Plasmiidi integratsioon markergeeni lookusesse
Mõnikord ei ole võimalik kasutada geeni enda lookust, et sinna sisestada DNA järjestusi. Sellisel juhul kasutatakse plasmiidi integratsiooni markergeeni lookusesse. Kasutatakse süstik-vektoreid, mida nimetatakse integreeritavad plasmiidid. Need süstik-vektorid sisaldavad bakteri replikatsiooni alguspunkti ori, bakteri selektsioonimarkerit, polülinkerit ja pärmi selektsioonimarkerit. Integreeritavates plasmiidides puudub pärmi replikatsiooni alguspunkti. Uuritav järjestus kloonitakse plasmiidi polülinkerisse.
Plasmiidid integreeruvad pärmigenoomi kasutades homoloogilist rekombinatsiooni (Joonis 11). Integratsiooni koha määrab plasmiidis olev selektsioonimarker. Pärmigenoomi integreerub kogu plasmiid, ka bakteriaalsed järjestused ja bakteris töötav selektsioonimarker. Kasutama peab vastavaid auksotroofseid mutatsioone sisaldavaid pärmitüvesid. Näiteks kui soovitakse integreerida URA3 lookusesse, peab pärmigenoomis olema ura3-52 mutatsioon. Samuti, LEU2 lookusesse integratsioonil kasutatakse leu2-3,112 mutanti. Plasmiidi lineariseerimine tõstab integratsiooni efektiivsust umbes 100 korda.
Joonis 11. Plasmiidi integratsioon markergeeni lookusesse. ori, bakteri replikatsiooni alguspunkt; AmpR, bakteri selektsioonimarker.