Selektsioonimarkeri eemaldamine genoomist
Selektsioonimarkeri eemaldamine pärmigenoomist osutub vajalikuks
- tööstuses kasutatavate pärmitüvedega töötamisel
- üksikuid auksotroofseid mutatasioone omavate pärmitüvedega töötamisel
Markergeeni eemaldamine võimaldab lahti saada võõrast, genoomi sisse viidud DNA-st. Samuti saab pärast selektsioonimarkeri eemaldamist sama markergeeni korduvalt kasutada.
Kasutatakse kahte meetodit:
- Cre/Lox süsteem
- "pop-in pop-out" süsteem
1. Cre/Lox süsteem
Cre rekombinaas on tüüp I topoisomeraas, mis tunneb ära spetsiifilisi loxP järjestusi. Pärmitüve transformeerimisel kasutatakse selektsioonimarkerit, mille mõlemas ostas asuvad loxP järjestused (Joonis 12). Seejärel transformeeritakse rakkudesse Cre rekombinaasi ekspressiooniplasmiid. Cre rekombinaas viib läbi loxP järjestuste vahel rekombinatsiooni jättes genoomi alles vaid ühe, 34 nukleotiidi pikkuse loxP järjestuse.
Joonis 12. Cre/Lox süsteem selektsioonimarkeri eemladamiseks.
2. "pop-in pop-out" süsteem.
"pop-in pop-out" süsteemi töötasid välja Scherer ja Davis (1979). Meetod põhineb URA3 markergeeni kasutamisel ning selle poolt ja vastu selektsioonil (Joonis 13).
Mutatsiooniga uuritav geen kloonitakse URA3 markergeeni sisaldavasse integratsioonivektorisse. Mutatsiooniks võib olla deletsioon(id), üksikud aminohappe vahetused, insertsioon(id) jne. Saadud plasmiid lineariseeritakse ja transformeeritakse ura3-52 mutatsiooni omavasse pärmitüvesse. Selekteeritakse kolooniad, kes kasvavad uratsiili mittesisaldaval söötmel. Transformatsioonil integreerub plasmiid pärmigenoomi kasutades homoloogilist rekombinatsiooni. Toimub lookuse duplikatsioon - lookuses on metsiktüüpi alleel ja mutantne alleel. Homoloogste kordusjärjestuste vahel võib toimuda rekombinatsioon. Selle toimumisel kaob kromosoomist plasmiidne järjestus ja üks geeni alleelidest. Vastavaid rekombinante selekteeritakse 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldaval söötmel.
Joonis 13. "pop-in pop-out" süsteem selektsioonimarkeri eemaldamiseks.