Genoomi järjestuste lisamine
Lisaks geeni deleteerimisele on võimalik pärmigenoomi viia erinevaid järjestusi. Kasutatakse lineaarseid DNA molekule, mis transfomeerimisel pärmirakku integreeruvad kromosoomi homoloogilise rekombinatsiooni kaudu.
On võimalik
- ekspresseerida valke liitvalkudena
- muuta geeni transkriptsiooni promootori vahetamise abil
- märgistada kromosoomi teatud regioonid markergeenidega
1. Valgu ekspressioon liitvalguna.
Kõige sagedamini lisatakse valku kodeerivale järjestusele (ORF e. avatud lugemisraam) epitoope, fluorestseeruvaid valke või valgu puhastamiseks sobilikke peptiide/valke kodeerivaid järjestusi. Järjestusi on võimalik lisada ORF-i ette (nimetatakse ka N-terminaalne) või taha (nimetatakse ka C-terminaalne). Lühemaid epitoope kodeerivaid järjestusi saab lisada ka ORF-i sisse. Lisatavad järjestused peavad olema samas lugemisraamis, mis valku kodeeriv järjestus. Integreeritav DNA sisaldab veel pärmi selektsioonimarkerit ning antud regiooni spetsiifilisi homoloogilisi järjestusi (Joonis 9).
Joonis 9. Epitoobi järjestuse lisamine ORF-i taha.
2. Promootori vahetamine.
Promootori vahetamine võimaldab muuta geeni ekspressiooni. Sellisel juhul integreeritakse geeni kodeeriva järjestuse ette selektsioonimarker koos uue promootori järjestusega (Joonis 10).
Joonis 10. ORF-i ees oleva promootori vahetamine. pGAL, GAL1 geeni promootor.
Saab kasutada nii konstitutiivseid kui ka reguleeritavaid promootoreid. Põhjalikumalt käsitletakse pagaripärmis töötavaid promootoreid õpiobjektis "Pärmigeneetika:pärmitüvede genotüübid, tüvede kasvatamiseks kasutatavd söötmed".
Näiteks: GAL1 promootor on galaktoosi poolt indutseeritud ja glükoosi poolt represeeritud. Galaktoosi lisamisel aktiveeritakse transkriptsioon ning uuritav geen ekrpesseerub. Glükoosi lisamisel transkriptsiooni ei toimu.
3. Regiooni märgistamine markergeeniga.
Mõnikord on vaja teatud kromosoomi osa märgistada, et uurida näiteks selle pärandumsit. Sellisel juhul viiakse lookusesse selektsioonimarker, mis pärandub koos uuritava kromosoomi osaga. Jälgitakse selektsioonimarkeri pärandumist, sest seda on võimalik kiiresti ning lihtsalt analüüsida.