Poolduvas pärmis töötavad promootorid
Poolduva pärmi Schizosaccharomyces pombe ekspressioonisüsteemides kasutatavad promootorid võib jagada:
1. konstitutiivsed promootorid (vt. tabel 11)
Kõige enimkasutatud on alkoholi dehüdrogenaasi adh1+ geeni promootor. See on tugev promootor ning töötab nii glükoosi kui ka glütserooli sisaldavas söötmes.
Tabel 11. Poolduvas pärmis kasutatavad konstitutiivsed promootorid.
Promootor | Päritolu | Ekspressiooni tase |
adh1+ | alkoholi dehüdrogenaasi geen |
kõrge |
SV40 | SV40 väike T-antigeen | madal |
cam1+ | kalmoduliini geen |
madal |
tif51+ |
translatsiooni elongatsiooni faktor eIF5A geen | kõrge |
ef1a-c+ |
translatsiooni elongatsiooni faktor EF-1 geen |
kõrge |
2. reguleeritavad promootorid (vt. tabel 12)
Geeni nmt1+ promootor oli esimene poolduva pärmi reguleeritav promootor mis kirjeldati 1990. a. ja on siiani kõige enam kasutatud. nmt1+ promootor on represseeritud tiamiini (vitamiin B1) poolt. Promootori induktsiooniks on vaja tiamiin söötmest eemaldada. Selleks pestakse rakke kas steriilse veega või tiamiin mittesisaldava söötmega. Induktsioon võtab aega 16-20 tundi. Aeglase induktsiooni põhjustab rakusisese tiamiini aeglane omastamine. Promootori aktiivsust saab reguleerida ka erineva tiamiini konsentratsiooniga söötmes. nmt1+ promootor töötab vaid miinimumsöötmes. Rikka söötme koostises olev pärmi ekstrakt sisaldab piisaval hulgal tiamiini, et promootorit represseerida. Mutatsioonid nmt1+ promootori TATA järjestus põhjustavad promootori aktiivsuse muutumist. Nii on eraldatud kaks erineva tugevusega promootori varainti - nmt41 on keskmise tugevusega promootor (25x induktsioon), nmt81 on nõrk promootor (7x induktsioon). Kuigi tiamiin represseerib metsiktüüpi nmt1+ promootorit ligikaudu 100x, ei ole see piisav promootori täielikuks "kinni panekuks". Seega on võimalik komplementeerida ka mõningate geenide deletsioone tiamiini juuresolekul.
nmt1+ ekspressioonisüsteemi eelised:
- on olemas ekspressiooniplasmiidid ja integreerimisvektorid, mistõttu on võimalik kiiresti konstrueerida vajalik tüvi või plasmiid;
- on võimalik kasutada erineva tugevusega nmt promootori variante, promootori aktiivsust on võimalik reguleerida ka tiamiini kontsentratsiooniga söötmes;
- promootorit ei ole võimalik täielikult "kinni panna".
nmt1+ ekspressioonisüsteemi puudused:
- ekspressiooni induktsiooniks on vaja tiamiin söötmest eemaldada;
- ekspressiooni induktsioon on väga aeglane (ligikaudu 5-6 põlvkonda);
- reeglina ei saa kasutada rikast söödet, sest see sisaldab tiamiini;
- promootorit ei ole võimalik täielikult "kinni panna".
Tabel 12. Poolduvas pärmis kasutatavad reguleeritavad promootorid.
Promootor |
Päritolu |
Regulatsioon |
Induktsiooni aeg |
Eripära |
muudetud CaMV35S |
lillkapsa mosaiigiviiruse 35S promootor millele on lisatud Tet repressori seostumise järjestused |
tetratsükliini poolt indutseeritav | 6-12 tundi |
400 x induktsioon |
ctr4+-CYC1 |
pagaripärmi tsütokroom C CYC1 promootorile on lisatud vase transporteri geeni ctr4+ promootoris olevad regulaatorjärjestused |
CuSO4 poolt represseeritud | 3 tundi | |
fbp1+ |
fruktoos-1,6-bisfosfataasi geeni promootor |
glükoosi poolt represseeritud |
7.5 tundi |
promootor derepresseerub statsionaarse faasi rakkudes |
hsp16+ |
kuumašoki valgu Hsp16 promootor |
idutseeritav kuumašoki, etanooli ja oksüdatiivse stressi poolt |
3 tundi |
promootor derepresseerub statsionaarse faasi rakkudes |
inv1+ |
invertaasi promootor |
glükoosi poolt represseeritud |
1 tund |
ekspressioon ei ole ajas stabiilne |
nmt1+ |
"no message in thiamine" promootor |
tiamiini poolt represseeritud |
16 tundi |
nmt1+ - tugev (300x induktsioon); nmt41 keskmise tugevusega (25x induktsioon); nmt81 - nõrk (7x induktsioon) |
nmt185 |
lühendatud nmt1 promootor |
tiamiini poolt represseeritud, 36oC juures represseeritud, 25oC juures indutseeritud |
3 tundi |
|
urg1+ |
GTP tsüklohüdrolaas |
uratsiili poolt indutseeritav |
0,5 tundi |