Pärmirakkude transformatsioon
Transformatsiooni all peetakse silmas raku geneetilist muutmist, mis toimub eksogeense DNA sattumisel rakku. Pagaripärm Saccharomyces cerevisiae on eukarüootide seas unikaalne, sest teda on kerge DNA-ga transformeerida. Sõltuvalt transformeeritavast DNA-st, see kas rekombineerub pärmigenoomi või replitseeritakse rakus episoomina. Edukaks transformatsiooniks on vaja:
- meetodit, mille abil DNA rakku viiakse
- selektsioonimarkerit, mille abil transformante selekteeritakse
- vektorsüsteemi, mille abil DNA-d paljundatakse ja säilitatakse nii bakters E. coli kui ka pärmis
Esimene pärmiraku transformeerimise meetod avaldati Hinnen et al poolt 1978. a. See meetod põhines pärmirakkude töötlemisel zümolaasiga. Zümolaas degradeerib rakukesta ning moodustuvad sferoplastid (e. pärmi protoplastid). Sferoplaste inkubeeriti DNA-ga polüetüleenglükooli (PEG) ja CaCl2 juuresolekul.
Tänapäeval on kasutusel neli erinevat meetodit:
- sferoplastide transformatsioon
- rakkude transformeerimine Li-soolade juuresolekul
- elektroporatsioon
- biolistiline meetod
Meetodi valik sõltub teostatava eksperimendi eesmärgist, transformeeritavate tüvede arvust ning vajaminevate transformantide hulgast. Transformatsiooni efektiivsus on tavaliselt kõige tähtsam faktor, millega tuleb arvestada. Kui soovitakse pärmirakku sisse viia plasmiidset DNA-d, siis tavaliselt piisab 10-50 transformandist. Kuigi plasmiidse DNA transformatsioniks sobivad kõik loetletud meetodit, valitakse tavaliselt kõige lihtsam ja odavam - transformatsioon Li-soolade juuresolekul. Kui aga soovitakse transfomeerida DNA raamatukogu ning saada 106 transformanti, siis tuleb transformeerimise meetod hoolikalt valida. Li-soolade juuresolekul transformatsioon ja elektroporatsioon, mõlemad annavad soovitud transformantide hulga.
Põhjalikumalt tutvustatakse
pärmide selektsioonimarkereid õpiobjektis "Pärmigeneetika: pärmitüvede
genotüübid, tüvede kasvatamiseks kasutatavad söötmed".
Ülevaade pagaripärmis kasutatavatest süstik-vektoritest on toodud õpiobjektis "Pärmigeneetika: pärmides kasutusel olevad plasmiidid, plasmiidi-vahetamise meetod".
Pärmirakkude transformatsiooni kasutatakse:
- mutatsioonidega lookuste iseloomustamisel kasutades komplementatsiooni
- kromosoomi funktsionaalsete järjestuste analüüsil (replikatsiooni alguspunkt, tsentromeer, telomeer, jne.)
- suppressorite kindlaks tegemisel
- geenide deleteerimisel
- geenide asendamisel/muutmisel
- pärmigenoomi uute geenide lisamisel