Sobilikum meetod homoloogide uurimiseks on plasmiidi-vahetamise meetod. Selleks tuleb kloonida tsentromeersed süstik-vektorid:
- plasmiid 1 sisaldab S. cerevisiae GEEN X kodeerivat järjestust koos promootor- ja terminaatorjärjestustega ning URA3 selektsioonimarkerit
- plasmiid 2 sisaldab S. pombe geenY+ kodeerivat järjestust koos S. cerevisiae GEEN X promootor- ja terminaatorjärjestustega ning LEU2 selektsioonimarkerit.
- kontrollplasmiid 3 sisaldab S. cerevisaie GEEN X kodeerivat järjestust koos promootor- ja terminaatorjärjestustega ning LEU2 selektsioonimarkerit.
Katses kasutatakse pagaripärmi GEEN X deletsioonitüve (
geenX,
ura3,
leu2), kuhu on sisse transformeeriutd URA3 markergeeniga tsentromeerne plasmiid ning sellelt ekspresseerub GEEN X (plasmiid 1). See on nn. vastuvõttev tüvi.
Katse etapid:
1. Plasmiidi 2 transformatsioon.
Plasmiid 2, mis sialdab LEU2 markergeeni ja S. pombe geenY+, transformeeritakse vastuvõtvasse tüvesse. Transformandid selekteeritakse söötmel, millest puuduvad uratsiil ja leutsiin. Saadud pärmitüvi sisaldab nüüd mõlemat plasmiidi.
2. Plasmiidi 1 vastuselektsioon.
Pärmirakud külvatakse 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldavale söötmele. Sellel söötmel kaotavad rakud URA3 markergeeniga plasmiidi.
3. Tulemuste analüüs.
Analüüsitakse rakkude võimet moodustada kolooniaid. Juhul kui rakud jäävad 5-FOA söötmel ellu, siis S. pombe geenY+ suudab komplmenteerida GEEN X deletsiooni pagaripärmi genoomis. Tegemist on samasugust funktsiooni omavate geenidega. Kui rakud 5-FOA söötmel kolooniaid ei moodusta siis S. pombe geenY+ ei asenda pagaripärmi GEEN X ning nendel geenidel on rakus täita erinevad funktsioonid.
Katses kasutatakse kontrollplasmiididena:
- ilma inserdita tsentromeerset plasmiidi, mis sisaldab LEU2 selektsioonimarkerit
- kontrollplasmiidi 3 (GEEN X ja LEU2 selektsioonimarker).
Ka nende plasmiididega viiakse läbi plasmiidide vahetamine. Rakud, kes sisaldavad ilma inserdita LEU2 markergeeniga plasmiidi, 5-FOA söötmel surevad, sest GEEN X on eluks hädavajalik. Rakud, kes sisaldavad kontrollplasmiidi 3, peaksid 5-FOA söötmel kasvama, sest GEEN X genoomne deletsioon on komplementeeritud LEU2 selektsioonimarkerit sisaldavalt plasmiidilt.