Sünteetiliselt letaalsete mutantide sõelumine
Sünteetiliselt letaalsete mutantide sõelumist kasutatakse erinevate (ka parelleelsete) radade uurimiseks ning otseste valk-valk interaktsioonide kindlaks tegemiseks. See meetod põhineb fenomenil, et vaid topeltmutatsioonid on letaalsed, mõlemad üksikmutatsioonid eraldi ei põhjusta rakkude surma ja on funktsionaalsed.
Tähtis on konstrueerida õige algtüvi, mida sõelumisel kasutada. Tüvi peaks olema sobilik, et kiiresti kindlaks teha kas uus mutatsioon asub mõnes teises geenis ja kas sellel uuel mutatsioonil on talle omane fenotüüp. Kasutatakse nii URA3 markergeeni (võimalik selekteerida nii poolt kui ka vastu) kui ka ADE2 markergeeni (võimaldab kasutada kolooniate värvi järgi eristamist).
Sõelumine koosneb mitmest etapist (joonis 13):
1. Algtüve valmistamine
Alustatakse pärmitüvest, mis sisaldab kromosoomis meid huvitavat mutatsiooni (näiteks temperatuuritundlik alleel yfg1ts) ning ura3 ja ade2 retsessiivseid alleele. See tüvi vajab selektiivsöötmel kasvamiseks uratsiili ja adeniini ning moodustunud kolooniad on punased. Tüvesse transformeeritakse plasmiid, mis sisaldab URA3 ja ADE2 markergeene ning millelt ekspresseerub YFG1 metsiktüüpi alleel. Transformandid selekteeritakse selektiivsöötmel, millest puudub uratsiil. Moodustunud kolooniad on valge värvusega, sest plasmiidilt ekspresseeruv ADE2 markergeen komplementeerib ade2 mutatsiooni. Saadud tüvi ei ole enam temperatuuritundlik, sest plasmiidilit ekspresseerub YFG1 metsiktüüpi alleel.
2. Mutagenees
Viiakse läbi ülegenoomne mutagenees ja kasvatatakse üles järglaskond.
3. Sünteetiliselt letaalsete mutantide sõelumine
Otsitakse kolooniaid, kes ei ole võimelised kasvama ilma YFG1 metsiktüüpi alleeli ekspresseeriva plasmiidita. Selleks tehakse tempelkülv söötmele, mis sisaldab 5-fluoro-oroothapet (5-FOA). Plasmiidi kadumist saab tuvastada ka koloonia värvi järgi. Plasmiidi kaotanud kolooniad on punased, sest kromosomaalset ade2 mutatsiooni ei komplementeerita. Juhul kui tekkinud uus mutatsioon on sünteetiliselt letaalne meie poolt uuritava mutatsiooniga yfg1ts, siis plasmiidi kaotamisel rakud surevad.
Joonis 13. Sünteetiliselt letaalsete mutantide sõelumine.