Probleemülesanne II
Probleemülesanne II
GEEN Z on pagaripärmi eluks hädavajalik geen. Selle geeni funktsiooni uurimiseks on vaja isoleerida geen Z konditsionaalsed alleelid. Kuidas isoleerida temperatuuritundlikud mutandid, kes ei ole võimelised kasvama mittefermenteeritaval süsiniku allikal (näiteks glütseroolil)?
geen Z) ning kes sisaldab URA3 markergeeniga plasmiidi, millelt ekspresseerub metsiktüüpi GEEN Z alleel. Seejärel paljundatakse GEEN Z järjestus kasutades vigu tegevat PCR meetodit. Saadud PCR produktid kloonitakse plasmiidi, mis sisaldab selektsioonimarkerit LEU2. Tulemuseks on plasmiidide raamatukogu, mis sisaldab juhuslikke mutatsioone geen Z* järjestuses. Vastuvõtvasse tüvesse transformeeritakse geen Z* mutantseid alleele sisaldavad plasmiidid. Transformandid selekteeritakse URA3 ja LEU2 selektsioonimarkerite järgi. Metsiktüüpi GEEN Z järjestust sisaldava plasmiidi vastuselektsiooniks külvatakse saadud kolooniad 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldavale söötmele. Rakud kaotavad URA3 plasmiidi. Alles jäänud LEU2 selektsioonimarkeriga plasmiididelt ekspresseeruvad geen Z* mutantsed alleelid. Saadud kolooniate hulgast selekteeritakse soovitud fenotüübiga tüved. Selleks tembeldatakse kolooniad kahele erinevale söötmele. Üks sööde sisaldab fermenteeritavat süsiniku allikat (näiteks glükoos) ja teine mittefermenteeritavat süsiniku allikat (näiteks glütserool). Tasse kasvatatakse 25 oC ja 36 oC juures. Isoleeritakse kolooniad, kes ei ole võimelised kasvama mittefermenteeritaval süsiniku allikal 36 oC juures.