TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT Jenni Katri Pedor Bifunktsionaalsed streptavidiini teisendid: disain ja ekspressioon E. coli’s Bakalaureusetöö (12 EAP) Juhendajad prof. Ants Kurg, Ph.D Meelis Kolmer, Ph.D TARTU 2016 Sisukord SISUKORD ............................................................................................................................... 2 INFOLEHT ............................................................................................................................... 4 SISSEJUHATUS ....................................................................................................................... 5 1 KIRJANDUSE ÜLEVAADE ........................................................................................... 6 1.1 Streptavidiin ...................................................................................................................... 6 1.2 Biotiin ................................................................................................................................. 8 1.3 Streptavidiin-biotiin tehnoloogia rakendused ............................................................... 9 1.4 Bakteriorodopsiin ........................................................................................................... 10 1.5 Penetratiin ....................................................................................................................... 11 2 EKSPERIMENTAALNE OSA ..................................................................................... 13 2.1 Töö eesmärgid ................................................................................................................. 13 2.2 Materjal ja metoodika .................................................................................................... 13 2.2.1 Plasmiidid ............................................................................................................................................... 13 2.2.2 Bakteritüved ........................................................................................................................................... 13 2.2.3 Antibiootikumid ..................................................................................................................................... 13 2.2.5 Konstruktide disainimine ...................................................................................................................... 13 2.2.6 Oligonuleotiidsed praimerid ................................................................................................................. 14 2.2.7 PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) ...................................................................................................... 15 2.2.8 DNA kloonimine..................................................................................................................................... 16 2.2.9 Valkude ekspressiooni optimeerimine ................................................................................................. 17 2.2.10 Rekombinantse valgu ekspressioon bakterirakus ............................................................................. 18 2.2.11 Rekombinantsete valkude analüüs ..................................................................................................... 18 2.3 Tulemused ja arutelu ..................................................................................................... 20 2.3.1 Konstruktide disain ............................................................................................................................... 20 2.3.2 Valkude ekspressiooni optimeerimine ja valkude ekspressioon ........................................................ 22 2.3.3 Valkude puhastamine ............................................................................................................................ 23 2 2.3.4 Elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs ........................................................................................... 25 KOKKUVÕTE ....................................................................................................................... 28 SUMMARY ............................................................................................................................. 29 TÄNUAVALDUSED .............................................................................................................. 30 KASUTATUD KIRJANDUS ................................................................................................. 31 LISAD ...................................................................................................................................... 35 3 Infoleht Bifunktsionaalsed streptavidiini teisendid: disain ja ekspressioon E. coli’s Käesolevas bakalaureusetöös disainiti ja toodeti rekombinatseid valke, mis võimaldavad kinnitada märgistatud bioloogilisi märklaudmolekule nii raku membraani kui tuuma ja tsütoplasmasse. Märklaudmolekulide sidumiseks kasutati streptavidiini teisendeid: tetrameere moodustavat streptavidiini ja kimäärset monomeerset streptavidiini. Raku membraani külge kinnituvaks domeeniks valiti bakteriorodopsiini modifitseeritud C-heeliks ning rekombinantse valgu lokaliseerimiseks raku tuuma ja tsütoplasmasse valiti penetratiin. E. coli’s ekspresseerusid C-heeliksist ja kimäärsest monomeersest streptavidiinist koosnev rekombinantne valk ning penetratiinist ja streptavidiinist koosnev rekombinantne valk. Penetratiinist ja streptavidiinist koosnev rekombinantne valk moodustas tetrameere ja sidus biotiini. T490 Biotehnoloogia Märksõnad: streptavidiin; biotiin; penetratiin; bakteriorodopsiin Bifunctional streptavidin’s derivatives: design and expression in E. coli The aim of this study was to design and produce recombinant proteins with two functional domains. One domain would bind labelled macromolecules and the other would target the protein to specific cellular compartments. A derivative of wild type streptavidin and an artificial chimeric streptavidin monomer, were used as a binding domains. Bacteriorhodopsin’s modified C-helix was used to anchor the protein into cell membrane. A cell penetrating peptide penetratin was used for protein localization to cytoplasm and nucleus. Recombinant proteins penetratin-streptavidin and C-helix-monomeric streptavidin were successfully expressed in E. coli. Recombinant protein penetratin-streptavidin formed tetramers and was able to bind biotin. T490 Biotechnology Key words: streptavidin; biotin; penetratin; bacteriorhodopsin 4 Sissejuhatus Tänapäeval kasutatakse immunohistokeemilisi analüüse laialdaselt nii teaduses kui ka kliinilises diagnostikas. Immunohistokeemiliste analüüside üheks väljundiks on erinevate makromolekulide asukoha kindlakstegemine rakkudes ja kudedes. Vaatamata antud analüüside ulatuslikule kasutusele puuduvad universaalsed standardid nende tõlgendamiseks ja kvantifitseerimiseks. Seetõttu on eri aegadel ja eri laborites saadud tulemuste võrreldavus raskendatud. Eriti suuri probleeme võib see tekitada kliinilises diagnostikas, kus ravi sõltub tihti immunohistokeemilise analüüsi tulemusest. Immunohistokeemiliste analüüside usaldusväärsuse tõstmise ja tulemuste võrreldavaks muutmise üheks võimaluseks on välja töötada kvantifitseeritavad standardid. Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli disainida ja toota rekombinantseid valke, mis in vitro seonduksid rakkudega ja suudaksid universaalselt ning tugeva spetsiifikaga siduda märgistatud bioloogilisi märklaudmolekule. Sooviti, et disainitud rekombinantsete valkude kinnitumine raku pinnale või sisenemine ja paiknemine raku sees oleksid võimaluse korral kontrollitavad. Käesolev bakalaureusetöö on kirjutatud Tartu Ülikooli bioloogia õppekava raames, spetsialiseerudes molekulaar- ja rakubioloogia valdkonnale. Kõik töös teostatud eksperimentaalsed katsed viidi läbi ettevõttes Estigen OÜ või Estigen America LLC. 5 1 Kirjanduse ülevaade 1.1 Streptavidiin Streptavidiin on ~ 56 kDa suurune valk, mida sekreteerib Streptomyces avidinii (Dundas et al., 2013). Streptavidiin kuulub avidiinide/streptavidiinide perekonda. Streptavidiin on kana munavalgest leitud avidiini struktuurne ja funktsionaalne analoog. Looduslikus peremehes lõigatakse streptavidiinil sekreteerimise käigus ära N-terminusest signaalpeptiid (UniProt: P22629). Antud valk paistab teiste valkude seast välja oma erakordse omadusega siduda väga kõrge afiinsusega väikest vitamiini biotiin (Kd≈ 10 –14–10–16 M) (Määttä, 2010). Lisaks sellele on streptavidiin ka suhteliselt termostabiilne, peab hästi vastu denaturantidele, kõrgetele ja madalatele pH väärtustele ning mõningatele proteolüütilistele ensüümidele. Tänu nendele omadustele saab streptavidiini kasutada väga paljudes erinevates rakendustes (Dundas et al., 2013). Streptavidiini biofunktsioon ei ole teada, kuid arvatakse, et see takistab soovimatute mikroorganismide kasvu, sidudes keskkonnast kasvuks vajaliku biotiini (Määttä, 2010). Streptavidiini 3D struktuur tehti kindlaks 1980ndate lõpul (Hendrickson et al., 1989; Weber et al., 1989). Streptavidiin on tetrameerne valk, mis moodustub neljast identsest β-tünnist, mis omakorda koosnevad kaheksast anti-paralleelsest β-lehest ja neid ühendavatest aasadest (Hendrickson et al., 1989). Biotiini seondumiskohad asuvad iga β-tünni ühes otsas, seega saab iga streptavidiini molekuliga seonduda 4 biotiini molekuli (Green, 1975). Streptavidiini ja biotiini vaheline side on üks tugevaim teadaolev mittekovalentne looduses esinev side valgu ja ligandi vahel (Green, 1975). Tugeva seondumise biotiiniga tagab mitu erinevat faktorit. Esiteks biotiini seondumiskohas paiknevad hüdrofiilsed aminohapped, mille abil moodustatakse vesiniksidemed ligandi ja valgu vahel (Weber et al., 1989). Teiseks toimuvad pärast biotiini seondumist streptavidiini tertsiaalses ja kvaternaarses struktuuris muutused, näiteks toimub ligandi seondumisel streptavidiini tihedam kokku pakkimine (Williams et al., 2003). Biotiini seondumiskoha moodustumisel osalevad ka naaber alaühikud, kus koostööd teevad esimene ja teine ning kolmas ja neljas alaühik (alaühikute nummerdus vastavalt artiklist Livnah et al., 1993). Seetõttu võib streptavidiini struktuurselt käsitleda kui kahest erinevast funktsionaalsest dimeerist koosnevat dimeeri (Laitinen et al., 2006). Streptavidiini teisendid. Teaduslikust huvist ja uute rakenduste väljatöötamiseks on valmistatud palju erinevaid streptavidiini teisendeid (Laitinen et al., 2006). Seda on võimaldanud streptavidiini omadus taluda ulatuslikke mutatsioone kaotamata oma funktsionaalsust (Dundas et al., 2013). Streptavidiini teisendeid võib jagada järgnevalt: 6 biotiini seondusmiskoha mutandid, alaühikute vaheliste liideste mutatsioonid, topoloogilised modifikatsioonid ja streptavidiiniga rekombinantsete valkude moodustamine (Sano et al., 1998). Biotiini seondusmiskoha mutandid. Tekitades mutatsioone biotiini seondumiskohta on tulemuseks mutandid, mis omavad biotiini suhtes väiksemat afiinsust või seondumisreaktsioon on pöörduv (Wilchek ja Bayer, 1999). Nõrgem seondumine on saavutatav ka kasutades biotiini derivaate, nt pH sõltuv interaktsioon 2-iminobiotiiniga (Orr, 1981). Sellist omadust saab ära kasutada märgistatud ühendite puhastamisel (Laitinen et al., 2006). Alaühikute vaheliste liideste mutatsioonid. Alaühikute vaheliste liideste mutatsioonide abil on disainitud streptavidiinist nii monomeerseid kui dimeerseid vorme ning loodud ka stabiilsema kvaternaarse struktuuriga streptavidiine. Mono- ja dimeerseid vorme saab näiteks kasutada valkude puhastamisel. Stabiilsem streptavidiin leiab kasutust ekstreemset stabiilsust vajavates rakendustes (Laitinen et al., 2006). Topoloogilised modifikatsioonid. Topoloogiliste modifikatsioonide korral säilib valgu 3D struktuur sarnase kujuga. Sel viisil on võimalik disainida streptavidiin, mis omab väiksemat afiinsust biotiini suhtes, ning siduda streptavidiiniga erinevaid peptiide ja omavahel erinevate omadustega alaüksusi (Laitinen et al., 2006). Streptavidiiniga rekombinantsete valkude moodustamine. Rekombinantne liitvalk, kus üheks komponendiks on streptavidiin ja teiseks partnervalk, omab kahte iseseisvat funktsiooni. Üks funktsioon tuleneb streptavidiini domeenist ja teine partnervalgu domeenist. Rekombinatsete streptavidiini valkude puhul on toodetud valgupartii (batch) oma koostiselt homogeenne võrreldes valgupartiiga, mis on toodetud keemilisel konjugeerimisel (Sano et al., 1998). Näiteid streptavidiini teisenditest. Metsiktüüpi streptavidiinil on neli võimalikku seondumiskohta biotinüleeritud ligandidele. Ligandid võivad omavahel agregeeruda, kuna paiknevad lähestikku. Agregeerumine viib tihti ühendi bioloogilise funktsiooni muutuseni ja seega võib tekkida artefakt, mis annab väära katse tulemuse. Töötades elusrakkudega eelistatakse kasutada väiksema funktsionaalsete seondumiskohtade arvuga streptavidiini vorme. Nii välditakse streptavidiiniga seonduvate ligandide agregeerumist (Dundas et al., 2013). Monovalentne tetrameerne streptavidiin. Üheks väiksema funktsionaalsete seondumiskohtade arvuga streptavidiini vormiks on monovalentne streptavidiini tetrameer. 7 Antud tetrameer sisaldab kolme inaktiveeritud seondumiskohta ja ühte aktiivset metsiktüüpi seondumiskohta (Howarth et al., 2006). Monovalentne monomeerne streptavidiin. Alternatiiviks monovalentsele tetrameersele streptavidiinile on välja töötatud ka monovalentne monomeerne streptavidiin, mis vastab tetrameerse streptavidiini ühele alaühikule ja seega seob endaga ühe biotiini või biotinüleeritud ligandi. Monomeeri suurus on ~ 25% tetrameerist ning tänu oma väikestele mõõtmetele võimaldab antud molekul paremat in vivo ligipääsu kudedesse. Monomeeri negatiivseks küljeks on tema ebastabiilsus (Dundas et al., 2013). Selle probleemi üheks lahenduseks töötati välja stabiilsem kimäärne monomeer (Kd= 3 x 10 -9 M ) kasutades rizavidiini (rhizavidin) ja streptavidiini konserveerunud aminohapete järjestusi. Rizavidiin, mida toodab bakter Rhizobium etli, on biotiini siduv looduslik dimeer, kus naaber alaühikud ei oma kriitilist rolli seondumiskoha moodustumisel (Lim et al., 2013). Tänu oma stabiilsusele ja lahustuvusele sobib rizavidiini ja streptavidiini monomeerne kimäär paremini biokeemiliste katsete läbiviimiseks ja rakkude märgistamiseks kui monomeerne streptavidiin (Dundas et al., 2013). 1.2 Biotiin Biotiin (vitamiin B7, vitamiin H) on väike vesilahustuv molekul, mida sünteesivad enamik mikroobe, taimi ja seeni, kuid biotiini vajavad kõik eluvormid (Määttä, 2010; D. Mock, 1996). Biotiini olulisus meie dieedis tehti kindlaks 20. sajandi esimeses pooles (Finkenwirth et al., 2014). Biotiin isoleeriti esmakordselt munavalgest 1936. aastal (Kögl ja Tönnis, 1936). Biotiin koosneb ureido- (tetrahydroimidazolidone) ja tetrahüdrotiofaan (tetrahydrothiophene) ringist, mis on omavahel külgepidi seotud, ning viimase küljes olevast paldrerjan- ehk pentaanhappejäägist (valeric acid). Tugeva sideme moodustamiseks streptavidiiniga on oluline just ureido ring (Määttä, 2010). Biotiini tuntuimaks bioloogiliseks funktsiooniks on toimida karboksülaaside koensüümina. Selle kaudu osaleb biotiin glükoneogeneesis, rasvhapete sünteesis, aminohapete katabolismis ning energia transduktsioonis (Knowles, 1989). Biotiin on oluline ka rakusignalisatsioonis ja geenide epigeneetilises regulatsioonis. Kromatiini struktuuris esineb biotiini histoonide koosseisus (Zempleni, 2005). Biotiini analoogid. Biotiini ja biotiini analooge kasutatakse laialdaselt streptavidiin-biotiin tehnoloogias. Enim rakendust leiavad biotiini analoogid, millel on modifitseeritud karboksüülrühm palderjanhappejäägis. Need analoogid võimaldavad biotiinile lisada soovitud ühendeid nii, et afiinsus streptavidiini suhtes säilib (Määttä, 2010). 8 Biotinüleerimine. Biotinülatsioon on erinevate ühendite sidumine biotiiniga (Kay et al., 2009). Biotinülatsioon jaguneb ensümaatiliseks ja keemiliseks (Dundas et al., 2013). Ensümaatilne biotinülatsioon võimaldab nii in vivo kui in vitro valke biotiiniga märgistada. Selleks viiakse vastava valgu nukleotiidsesse järjestusse spetsiifilise peptiidi AviTag nukleotiidne järjestus. Vastava aminohappelise järjestuse tunneb ära biotiini ligaas BirA. BirA seob biotiini kovalentselt AviTag järjestuses oleva lüsiinijäägiga (Kay et al., 2009). Kasutades ensümaatilist biotinülatsiooni saab detekteerida näiteks nõrkasid valk-valk seoseid ensüümi ja märklaudvalgu vahel, uurida post-translatsioonilisi modifikatsioone, valk-RNA ja valk-DNA vahelisi seoseid (Dundas et al., 2013). Keemiline biotinülatsioon võimaldab in vitro keemiliste reagentide abil modifitseerida valke biotiiniga. Keemiline biotiini liitmine valguga toimub tingimustes, mis ei mõjuta valgu stabiilsust, 3D struktuuri ega funktsiooni. Antud protsess ei võimalda kontrollida valguga seonduva biotiini hulka. Kuna biotiini seondumine valguga on tihti vahendatud lüsiinijäägi kaudu võib biotiini seondumine teatud lüsiinijääkide külge viia ligandi seondumiskoha inaktivatsioonini (Kay et al., 2009). 1.3 Streptavidiin-biotiin tehnoloogia rakendused Streptavidiin-biotiin kompleks on teadlaste tähelepanu köitnud kahel järgneval põhjusel. Esiteks kujutavad need kaks molekuli huvitavat mudelsüsteemi, kus väga stabiilne oligomeerne valk omab kõrget afiinsust väikese ligandi suhtes. Teiseks streptavidiini ja biotiini vahelist interaktsiooni on võimalik ära kasutada paljudes erinevates bioteaduste rakendustes (Wilchek ja Bayer, 1990; Wilchek ja Bayer, 1988; Kuntz et al., 1999). Rakendusi, mis põhinevad streptavidiini kõrgel afiinsusel biotiini suhtes, nimetatakse üldiselt streptavidiin-biotiin tehnoloogiaks (Määttä, 2010). Streptavidiin-biotiin tehnoloogia rakendusi võib kategoriseerida järgnevalt: puhastamine, lokalisatsioon, diagnostika, ravimite suunatud edastamine ja nanotehnoloogia. Puhastamine. Puhastamine ehk antud juhul molekulide eraldamine afiinsuskromatograafia abil põhineb streptavidiini või biotiiniga seotud kandjatel (immobiliseeritud faas). Biotiini kolonne kasutatakse avidiini, streptavidiini ja biotiini vastaste antikehade eraldamiseks. Biotinüleeritud valkude ja/või nende retseptorite eraldamiseks saab kasutada streptavidiini kolonne (Wilchek ja Bayer, 1988). Lokalisatsioon. Lokalisatsioon hõlmab endas näiteks makromolekulide asukoha määramist rakkudes ja kudedes. Antud molekulide detekteerimine põhineb bioloogiliselt aktiivsete 9 ühendite biotinüleerimisel. Biotinüleeritud ühendi asukoht tehakse kindlaks streptavidiiniga konjugeeritud markeri abil (Wilchek ja Bayer, 1988). Diagnostika. Diagnostika alla kuuluvad näiteks streptavidiin-biotiin tehnoloogial põhinevad immunoloogilised analüüsid ja geeni sondid. Immunoloogiliste analüüside korral kasutatakse signaali võimendamiseks antigeeniga seonduvat biotinüleeritud antikeha, mille külge seondub, kas streptavidiiniga konjugeeritud sond või streptavidiin ja biotinüleeritud sond. Geeni sondide puhul märgistatakse proov biotiiniga ning detekteeritakse sobiva streptavidiini konjugaadiga (Wilchek ja Bayer, 1988). Ravimite suunatud edastamine. Streptavidiin-biotiin tehnoloogia võimaldab targeting- antikehade ja terapeutiliste molekulide teineteisest sõltumatut annustamist, vähendades seeläbi ravimidoosi normaalses koes, võrreldes traditsioonilise immunoteraapiaga. Kohalik streptavidiini geenisiire spetsiifilistesse kudedesse võimaldab oluliselt suurendada biotiiniga märgistatud terapeutiliste molekulide lokaalset kontsentratsiooni, aga samuti ka viiruspõhiste geeniteraapiavektorite suunatud kasutamist (Lesch et al., 2010). Nanotehnoloogia. Streptavidiin-biotiin tehnoloogiat on kasutatud koos kvanttäppidega in vivo üksiku molekuli tuvastamiseks rakus. Kvanttäpid on nanomõõtmetes kristallid, mida kasutatakse fluorofooridena. Selle meetodi puhul on kvanttäpid seotud streptavidiiniga, mis seondub biotinüleeritud valguga (Howarth et al., 2008). Streptavidiin-biotiin tehnoloogia kaks suurt eelist on biotinülatsiooni minimaalne mõju bioloogiliselt aktiivsete ühendite aktiivsusele ning streptavidiini ja biotiini vahelisest kõrgest afiinsusest tulenev spetsiifiline seondumine (Wilchek ja Bayer, 1988). 1.4 Bakteriorodopsiin Bakteriorodopsiin on 24 kD suurune transmembraanne valk Halobacterium salinariumi purpurses membraanis (Grigorieff et al., 1996). Bakteriorodopsiin kuulub mikroobsete rodopsiinide ehk tüüp-I rodopsiinide ülemperekonda. Mikroobsed rodopsiinid avastati 1970ndatel aastatel. Neist esimene ja kõige paremini uuritud on bakteriorodopsiin (Oesterhelt ja Stoeckenius, 1973). Mikroobsed rodopsiinid on valgust opsiin ja kromofoorist retinaal koosnevad fotoretseptorid (Ernst et al., 2014). Kokkupuutel valgusega põhjustab kromofoor molekulis konformatsioonilise muutuse (Bye et al., 2013). Purpurne membraan on oma nimetuse saanud bakteriorodopsiinis peituva kromofoori retinaal järgi (Oesterhelt ja Stoeckenius, 1971). 10 Bakteriorodopsiin kujutab endast valgusenergia arvel töötavat prooton pumpa (Oesterhelt ja Stoeckenius, 1973). Antud prooton pump koosneb kolmest üksteise suhtes 120 kraadi võrra pööratud identsest valgust (homotrimeer). Iga alaühik koosneb seitsmest transmembraansest α-heeliksist ja nende vahel olevast retinaali molekulist (Luecke et al., 1999). Membraani läbivad α-heeliksid on kokkuleppeliselt tähistatud alfabeetiliselt A-G alustades valgu N- terminusest (Ernst et al., 2014). Tänu oma lihtsale tööpõhimõttele kasutatakse bakteriorodopsiini raku tasemel transpordi mehhanismide hüpoteeside ja uute eksperimentaalsete tehnoloogiate testimiseks (Lanyi, 2004). Bakteriorodopsiini C-heeliks. Bakteriorodopsiini seitsmest α-heeliksist kuus suudavad iseseisvalt sünteesituna membraani siseneda. Neist kuuest α-heeliksist on enim edasi uuritud bakteriorodopsiini kolmandat ehk C-heeliksit. C-heeliks on 4 kDa suurune polüpeptiid, mis suudab spontaanselt siseneda fosfobilipiid kihti. Tema üheks oluliseks omaduseks on pH sõltuv insertsioon membraani, kusjuures sisenemine fosfobilipiid kihti toimub happelise pH juures (Hunt et al., 1997). 1.5 Penetratiin Penetratiin on Drosophila melanogaster’i Antennapedia homeovalgu homeodomeenist pärit 16-st aminohappejäägist koosnev peptiid, mis kuulub rakku sisenevate peptiidide (cell penetrating peptides) hulka (Dupont et al., 2011). Homeovalgud sisaldavad DNA-ga seonduvat homeodomeeni. Homeodomeen on konserveerunud homeovalkude rühmas nii liigi siseselt kui taksonite lõikes. Homeodomeen koosneb kolmest α-heeliksist, kus põhiliselt viimane heeliks osaleb märklaud-DNA äratundmises (Gehring et al., 1994). Penetratiini võime siseneda iseseisvalt rakku avastati juhuslikult 1990ndate esimeses pooles, tehes katseid elus neuronitega (Joliot et al., 1991). Rakusiseselt paikneb penetratiin nii tsütoplasmas kui ka tuumas (Derossi et al., 1994). Penetratiini translokalisatsiooni mehhanismi on küll uuritud, kuid ei mõisteta veel täielikult (Dupont et al., 2011). Katsed on näidanud, et penetratiin võib siseneda elusrakku nii endotsütoosi kui ka otsese translokalisatsiooni kaudu (Dupont et al., 2011). Raku pinnal paiknevad komplekssed suhkrud võivad põhjustada penetratiini agregeerumist ja seeläbi indutseerida endotsütoosi (Ghibaudi et al., 2005). Samas võivad need suhkrud põhjustada penetratiini kontsentratsiooni tõusu membraani läheduses ja soodustada peptiidi interaktsiooni fosfolipiididega ning kutsuda esile translokalisatsiooni (Dupont et al., 2011). 11 Penetratiini rakendus. Rakku sisenevate peptiidide, sh penetratiini, abil saab elusrakkudesse transportida peptiide, valke, antisens-oligonukleotiide, siRNAd, dsDNAd, nanopartikkleid ja liposoome (Bechara ja Sagan, 2013). 12 2 Eksperimentaalne osa 2.1 Töö eesmärgid Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli disainida ja toota rekombinantseid valke, mis omaksid kahte domeeni, millest üks võimaldaks rekombinantse valgu paiknemise raku erinevatesse osistesse ja teine bioloogiliste märklaudmolekulide seondumise. Ühtlasi sooviti, et võimaluse korral oleks disainitud rekombinantse valgu hulk ja paiknemine nii raku pinnal kui raku sees kontrollitavad. Antud bakalaureusetöö eesmärgid olid järgnevad: 1. Konstrueerida rekombinantsed valgud 2. Transformeerida konstrueeritud valkude nukleotiidne järjestus E. coli’sse 3. Testida, milline rekombinantne valk ekspresseerub 4. Optimeerida rekombinantsete valkude ekspressiooni tingimusi 5. Puhastada saadud rekombinantsed valgud 2.2 Materjal ja metoodika 2.2.1 Plasmiidid Töös kasutati järgnevaid plasmiidseid vektoreid: pET SUMO (Thermo Fisher Scientific Inc.), mis sisaldas kanamütsiini-resistentsus geeni, pET-11a (EMD Millipore Corp.), mis sisaldas ampitsilliini-resistentsus geeni. 2.2.2 Bakteritüved Töös kasutati E. coli kloneerimistüve JM109 (Promega Corp.). Konstrueeritud rekombinantsete valkude ekspressiooniks kasutati E. coli tüvesid BL21(DE3)pLysS (Promega Corp.) ja BL21(DE3)pLysE (Sigma-Aldrich Co. LLC.), millest mõlemad sisaldasid klooramfenikooli-resistentsus geeni. 2.2.3 Antibiootikumid Töös kasutatud antibiootikumide lõpp-kontsentratsioonid: ampitsilliin, 100 μg/ml; klooramfenikool, 34 μg/ml; kanamütsiin, 50 μg/ml. 2.2.5 Konstruktide disainimine Kõik konstruktide disainimise etepid (järjestuste homoloogia võrdlus, DNA translatsioon, pööratud komplemendi koostamine, restriktsioon analüüsi planeerimine) viidi läbi kasutades internetipõhiseid programme (tabel 1, lisa 1). Töös kasutatud bakteriorodopsiini 13 modifitseeritud C-heeliksi järjestus vastab varem kirjanduses avaldatud järjestusele (Hunt et al., 1997). Kasutatud streptavidiini järjestus vastab Streptomyces avidinii streptavidiini valgu aminohapetele 25-183 (UniProt: P22629) ning kimäärse monomeerse streptavidiini (mSA) järjestus vastab varem kirjanduses avaldatud järjestusele (Lim et al., 2013). Töös kasutatud penetratiini järjestus vastab Drosophila melanogaster’i Antennapedia homeodomeeni 339- 354 aminohappejäägile (UniProt: P02833) (Derossi et al., 1994). Kõik disainitud konstruktid telliti plasmiidses vektoris pUC 57 firmast GENEWIZ Inc. 2.2.6 Oligonuleotiidsed praimerid Töös kasutatud oligonukleotiidsed praimerid disainiti kasutades internetipõhiseid programme (tabel 1, lisa 1) ning telliti ettevõttest Metabion International AG (tabel 3). Tabel 3. NUMBER JÄRJESTUS 5’->3’ RAKENDUS 004 CGATCCCGCGAAATTAATACGAC Geneetiline sõelumine ja sekveneerimine 006 GGTGGTGAACAGAACCCGATTTACTGG Geneetiline sõelumine ja sekveneerimine 007 TTATTATTATTTCACTTTGGTAAAGGTATCCTGGCC Geneetiline sõelumine ja sekveneerimine 009 GTCCGGCGTAGAGGATCG Sekveneerimine 010 CGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC Geneetiline sõelumine ja sekveneerimine 011 ACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGG Sekveneerimine 012 AGATTCTTGTACGACGGTATTAG Geneetiline sõelumine ja sekveneerimine 013 ATTGGTGGTGGTGGTGAACAG Geneetiline sõelumine 14 2.2.7 PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) Kõik selles töös teostatud PCR-i reaktsioonid viidi läbi Aeris™ Aeris Thermal Cycler termotsükleris (Esco Micro Pte. Ltd.). Analüütiline PCR. Analüütiline koloonia PCR teostati positiivsete kolooniate selektsiooniks. PCR reaktsioonid teostati 20 µl kasutades FIREPol® DNA polümeraasi (5x FIREPol® Master Mix Ready to Load with 7,5 mM MgCl2, Solis BioDyne OÜ). Reaktsiooni segu sisaldas nii forward kui reverse praimerit kontsentratsioonil 150 nM. Valitud kolooniad siirdati reaktsiooni segusse. PCR-i programm: 1. 95°C 3min 2. 95°C 20sek 3. 51/56°C 20sek x35 4. 72°C 60sek 5. 72°C 7min 6. 4°C  Preparatiivne PCR. Preparatiivne PCR teostati konstruktide sekveneerimisel kasutatud matriits-DNA valmistamiseks ning SUMO liitvalgu kloneerimisel. Kloneeritud DNA järjestuse õigsust kontrolliti DNA primaarjärjestuse määramisega Eesti Biokeskse tuumiklaboris või asutuses Functional Biosciences, Inc. Nendes asutustes kasutati ka T7 praimereid konstruktide sekveneerimisel. PCR reaktsioonid teostati 20 µl kasutades FIREPol® DNA polümeraasi (5x FIREPol® Master Mix Ready to Load with 7,5 mM MgCl2, Solis BioDyne OÜ). Reaktsiooni segu sisaldas nii forward kui reverse praimerit kontsentratsioonil 150 nM ja matriits DNA-d kontsentratsioonil 0,01-10 ng/µl. 15 PCR-i programm: 1. 95°C 3min 2. 95°C 20sek 3. 51/56°C 20sek x20 4. 72°C 30sek 5. 72°C 7min 6. 4°C  2.2.8 DNA kloonimine Töö käigus teostatud DNA kontsentratsiooni mõõtmised viidi läbi spektrofotomeetriliselt (NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific Inc.). Miniprep’id ja midiprep’id. Plasmiidne DNA puhastati ning säilitati edasiste katsete jaoks DNA mini-ja midiprep’ide kujul. Selleks inokuleeriti 1 transformeeritud bakterirakkude koloonia LB plaadilt 2 ml LB/2xYT vedelsöötmesse miniprep’ide puhul. Midiprep’ide puhul inokuleeriti 50 ml LB/2xYT vedelsöödet eelkultuuriga kasutades 100x lahjendust. Vedelsöötmed sisaldasid sobivaid antibiootikume. Baktereid kasvatati üleöö 37°C juures loksutil 225 RPM. Miniprepp’ide valmistamiseks kasutati FavorPrep™Plasmid DNA Extraction MiniKiti (Favorgen Biotech Corp.) või QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN N.V.) komplekti. Midiprepp’ide valmistamiseks kasutati PureYield™Plasmid Midiprep System (Promega Corp.) komplekti või viidi läbi aluseline lüüs SDS-iga koos fenooli töötlusega vastavalt varasemalt kirjanduses kirjeldatule (Green ja Sambrook, 2012). DNA fragmentide puhastamine agaroos geelist. DNA fragmentide puhastamiseks agaroos geelist kasutati kommertsiaalset komplekti UltraClean® 15 DNA Purification Kit, järgides vastavat tootja protokolli (MO BIO Laboratories, Inc.). Preparatiivsete PCR-i fragmentide puhastamine. Preparatiivse PCR-i käigus saadud fragmendid puhastati PCR-i segust kasutades kommertsiaalset komplekti MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN N.V.). Bakterirakkude transformatsioon. Konstrukti sisaldav plasmiid pET-11a või pET SUMO transformeeriti E. coli BL21(DE3)pLysS või BL21(DE3)pLysE kompetentsetesse rakkudesse kasutades vastava tootja protokolli (Promega Corp., Sigma-Aldrich Co. LLC.). 16 Transformeeritud rakud külvati sobivaid antibiootikume sisaldavatele LB plaatidele. Rakke inkubeeriti 37°C juures üleöö. Restriktsioon analüüs ja agaroos geelekektroforees. Restriktsioon analüüsil kasutati FastDigest ensüüme NdeI ja BamHI (Thermo Fisher Scientific Inc.). Restrikteeritud DNA ja PCR fragmentide pikkust kontrolliti geelelektroforeesil. Geelelektrofrees teostati TAE (Naxo OÜ) puhvris 1,5% agaroosgeelil, kuhu oli lisatud etiidiumbromiid, 0,5 μg/ml. Markerina kasutati ZipRuler™ Express DNA Ladder Set, Ready to Use (Thermo Fisher Scientific Inc.). Geelelektroforeesi tulemused jäädvustati kasutades Molecular Imager® Gel Doc™ XR+ System (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Ligeerimine. Puhastatud DNA fragment sisestati NdeI-ga ja BamHI-ga lineariseeritud ja defosforüleeritud plasmiidi (FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase, Thermo Fisher Scientific Inc.), kasutades ensüümi T4 DNA Ligase (Thermo Fisher Scientific Inc.). Reaktsioon viidi läbi toetemperatuuril üleöö. T/A kloneerimine. SUMO liitvalku sisaldavad konstruktid valmistati kasutades T/A kloneerimist. DNA fragmendid amplifitseeriti PCR-i käigus. PCR fragmendid ligeeriti pET SUMO vektorisse kasutades ensüümi T4 DNA Ligase (Thermo Fisher Scientific Inc.), järgides valmistaja protokolli. Ligeerimine viidi läbi 4°C juures üleöö. 2.2.9 Valkude ekspressiooni optimeerimine Optimaalse valgu ekspressiooni saavutamiseks viidi läbi järgnevad katsed: teostati ekspressiooni ajaseeria, ekspressioon erinevatel temperatuuridel, ekspressioon erinevates E. coli tüvedes ning ekspressioon indutseeriti erinevatel IPTG kontsentratsioonidel. Ajaseeria. Antud katses hinnati valgu kontsentratsiooni erinevatel ajahetkedel pärast induktsiooni 1 mM IPTG-ga. Selleks võeti bakterikultuurist esimese, teise ja iga järgneva kahe tunni järel kaheksa tunni jooksul 100 μl proovi või võeti 100 μl proovi esimese, teise ja iga järgneva kahe tunni järel kuue tunni jooksul. Saadud proove analüüsiti valgu geelelektroforeesil nagu kirjeldatud allpool. Ekspressioon erinevatel temperatuuridel. Valgu ekspressioon viidi läbi 25°C, 30°C ja 37°C juures. Kõigil juhtudel kasvatati eelkultuur üles 37°C juures. Viimane arvestuslik bakterirakkude pooldumine enne indutseerimist teostati vastavalt 25°C, 30°C või 37°C juures. Seejärel indutseeriti valgu ekspressioon 1 mM IPTG-ga vastaval temperatuuril. 17 Ekspressioon erinevates E. coli tüvedes. Valke ekspresseeriti E. coli kahes erinevas ekspressioonitüves BL21(DE3)pLysS (Promega Corp.) ja BL21(DE3)pLysE (Sigma-Aldrich Co. LLC.). Induktsioon erinevatel IPTG kontsentratsioonidel. Valkude ekspressiooni induktsiooniks kasutati 0,5 mM ja 1mM IPTG-d. 2.2.10 Rekombinantse valgu ekspressioon bakterirakus Eelkultuuri valmistamiseks inokuleeriti transformeeritud bakterirakkude koloonia 2 ml LB/2xYT ja sobivat antibiootikumi sisaldavasse vedelsöötmesse ning kasvatati 37°C juures loksutil 225 RPM üleöö. Saadud eelkultuurist valmistati 100x lahjendus ning mõõdeti optiline tihedus 600 nm (OD600) juures spektrofotomeetriliselt (BioPhotometer, Eppendorf AG.). Seejärel inokuleeriti 100 ml LB/ 2xYT, 6 ml 1M glükoosi ja sobivaid antibiootikume sisaldavat vedelsöödet eelkultuuriga nii, et kultuuri arvestuslik optiline tihedus (OD600) oleks ≈0,1. Proov jagati kaheks (2 x 50ml) ning kasvatati 250 ml koonilises kolvis 37°C juures loksutil 225 RPM kuni OD600≈0,6. Indutseerimata kontrolliks võeti 100 μl rakukultuuri, fuugiti põhja 3 min 14800 RPM (MicroCL 21 R Centrifuge, Thermo Fisher Scientific Inc.) ning bakterimass säilitati -20°C. Valgu süntees indutseeriti 1 mM IPTG-ga. Rakke inkubeeriti 2 tundi 37°C juures loksutil 225 RPM. Seejärel võeti indutseeritud kontrolliks 100 μl rakukultuuri, fuugiti (MicroCL 21 R Centrifuge, Thermo Fisher Scientific Inc.) rakud põhja 14800 RPM ja säilitati -20°C juures. Allesjäänud rakud fuugiti põhja 4000 RPM 10 min (Centrifuge 5810R, rootor: A-4-62, Eppendorf AG.). Bakterimassi säilitati -20°C juures. 2.2.11 Rekombinantsete valkude analüüs Valgu geelelektroforees. Ekspresseeritud valke analüüsiti SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesil. Enne geelile kandmist töödeldi proove 95°C juures 5 min. Elektroforees viidi läbi kasutades kas nUView Tris-Glycine Precast Gel (NB, 4-8 %, NuSep Holdings Ltd.) või Horizontal Pre-Cast GeBAGel (8-16%, Gene Bio-Application Ltd.) polüakrüülamiid geeli vastavalt Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) või GeBARunner (Gene Bio-Application Ltd.) foreesi aparaadis. Molekulmassi markeriks oli nUView geelide korral PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc.) ja GeBAGel geelide puhul kasutati molekulmassi markerina Protein Ladder Blue Prestained (Naxo OÜ). GeBAGel geele värviti pärast foreesi Coomassie R-250-ga vastavalt varem avaldatud protokollile (Green ja Sambrook, 2012). nUView geelid ei vajanud lisavärvimist. Geeli pildid jäädvustati UV valguslaual Molecular Imager® Gel Doc™ XR+ System (Bio-Rad Laboratories, Inc.). 18 SUMO rekombinantse liitvalgu puhastamine. SUMO, C-heeliksit ja mSA-d sisaldav liitvalk puhastati kasutades alljärgnevat protokolli. Valgu ekspressioonist saadud sade pesti 5 ml 0°C pesupuhvriga (100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl, pH=8,0). Seejärel teostati fuugimine 4000 RPM 5 min (Centrifuge 5810R, rootor: A-4-62, Eppendorf AG.). Saadud rakkude sade lüüsiti 4 ml lüüsipuhvris (2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 30 mM TrisHCl, pH=8,0) ning igasse proovi lisati eraldi 20 μl PIC, vastavalt tootja protokollile (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich Co. LLC.) ja 50 μg/ml lüsosüümi (Thermo Fisher Scientific Inc.). Proovi inkubeeriti toatemperatuuril 15-20 min aeg-ajalt õrnalt loksutades. Seejärel lisati proovile 12 mM MgSO4, 10 µg/ml DNase I (Sigma-Aldrich Co. LLC.), 10 µg/ml RNase A (DNase- and Protease-free, Thermo Fisher Scientific Inc.). Proovi inkubeeriti 15 min toatemperatuuril. Raku jäänused fuugiti põhja 4000 RPM 10 min 4°C (Centrifuge 5810R, rootor: A-4-62, Eppendorf AG.). Supernatandist võeti 100 μl proovi ning samuti hoiustati ka sade -20°C juures edasiseks analüüsiks. Rekombinantse valgu puhastamiseks jäeti sade üleöö lahustuma 4°C juures 0,5 ml uurea puhvris (6 M uurea, 2 mM EDTA, 100 mM TrisHCl, pH=8,0). Seejärel vähendati valgu proovi uurea kontsentratsioon kuni 2 M-ni astmelise dialüüsiga 4°C juures, kasutades 4 M ja 3 M uurea puhvrit (vastav uurea kogus, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM TrisHCl, pH=8,0). Liitvalgu puhastamiseks allesjäänud lahustunud E. coli valkudest kasutati kommertsiaalset komplekti MagneHis™ Protein Purification System (Promega Corp.). 30 µg valku puhastati 150 µl-s uurea puhvris (2 M uurea, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM TrisHCl, pH=8,0). Proovile lisati 30 µl nikli kuulikeste suspensiooni. Edasi toimiti vastavalt tootja protokollile. Valgu kandjale sidumise- ja eluatsioonilahused sisaldasid 2M uureat. Saadud valku töödeldi SUMO proteaasiga vastavalt tootja protokollile (Thermo Fisher Scientific Inc.). Lõigatud rekombinantne valk puhastati SUMO proteaasist ja His-tag’iga seotud SUMO valgust kommertsiaalse komplektiga MagneHis™ Protein Purification System (Promega Corp.). Kõik puhastamise eri ettappides kogutud valgu preparaadid analüüsiti SDS-polüakrüülamiid geelelektroforeesil. Penetratiinist ja streptavidiinist koosneva rekombinantse valgu puhastamine. Penetratiini ja tetrameerse streptavidiini rekombinantse valgu puhastamiseks inklusioonkehadest kasutati T. Sano ja C. R. Cantori modifitseeritud protokolli (Sano ja Cantor, 1990). 50 ml indutseeritud valgu ekspressioonil saadud sade pesti 5 ml 0°C pesupuhvriga (100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl, pH=8,0). Seejärel teostati fuugimine 4000 RPM 10 min (Centrifuge 5810R, rootor: A-4-62, Eppendorf AG.). Saadud rakkude sade lüüsiti 4 ml lüüsipuhvris (2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 12 mM MgSO4,10 µg/ml DNase I (Sigma-Aldrich Co. LLC.), 10 µg/ml RNase A (DNase and Proteas-free, 19 Thermo Fisher Scientific Inc.), 30 mM TrisHCl, pH=8,0). Proovi inkubeeriti 15 min toatemperatuuril. Inklusioonkehad sadestati lahusest tsentrifuugimisel (25 000 g, 15 min 4°C, Avanti® J-E, rootor: JA-17, Beckman Coulter Inc.). Supernatandist võeti 100 µl proovi ning sademest võeti kaapeproov geelelektroforees analüüsiks. Supernatant säilitati -20°C juures. Sadet pesti 0°C pesulahusega 10 ml (2 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 30 mM Tris-HCl pH= 8,0). Teostati fuugimine 13500 RPM 5 min 4°C (Avanti® J-E, rootor: JA-17, Beckman Coulter Inc.). Sade lahustati 0,5 ml 6 M guanidiinhüdrokloriid (pH=1,5) lahuses üleöö 4°C. Guanidiinüdrokloriidi eemaldamiseks puhastati saadud valk kaks korda PD MiniTrap G-25 kolonnil (General Electric Healthcare) vastavalt tootja protokollile. Puhastatud valgu proov säilitati -20°C juures. Elektroforeetilise nihke analüüs. Testimaks, kas toodetud valk moodustab tetrameere ja suudab siduda biotinüleeritud antikeha, teostati elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs. SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesil kasutati valgu ekspressioonil saadud indutseeritud proovi materjali, kuid erinevalt tavapärastest valgu foreesist proovi ei keedetud. Tetrameeride katse viidi läbi PBS puhvris, kasutades 20 μl inlusioonkehadest puhastatud valgu proovi. Biotiini sidumiskatses kasutati 18 μl inlusioonkehadest puhastatud valgu proovi. Antud katse viidi läbi 20 μl PBS puhvris, kasutades antikeha lahjendust 1:200 ning proove inkubeeriti üleöö temperatuuridel 20°C ja 4°C (Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Biotin antibody produced in goat, Sigma-Aldrich Co. LLC.). Proovidele lisati 2x Laemmli Sample Bufferit (Sigma-Aldrich Co. LLC.) ning kanti 30 μl polüakrüülamiid geelile (NB, 4-8 %, nUView Tris-Glycine Precast Gel, NuSep Holdings Ltd.). 2.3 Tulemused ja arutelu 2.3.1 Konstruktide disain Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli disainida ja toota rekombinantseid valke, mis omaksid ühte universaalset ja tugeva spetsiifikaga seondumisdomeeni märgistatud bioloogiliste molekulide sidumiseks ning teist domeeni raku külge kinnitumiseks. Võimaluse korral oleksid valgu hulk ja paiknemine nii raku pinnal kui raku sees reguleeritavad. Antud domeene ühendab linker. Linker’i ülesandeks on tagada konstruktide painduvus. Käesolevas bakalaureusetöös kasutatud linker koosneb glütsiini ja seriini jääkidest (Gly-Gly- Gly-Ser)3 (Huston et al., 1988). Seondumisdomeeniks valiti streptavidiin, kuna streptavidiin omab erakordselt tugevat afiinsust biotiini suhtes – nende vaheline side on üks tugevaim teadaolev mittekovalentne seondumismehhanism loodudes (Green, 1975). Tänu oma väikestele mõõtmetele ei muuda 20 biotiin enamasti märgistatava valgu struktuurseid ega funktsionaalseid omadusi (Kay et al., 2009). Streptavidiini ja biotiini seondumine on teaduslikult põhjalikult läbi uuritud ning laialdaselt kasutusel teadus-ja rakendusuuringutes. Lisaks sellele on biotiin laialdaselt kasutusel bioloogiliste molekulide märgistamiseks kaubanduslikes toodetes. Käesolevas bakalaureusetöös kasutatud streptavidiin koosneb 159 aminohappejäägist. Funktsionaalne streptavidiin koosneb neljast identsest alaühikust (UniProt: P22629). Lisaks tetrameere moodustavale streptavidiinile kasutati seondumisdomeenina ka kimäärset monovalentset streptavidiini monomeeri (mSA) (Lim et al., 2013). Monomeeri peamiseks eeliseks tetrameerse streptavidiini ees on antud molekuli väikesed mõõtmed, võimaldades mSA-d lihtsamini raku sisse transportida. Kimäärne monomeer on suhteliselt hea lahustuvusega ja stabiilne (Dundas et al., 2013). Käesolevas bakalaureusetöös kasutatud kimäärse streptavidiini monomeeri järjestus vastab Kok Hong Limi ja kaastööliste poolt rhisavidiinist (rhizavidin) ja streptavidiinist struktuuripõhisel modelleerimisel väljatöötatud monovalentse monomeeri järjestusele. Antud monomeer suudab endaga siduda ühe biotiini molekuli (Lim et al., 2013). Liitvalgu ankurdamiseks raku membraani sooviti valku, mille kinnitumine oleks kontrollitav. Kontrollitavat kinnitumist fosfobilipiid kihti võimaldab bakteriorodopsiini C-heeliks, mille sisenemine membraani on pH-sõltuv (Hunt et al., 1997). C-heeliks on 4 kDa suurune polüpeptiid, mis koosneb 36-st aminohappejäägist. Need 36 aminohappejääki vastavad bakteriorodopsiini 72-107 aminohappejäägile (UniProt: P02945). Erandiks on 105 positsioonis olev glutamiinhape, mis on asendatud glutamiiniga (Hunt et al., 1997). Lisaks membraani kinnituvale rekombinatsele streptavidiinile disainiti valk, mis suudaks siseneda rakku ja lokaliseeruda tuuma. Sobivat funktsionaalsust pakub penetratiin. Penetratiin kuulub rakku sisenevate peptiidide (cell penetrating peptides) hulka. Penetratiin on 16 aminohappejäägist koosnev peptiid. Antud 16 aminohappejääki vastavad Drosophila melanogaster’i Antennapedia homeodomeeni 339-354 aminohappejäägile (Uniprot: P02833) (Derossi et al., 1994). Penetratiini lokaliseerub samaaegselt nii tsütoplasmasse kui tuuma (Joliot et al., 1991). Ümberkloneerimise lihtsustamiseks lisati disainimise käigus kõikide rekombinantsete valkude nukleotiidsete järjestuste 5’ otsa NdeI ja 3’ otsa BamHI lõikekohtade järjestused. Samuti lisati kõikide järjestuste 3’ otsa lugemisraamis olevad stop-koodonid. Teostati ka rekombinantsete 21 valkude nukleotiidsete järjestuste koodonoptimisatsioon vastavalt E. coli koodonkasutuse tabelile. Töös konstrueeritud rekombinantsed valgud on välja toodud joonisel 1. Joonis 1. Rekombinantsed valgud. Joonisel on välja toodud konstrueeritud valgud koos vastavate nimetustega (p05, p06, p07, p13, p15). Tähistused: L – linker, mSA – kimäärne monomeerne streptavidiin. Näidatud on ka plasmiidsed ekspressioonivektorid (pET-11a, pET SUMO). Kõikide töös kasutatud ekspressiooni konstruktide nukleotiidsed järjestused kontrolliti sekveneerimise abil. 2.3.2 Valkude ekspressiooni optimeerimine ja valkude ekspressioon Disainitud rekombinantsete valkude suuremahuliseks tootmiseks viidi läbi erinevad katsed, leidmaks optimaalsed ekspressiooni tingimused. Teostati ekspressiooni ajaseeria, ekspressioon temperatuuridel 25°C, 30°C ja 37°C, ekspressioon erinevates E. coli tüvedes ning ekspressioon indutseeriti erinevatel IPTG kontsentratsioonidel. Penetratiinist ja streptavidiinist koosneva rekombinantse valgu p07 (joonis 1, 4) suurim ekspressioon saavutati 1 tunniga 37°C juures E. coli BL21(DE3)pLysS tüves indutseerituna 1 mM IPTG-ga kasutades pET-11a indutseeritavat ekspressioonivektorit. Teise, neljanda ja kuuenda tunni ajapunktis ekspressioon ei muutunud, kuid kaheksanda tunni ajapunktis oli valgu hulk mõnevõrra väiksem. Madalamatel temperatuuridel (25°C ja 30°C ) teostatud ekspressioon ei suurendanud toodetud valgu hulka. Saadud valgu hulk jäi samaks ekspresseerituna E. coli tüves BL21(DE3)pLysE, kus liitvalgu ekspressioon on veelgi tugevama kontrolli all kui BL21(DE3)pLysS tüves. Induktsioon 0,5 mM IPTG-ga ei tekitanud muutust ekspresseerunud valgu koguses (andmed publitseerimata). 22 C-heeliks, mille C-terminusse on liidetud streptavidiin (p05) ei ekspresseerunud kasutades pET-11a ekspressioonivektorit (joonis 1). Küll aga ekspresseerus rekombinantne valk (p06), kus tetrameerne streptavidiin on liidetud C-heeliksi N-terminusse (joonis 1, 4). Järeldati, et C- terminuses streptavidiini sisaldav C-heeliks on antud orientatsioonis peremeesorganismile toksiline. Ekspressiooni saavutamiseks otsustati kasutada pET SUMO (small ubiquitin- related modifier) ekspressioonivektrorit. SUMO (Saccharomyces cerevisiae Smt3) ekspressioonisüsteemi kasutamine võimaldab toota E. colis valke, mis vastasel juhul pakitaks valesti, degradeeritaks või oleks väikese lahustuvusega. Antud ekspressioonisüsteemi abil saab ka võimendada valgu ekspressiooni (Peroutka Iii et al., 2011). Samal ajal köitis töögrupi tähelepanu Kok Hong Limi ja kaastööliste poolt välja antud artikkel kimäärsest monovalentsest monomeersest streptavidiinist (mSA) (Lim et al., 2013). Viimase ajendil disainiti konstrukt, mis sisaldas C-heeliksit ja mSA-d. Disainimisel järgiti ülaltoodud etappe. Konstrukti nukleotiidne järjestus kloneeriti pET SUMO plasmiidsesse ekspressioonivektorisse kasutades T/A kloneerimist. Toodetav valk p13 koosnes SUMO-st, C-heeliksist ja mSA-st (joonis 1). Antud valgu suurim ekspressioon saavutati 4 tunniga 37°C juures E. coli BL21(DE3)pLysS tüves indutseerituna 1 mM IPTG-ga. Kuuenda tunni ajapunktis ekspressioon ei muutunud. Nii nagu p07 rekombinantse valgu puhul ei suurenenud ka toodetud p13 valgu hulk ekspresseerituna madalamatel temperatuuridel (25°C ja 30°C ). Saadud valgu hulk jäi samaks ekspresseerituna E. coli tüves BL21(DE3)pLysE ning induktsioon 0,5 mM IPTG-ga ei tekitanud muutust ekspresseerunud valgu koguses (andmed publitseerimata). Konstrukti, mis sisaldas C-heeliksit ja mSA-d, nukleotiidne järjestus kloneeriti, kasutades NdeI ja BamHI restriktsiooni kohti, ka pET-11a plasmiidsesse ekspressioonivektoritesse (p15, joonis 1), kuid antud juhul ekspressiooni ei täheldatud (andmed publitseerimata). 2.3.3 Valkude puhastamine Katsete käigus selgus, et p13 liitvalk asus lüüsijärgses lahustumatus fraktsioonis (joonis 2). Saadud valk lahustati 6 M uureas. Uurea kontsentratsiooni vähendati astmelisel dialüüsil 2 M- ni. Liitvalk puhastati E. coli valkudest afiinsuskromatograafia abil. SUMO valgu järjestus eemaldati liitvalgust SUMO proteaasi töötlusega. SUMO proteaas ja rekombinantsest liitvalgust proteolüüsil ära lõigatud SUMO valgu järjestus eemaldati valgu preparaadist, kasutades afiinsuskromatograafiat. 23 p13 M C I S P P 120 100 85 70 60 50 40 30 25 20 15 10 Joonis 2. Rekombinantse valgu p13 asukoht fraktsioonis. Radade tähistused: M – molekulmassi marker , C – indutseerimata, I – indutseeritud proov, 4 tundi, S – lüüsijärgne lahustunud fraktsioon, P – lüüsijärgne lahustumatu fraktsioon. Noolega tähistatud valgu suurus lüüsijärgses lahustumatus fraktsioonis vastab rekombinantse valgu p13 arvestuslikule suurusele (30,9 kDa). Rekombinantse valgu p07 puhastamise käigus selgus, et antud valk paikneb inklusioonkehades (joonis 3), mis vastab kirjanduses varem kirjeldatule (Sano ja Cantor, 1990). Valgu p07 puhastamiseks kasutati modifitseeritud T. Sano ja C. R. Cantori varem avaldatud protokolli (Sano ja Cantor, 1990). Inklusioonkehad lahustati guanidiinhüdrokloriidiga. Lahustunud inklusioonkehade fraktsioonist eemaldati guanidiinhüdrokloriid eksklusioonkromatograafia abil. 24 p07 C I S P 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Joonis 3. Rekombinantse valgu p07 asukoht fraktsioonis. Radade tähistused: C – indutseerimata, I – indutseeritud, 2 tundi, S – inklusioonkehade sadestamisest saadud supernatant, P – inklusioonkehade sade. Noolega tähistatud valgu suurus inklusioonkehade sademes vastab p07 rekombinantse valgu monomeerse vormi arvutuslikule suurusele (21,469 kDa). 2.3.4 Elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs Uurimaks, kas toodetud p06 ja p07 rekombinantsed valgud suudavad moodustada tetrameere ning siduda biotiini, teostati elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs. Termiliselt töötlemata proovis oli tuvastatav arvutuslikule tetrameersele p07 rekombinantsele valgule vastava molekulmassiga (85,877 kDa) band’i teke (joonis 4). Seega võib järeldada, et osa lahustunud termiliselt töötlemata valgust moodustab tetrameere. Rekombinantse valgu p07 inkubeerimine biotinüleeritud antikehaga põhjustas muutuse tetrameerse valgu liikuvuses (joonis 5). Katse tulemustest järeldub, et tetrameerne rekombinantne valk p07 on võimeline siduma biotiini. Rekombinantne valk p06 ei moodustanud tetrameere, ega sidunud biotinüleeritud antikeha. 25 p06 p07 C I D N C I D N 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Joonis 4. Rekombinantsete valkude p06 ja p07 tetrameeride elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs. Radade tähistused: C – indutseerimata, I – indutseeritud, 2 tundi, D – inklusioonkehad töödeldud 95°C juures, N – inklusioonkehad, termiliselt töötlemata. Noolega tähistatud valgu suurus termiliselt töötlemata proovis vastab p07 tetrameeri arvestuslikule suurusele (85,877 kDa). Rekombinantne valk p06 ei moodusta tetrameere. p06 p07 I N 20 4 I N 20 4 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Joonis 5. Rekombinantsete valkude p06 ja p07 biotiini sidumise elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs. Radade tähistused: I – indutseeritud, N – inklusioonkehad, termiliselt töötlemata, 20 – inklusioonkehadest puhastatud termiliselt töötlemata üleöö 20°C juures biotinüleeritud 26 antikehaga inkubeeritud proov, 4 – inklusioonkehadest puhastatud termiliselt töötlemata üleöö 4°C juures biotinüleeritud antikehaga inkubeeritud proov. Rekombinantse valgu p07 rajal N asuva noolega tähistatud valgu kadumine antikehaga inkubeeritud proovides radadel 20 ja 4 näitab, et antud valk seob endaga biotinüleeritud antikeha. Rekombinantne valk p06 ei seo endaga biotinüleeritud antikeha. 27 Kokkuvõte Käesolevas bakalaureusetöös disainiti ja toodeti kahte funktsionaalset domeeni sisaldavaid rekombinantseid valke. Ühe domeeni ülesandeks oli kinnituda raku membraani või siseneda rakku ning teine domeen pidi võimaldama endaga siduda märgistatud bioloogilisi märklaudmolekule. Bioloogiliste märklaudmolekulide sidumiseks kasutati tetrameere moodustavat streptavidiini või kimäärest monomeerset streptavidiini. Raku membraani kinnitumiseks kasutati bakteriorodopsiini modifitseeritud C-heeliksit. Rekombinantse valgu lokalisatsiooniks tuuma ja tsütoplasmasse kasutati Antennapedia homeodomeenist pärit penetratiini. Rekombinantsed valgud disainiti kombineerides omavahel erinevaid domeene. Penetratiinist ja streptavidiinist koosnev rekombinantne valk paiknes inklusioonkehades. Puhastatuna moodustas antud valk tetrameere ja oli võimeline siduma biotiini in vitro. Rekombinantne valk, mille C-terminuses oli C-heeliks ja N-terminuses streptavidiin, ei moodustanud pärast puhastamist tetrameere, ega sidunud biotiini. Rekombinantne valk, kus C-heeliks asus valgu N-terminuses, ei ekspresseerunud testitud tingimustel. C-heeliksist ja streptavidiini monomeerist koosnev rekombinantne valk ekspresseeriti SUMO liitvalguna. Antud valk jäi lüüsijärgselt lahustumatusse fraktsiooni ning puhastati edasi uurea juuresolekul. 28 Bifunctional streptavidin’s derivatives: design and expression in E. coli Jenni Katri Pedor Summary The objective of this study was to construct artificial proteins with two different functional properties. These proteins should bind labelled biological molecules with high specificity. In addition, these proteins should be targeted to specific and different cellular components in vitro. Streptavidin-biotin interaction was chosen as the basis to provide binding functionality due to extremely high specificity of the interaction. A derivative of wild type streptavidin and an artificial chimeric streptavidin monomer, were used as a binding domains. Modified bacteriorhodopsin C-helix was chosen to insert the designed recombinant proteins into the cell membrane. Penetratin, a cell penetrating peptide, was used for protein localization into nucleus and cytoplasm. Several different recombinant proteins consisting of different combinations of a binding and cellular targeting domains were designed and expressed in E. coli. Recombinant protein consisting of penetratin and streptavidin was shown to be localized in inclusion bodies. Purified penetratin-streptavidin protein was able to form tetramers and to bind biotin in vitro. Recombinant protein with streptavidin at N-terminus and C-helix at C-terminus, purified from inclusion bodies, did not form tetramers and was not able to bind biotin. Recombinant protein that had C-helix at N-terminus was not expressed under any conditions tested. Recombinant protein consisting of C-helix and streptavidin monomer was expressed as a SUMO fusion protein. After lysis it remained in the insoluble cell fraction and was further purified with urea. 29 Tänuavaldused Ma soovin tänada oma juhendajat, professor Ants Kurge koostöö ja abi eest. Ma tänan südamest oma juhendajat ja ülemust Meelis Kolmerit tema aja, kannatlikkuse ja toetuse eest ning väga põhjalike ja kasulike näpunäidete eest töö planeerimisel ja koostamisel. Veel sooviksin tänada teda mõtete jagamise eest teadlastest, teaduskirjandusest ja maailmast üldiselt. Ja muidugi kohvi ja kookide eest. Olen ülimalt tänulik Estigen OÜ-le ja koostööpartneritele võimaluse eest osaleda väga huvitavas projektis. Tahaksin veel eraldi tänada Dan Rohwer-Nutter’it õpetuste eest, kuidas vahetada tõmbekapi filtrit ja kasutada kahveltõstukit ning Ameerika toidukultuuri imede tutvustamise eest, sh Pine Cone’i cream puff’i. Erilised tänud ka Juha Kononen’ile näpunäidete eest koekiipide valmistamisel ja histoloogiliste värvimiste läbiviimisel. Tänan oponent Tõnis Ördi tema aja ja asjakohaste tähelepanekute eest. Tänan Andres Salumetsa võimaluse eest kasutada Tervisetehnoloogiate Arenduskeskuse laborit ja kõiki laborikaaslasi nõu ja abi eest. Olen siiralt tänulik Kadri Seppale kõigi koosõpitud tundide eest. 30 Kasutatud kirjandus Bechara, C. ja Sagan, S., (2013). Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand? FEBS Lett. 587(12): 1693–1702. Bye, L., Modi, N. ja Stanford, M., (2013). Basic Sciences for Ophthalmology, OUP Oxford. Derossi, D., Joliot, A.H., Chassaing, G. ja Prochiantz, A., (1994). The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269(14): 10444–50. Dundas, C.M., Demonte, D. ja Park, S., (2013). Streptavidin-biotin technology: Improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97(21): 9343–9353. Dupont, E., Prochiantz, A. ja Joliot, A., (2011). Penetratin Story: An Overview. Ü. Langel, toim Methods in Molecular Biology. Humana Press, 391–397. Ernst, O.P., Lodowski, D.T., Elstner, M., Hegemann, P., Brown, L.S. ja Kandori, H., (2014). Microbial and animal rhodopsins: Structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114(1): 126–163. Finkenwirth, F., Kirsch, F. ja Eitinger, T., (2014). A versatile Escherichia coli strain for identification of biotin transporters and for biotin quantification. Bioengineered 5(2): 129–32. Gehring, W.J., Qian, Y.Q., Billeter, M., Furukubo-Tokunaga, K., Schier, A.F., Resendez- Perez, D., Affolter, M., Otting, G. ja Wüthrich, K., (1994). Homeodomain-DNA recognition. Cell 78(2): 211–23. Ghibaudi, E., Boscolo, B., Inserra, G., Laurenti, E., Traversa, S., Barbero, L. ja Ferrari, R.P., (2005). The interaction of the cell-penetrating peptide penetratin with heparin, heparansulfates and phospholipid vesicles investigated by ESR spectroscopy. J. Pept. Sci. 11(7): 401–9. Green, M.R. ja Sambrook, J., (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Edi., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Green, N.M., (1975). Avidin. Adv. Protein Chem. 29: 85–133. Grigorieff, N., Ceska, T.A., Downing, K.H., Baldwin, J.M. ja Henderson, R., (1996). 31 Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin. J. Mol. Biol. 259(3): 393–421. Hendrickson, W.A., Pähler, A., Smith, J.L., Satow, Y., Merritt, E.A. ja Phizackerley, R.P., (1989). Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86(7): 2190–4. Howarth, M., Chinnapen, D.J.-F., Gerrow, K., Dorrestein, P.C., Grandy, M.R., Kelleher, N.L., El-Husseini, A. ja Ting, A.Y., (2006). A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nat. Methods 3(4): 267–73. Howarth, M., Liu, W., Puthenveetil, S., Zheng, Y., Marshall, L.F., Schmidt, M.M., Wittrup, K.D., Bawendi, M.G. ja Ting, A.Y., (2008). Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods 5(5): 397–9. Hunt, J.F., Rath, P., Rothschild, K.J. ja Engelman, D.M., (1997). Spontaneous, pH-dependent membrane insertion of a transbilayer α-helix. Biochemistry 36(49): 15177–15192. Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotný, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E. ja Crea, R., (1988). Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85(16): 5879–83. Joliot, A., Pernelle, C., Deagostini-Bazin, H. ja Prochiantz, A., (1991). Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 88(5): 1864– 1868. Kay, B.K., Thai, S. ja Volgina, V. V, (2009). High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498: 185–96. Knowles, J.R., (1989). The mechanism of biotin-dependent enzymes. Annu. Rev. Biochem. 58: 195–221. Kuntz, I.D., Chen, K., Sharp, K.A. ja Kollman, P.A., (1999). The maximal affinity of ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. 96(18): 9997–10002. Kögl, F. ja Tönnis, B., (1936). Über das Bios-Problem. Darstellung von krystallisiertem Biotin aus Eigelb. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für Physiol. Chemie 242(1-2): 43–73. Laitinen, O.H., Hytönen, V.P., Nordlund, H.R. ja Kulomaa, M.S., (2006). Genetically 32 engineered avidins and streptavidins. Cell. Mol. Life Sci. 63(24): 2992–3017. Lanyi, J.K., (2004). Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66(1): 665–688. Lesch, H.P., Kaikkonen, M.U., Pikkarainen, J.T. ja Ylä-Herttuala, S., (2010). Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv 7: 551–564. Lim, K.H., Huang, H., Pralle, A. ja Park, S., (2013). Stable, high-affinity streptavidin monomer for protein labeling and monovalent biotin detection. Biotechnol. Bioeng. 110(1): 57–67. Livnah, O., Bayer, E.A., Wilchek, M. ja Sussman, J.L., (1993). Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90(11): 5076–80. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H.T., Cartailler, J.P. ja Lanyi, J.K., (1999). Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J. Mol. Biol. 291(4): 899–911. Mock, D., (1996). Present Knowledge in Nutrition E. Ziegler & L. Filer, ILSI Press: Washington DC. Määttä, J.A., (2010). Structural and Functional Characterization of Engineered Avidin Proteins. University of Tampere. Oesterhelt, D. ja Stoeckenius, W., (1973). Functions of a new photoreceptor membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70(10): 2853–7. Oesterhelt, D. ja Stoeckenius, W., (1971). Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat. New Biol. 233(39): 149–52. Orr, G.A., (1981). The use of the 2-iminobiotin-avidin interaction for the selective retrieval of labeled plasma membrane components. J. Biol. Chem. 256(2): 761–6. Peroutka Iii, R.J., Orcutt, S.J., Strickler, J.E. ja Butt, T.R., (2011). SUMO fusion technology for enhanced protein expression and purification in prokaryotes and eukaryotes. Methods Mol. Biol. 705: 15–30. Sano, T. ja Cantor, C.R., (1990). Expression of a cloned streptavidin gene in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 87(1): 142–146. Sano, T., Vajda, S. ja Cantor, C.R., (1998). Genetic engineering of streptavidin, a versatile affinity tag. J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 715(1): 85–91. Zempleni, J., (2005). Uptake, localization, and noncarboxylase roles of biotin. Annu. Rev. 33 Nutr. 25: 175–96. Weber, P.C., Ohlendorf, D.H., Wendoloski, J.J. ja Salemme, F.R., (1989). Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science 243(4887): 85–8. Wilchek, M. ja Bayer, E.A., (1999). Foreword and introduction to the book (strept)avidin- biotin system. Biomol. Eng. 16(1-4): 1–4. Wilchek, M. ja Bayer, E.A., (1990). Introduction to avidin-biotin technology. Methods Enzymol. 184: 5–13. Wilchek, M. ja Bayer, E.A., (1988). The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. Anal. Biochem. 171(1): 1–32. Williams, D.H., Stephens, E. ja Zhou, M., (2003). Ligand binding energy and catalytic efficiency from improved packing within receptors and enzymes. J. Mol. Biol. 329(2): 389–99. 34 LISAD Lisa 1 Tabel 1. Konstruktide ja oligonukleotiidsete praimerite disainimiseks kasutatud internetipõhised programmid. KASUTATUD VEEBI AADRESSID RAKENDUS http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Teostada homoloogia võrdlus http://web.expasy.org/translate/ DNA translatsioon http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html Pööratud komplement http://www.restrictionmapper.org/ Restriktsioon analüüs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Praimeri disain http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html 35