Geeni kloonimine komplementatsiooni teel
Geeni kloonimist komplementatsiooni teel kasutatakse juhtudel kui tegemist on retsessiivse mutatsiooniga ning mutatsiooni poolt põhjustatud fenotüüp on kergesti eristatav metsiktüüpi rakkudest.
Meetodi etapid (Joonis 4):
- Mutatsiooni omavatesse rakkudesse transformeeritakse genoomne või cDNA raamatukogu. Tavaliselt kasutatakse tsentromeersesse plasmiidi kloonitud raamatukogu, sest need plasmiidid on madala koopiaarvuga plasmiidid (1-4 molekuli raku kohta).
- Selekteeritakse metsiktüüpi fenotüübiga transformandid.
- Plasmiid eraldatakse pärmirakkudest ja transformeeritakse E. coli rakkudesse.
- Plasmiidis sisalduv pärmi järjestus sekveneeritakse.
Juhul kui saadud DNA järjestus sisaldab mitut avatud lugemisraami, siis kloonitakse need eraldi plasmiididesse ning analüüsitakse nende võimet komplementeerida mutantset fenotüüpi.
Joonis 4. Geeni kloonimine komplementatsiooni teel.
Lisaks kontrollitakse, kas kindlaks tehtud geen on mutantne genoomis. Selleks analüüsitakse mutandi genoomset järjestust. Sekveneerimisel tehakse kindlaks geenis asuv mutatsioon, mis põhjustab fenotüübi teket. Teine võimalus kandidaatgeeni kontrollimiseks on see geen deleteerida pärmigenoomist. Seejärel ristatakse uuritav mutante tüvi kandidaatgeeni deletsioonitüvega. Tetraadide analüüsi kasutades analüüsitakse saadud diploidi järglasi. Kui kõik nelja koloonia genotüübid on identsed vanemate genotüüpidaga (kaks ühe vanemaga ja kaks teise vanemaga), siis paikneb mutatsioon kandidaatgeenis (Joonis 5).
Joonis 5. Tetraadide analüüsil saadud kolooniate fenotüüpide analüüs. Uuritav temperatuuritundlik mutant ristati tüvega, kus kandidaatgeen on deleteeritud URA3 markergeeniga. Ühest diploidsest rakust pärit järglastel on vanematega identsed genotüübid.
Kui tetraadide analüüsil saadakse kolooniad, kes sisaldavat mõlemat mutatsiooni, siis uuritav mutatsioon ei paikne kandidaatgeenis ning tegemist on suppressoriga (Joonis 6).
Joonis 6. Tetraadide analüüsil saadud kolooniate fenotüüpide analüüs. Uuritav temperatuuritundlik mutant ristati tüvega, kus kandidaatgeen on deleteeritud URA3 markergeeniga. Ühest diploidsest rakust pärit järglastel on nii vanemtüüpi kui ka vanematest erinevad genotüübid.