudes bioloogilisest materjalist) on väga oluline selle suuna edasine arendamine. Samas ka bioloogilise materjali eeltöötlusest sõltub olulisel määral eduka patogeense DNA vabastamine rakust ja selle järgnev tuvastamine, seega on ka selle optimeerimine väga oluline. Isotermilised amplifikatsiooni meetodi abil nagu RPA ja LAMP oleks aga võimalik luua platformi kiire, täpse ning usaldusväärse C. trachomatise tuvastamiseks otse bioloogilisest materjalist. RPA meetod suudab kasutada bioloogilise materjali lüüsimiseks kuumust, samas kui LAMP meetodiga on võimalik patogeenset DNA vabastamist ka antimikroobsete peptiidide abil. Suutsime näidata, et isotermilise amplifikatsiooni meetodid nagu RPA ja LAMP tänu oma eelistele nagu tundlikkus, spetsiifilisus, kiirus, täpsus, odavus ning lihtsus saaks optimeerimise järel rakendada tulevikus kiirtestides nii C. trachomatise kui ka erinevate patogeenide tuvastamiseks otse bioloogilisest materjalist. More than 30 different bacteria, viruses, and parasites can be transmitted through sexual contact and cause sexually transmitted diseases. The main problem is that most of these infections are asymptomatic and therefore remain untreated, which, over time, leads to serious complications such as ectopic pregnancy, female infertility, or chronic pelvic pain. As such, prompt and accurate identification of pathogens and early stage detection of infections helps to prevent the development of long-term complications and reduce the risk of co-infections. Nucleic acid amplification technologies (NAATs) offer the most sensitive methods of detecting various sexually transmitted pathogens in a laboratory due to their improved sensitivity over immunoassays and traditional culture-based methods. In an attempt to reduce the sample processing time and overall cost of PCR- based methods, isothermal nucleic acid amplification methods offer significant advantages because they do not need a thermocycling machine and can be performed with reduced time while providing accurate and reliable results with less-invasive clinical samples for screening. This dissertation focuses on the detection of Chlamydia trachomatis using loop-mediated isothermal amplification and recombinase polymerase amplification methods directly from clinical samples. These methods can be performed at constant temperature, have high sensitivity and can recognize even a few copies of the template DNA. Furthermore, the detection of an amplification signal can be performed within 10 - 20 min. The visualization of results can also be performed using lateral flow detection strips because the amplified product could be detected without prior purification. The approaches presented herein could provide a good basis for developing a point-of-care (POC) diagnostic platform in laboratories with limited resources.