Insertsiooniline mutagenees
Üks kõige odavam ja lihtasam mutantide kollekekstiooni tegemise viis on insertsiooniline mutagenees. See meetod töötati välja bakteri E. coli jaoks 1980-ndate alguses. Kasutati bakteriofaagil põhinevaid transposoone.
Pagaripärmis on kasutatud minitransposooni mTn, mis on valmistatud E. coli elemendi Tn3 baasil.
Minitransposoon mTn-3xHA/lacZ sisaldab lacZ reportergeeni ilma promootorita ja start koodonita (Joonis 12). Selle integratsioonil avatud lugemisraami (ORF) ta transkribeeritakse ning transleeritakse juhul kui reportergeen asub ORF-ga samas lugemisraamis. Transposooni otstes paiknevad loxP järjetsused, mis tuntakse ära Cre rekombinaasi poolt. Ühele loxP järjetsusele järgneb 3 koopiat hemaglutiniini (3xHA) epitoobi järjestust. Cre rekombinaasi ekspresseerimisel toimub loxP järjestuste vahel rekombinatsioon ning genoomi jääb alles üks loxP järjestus koos 3xHA epitoopi kodeeriva järjestusega. Juhul kui transposoon on integreerunud genoomi kodeerivasse alasse ning on ORF-iga samas lugemisraamis, siis ekspresseeruvad HA epitoobiga liitvalgud. Seega võimaldab transposooni insertsioon uurida:
- geeni ekspressiooni määrates
-galaktosidaasi aktiivsuse;
- valgu lokalisatsiooni kasutades immunofluorestsentsi meetodit ja HA epitoopi ära tundvaid antikehasid,
- geeni deletsiooni fenotüüpi
Joonis 12. Insertsiooniline mutagenees kasutades mTn transposooni.
Pärmi genoomne raamatukogu muteeriti bakteris kasutades mTn-3xHA/lacZ. Transposooni sisaldavad järjestused transformeerti pärmigenoomi. Toimus homoloogiline rekombinatsioon ning metsiktüüpi lookus asendus transposooni sisaldava järjestusega. Sellist meetodit kasutades eraldati 11 232 erinevat tüve, kes sisaldavad ekspresseeruvat lacZ reportergeeni. Insertsiooni koht määrati 6358 tüves. Leiti, et 5442 tüves oli transpositsioon toimunud kas ORF-i lähedussse (200 nukleotiidi raadiuses) või selle sisse.
Fenotüüpide uuringuks transfomeeriti pagaripärmi haploidsesse tüvesse 7680 mTn insertsiooniga alleeli. Saadud tüvesid kasvatati 20 eri kasvutingimusel. Selgus, et transposooni insertsioon 407 geeni põhjustas kasvudefekti. Lisaks võimaldas HA epitoobi järjestus uurida valkude rakusisest lokalisatsiooni. Uuringus kasutati 1340 diploidset tüve, kes sisaldasid HA järjestust samas lugemisraamis transleeritava valguga. 214 tüves detekteeriti signaali tsütoplasmas paiknemine. 201 tüves detekteeriti liitvalkude lokalisatsioon tuumas, tuumakeses, mitokondris, plasmamembraanis, punga kaelas ja käävi organiseerivas keskuses.