GEEN Z on pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae eluks hädavajalik geen. Selle geeni deletsioon on letaalne, st. pärmirakud ei suuda kasvada rikkal söötmel 30 oC juures. Geeni promootorala sisaldab mitmeid järjestuse motiive, mis võiks osaleda transkriptsiooni regulatsioonil. On teada, et GEEN Z transkriptsioon aktiveeritakse erinevatel stressitingimustel.
Stressikatsetes kasutatakse nii selektiivset söödet kui ka rikast (mitteselekteerivat) söödet. Milline pärmitüvi tuleks konstrueerida, et uurida promootoralas asuvate motiivide funktsionaalsust? Kirjeldage tüve valmistamist üksikute etappide kaupa.
Pärmitüve valmistamisel tuleb arvestada kahe kitsendava asjaoluga:
- Stressikatsetes kasutatakse nii selektiivsöödet kui ka rikast (mitteselekteerivat) söödet. Rikkal söötmel ei ole võimalik pärmirakkudesse transformeeritud plasmiidi selekteerida/säilitada. Seepärast ei saa kasutada plasmiide ja plasmiidi-vahetamise meetodit. Kõik pärmitüvesse lisatavad järjestused tuleb integreerida genoomi.
- GEEN Z on eluks hädavajalik geen. Geeni deleteerimisel pärmirakud surevad. Letaalseks võivad osutuda ka promootoralas paiknevate motiivide mutatsioonid, sest võib muuta geeni ekpressioonitaset.
GEEN Z promootorala uurimiseks valmistatakse esmalt integratsiooniplasmiid, mis sisaldab GEEN Z promootorala ja sellele järgnevat reportergeeni (näiteks lacZ). Plasmiidis olev pärmi selektsioonimarker määrab genoomi integreerumise koha. Plasmiid lineariseeritakse, saadud lineaarne DNA molekul transformeeritakse vastavat auksotroofset mutatsiooni sisaldavasse pärmitüvesse. Transformandid selekteeritakse selektiivsöötmel. Promootori aktiivsuse hindamiseks mõõdetakse reportergeeni ekspressioonitaset. Kõik vajalikud promootori mutatasioonid tehakse integratsiooniplasmiidis ning seejärel integreeritakse need selektsioonimarkeri lookusesse. Selliselt valmistatud pärmitüves ekspresseerub GEEN Z sarnaselt metsiktüüpi tüvega, sest seda lookust ei muudeta.
Probleemülesanne I