Mutantide kasutamine GAL struktuursete geenide regulatsiooni uurimisel
Üksteisega mitteseotud GAL struktuursete geenide ekspresioon allub ühtsele regulatsioonile. Kui kasvukeskkonnas puudub galaktoos, siis neid geene ei ekspresseerita. Kui kasvukeskonnas on galaktoos, siis nende geenide ekspressioon on tugevalt indutseeritud. Üheks selliseks geeniks on GAL1, mis kodeerib galaktoosi metabolismiraja esimest ensüümi - galaktokinaasi. Mutandid, kus gal1 on defektne, ei ole võimelised kasvama söötmes kus süsiniku allikaks on galaktoos, sest galaktokinaasi ei ekspresseerita. Metsiktüüpi GAL1 geeni omavates rakkudes galaktoosi sisaldavas söötmes galaktokinaas ekspresseerub ning need rakud on võimelised kasutama galaktoosi süsiniku allikana.
GAL geenide regulatsiooni geneetiliseks uurimiseks on vajalik eraldada mutandid, kus kõikide GAL struktuursete geenide koordineeritud ekspressioon on muutunud.
1. gal4 mutant - GAL struktuursete geenide ekspressiooni ei idutseerita galaktoosi poolt.
Nii gal4 kui ka gal1 mutantidel on sama fenotüüp - mutandid ei suuda kasutada galaktoosi süsiniku allikana, sest GAL struktuurseid geene ei ekspresseerita. Kasutades tetraadide analüüsi on võimalik neid mutatsioone eristada:
Ristamine GAL1 gal4 X gal1 GAL4 annab järgmised tetraadide tüübid kui analüüsida galaktokinaasi ekspressiooni galaktoosi sisaldaval söötmel:
| Tüüp 1 (vanemtüüp) |
Tüüp 2 (tetratüüp) | Tüüp 3 (mittevanemtüüp) |
| puudub | puudub | puudub |
| puudub | puudub | puudub |
| puudub | puudub | ekspresseerub (metsiktüüp) |
| puudub | ekspresseerub (metsiktüüp) |
ekspresseerub (metsiktüüp) |
Mittevanemtüüpi ja tetratüüpi tetraadide teke näitab, et gal1 ja gal4 mutatsioonid asuvad erinevates geenides. Ristamine GAL4 X gal4 annab tulemuseks heterosügootse diploidi GAL4 gal4. Nende rakkude analüüs näitab, et galaktokinaasi ekspressioon toimub sarnaselt metsiktüüpi rakkudele. Seega on gal4 mutatsioon retsessiivne ning Gal4 on GAL geenide ekspressiooni regulatsioonis positiivne regulaator.
2. gal80 mutant - GAL struktuurseid geene ekspresseeritakse konstitutiivselt.
On teada, et GAL80 ei pärandu koos GAL4-ga ja GAL struktuursete geenidega. Ristamine GAL80 X gal80 annab diploidi, kus GAL struktuursete geenide regulatsioon on normaalne. Seega on ka gal80 retsessiivne mutatsioon. Kõike seda arvesse võttes selgub, et Gal80 reguleerib negatiivselt GAL geenide ekspressiooni.
Meil on teada kaks GAL struktuursete geenide regulaatorit. Eeldades et need regulaatorid töötavad üksteise järel, saame välja pakkude kaks mudeli varianti:
Nende variantide kontrollimiseks tuleks analüüsida gal4 gal80 kaksikmutandi fenotüüpi. Ristamine gal4 GAL80 X GAL4 gal80 annab järgmised tetraadide tüübid (analüüsiti galaktoosi võimet indutseerida GAL struktuursete geenide ekspressiooni):
|
Tüüp 1 (vanemtüüp)
|
Tüüp 2 (tetratüüp) | Tüüp 3 (mittevanemtüüp) |
| mitteindutseeritud | mitteindutseeritud | mitteindutseeritud |
| mitteindutseeritud | mitteindutseeritud | mitteindutseeritud |
| konstitutiivne | konstitutiivne | reguleeritud (metsiktüüp) |
| konstitutiivne | reguleeritud (metsiktüüp) |
reguleeritud (metsiktüüp) |
Tetraadide analüüs näitab, et gal4 gal80 kaksikmutandis on GAL struktuursed geenid mitteindutseeritavad (vt. mittevanemtüüpi tetraad). Seega on GAL struktuursete geenide regulatsiooni geneetiliseks mudeliks variant 1.