Ühe-etapiline geeni deletsioon
Ühe-etapilise geeni deleteerimise meetodi võttis kasutusele Rothstein 1983. a. Meetod nägi ette lineaarse restriktsioonifragmendi transformeerimist. Transformeeritav DNA molekul sisaldas geeni keskele kloonitud selektsioonimarkerit ja otstes asuvaid lookusega homoloogilisi järjestusi. Meetod koosneb mitmest etapist (Joonis 2):
- plasmiidi kloonimine - plasmiidi sisestatakse uuritava geeni järjestus
- geeni kodeeriva järjestuse või selle ühe osa asendamine pärmi selektsioonimarkeriga
- restriktsioon, et lõigata plasmiidist välja DNA fragment
- restriktsioonifragmendi transformatsioon
- transformantide selektsioon
Joonis 2. Geeni deletsioon kasutades vaheplasmiidi kloonimist.
1990-ndate lõpus hakati kasutama polümeraasi ahelreaktsiooni meetodit (PCR, "polymerase chain reaction"), et lisada pärmi selektsioonimarkeri otstesse lookuse spetsiifilisi järjestusi. Kasutati kahe-etapilist PCR reaktsiooni (Joonis 3). Esimese reaktsiooni käigus paljundati lookuse spetsiifilised järjestused. Teises PCR reaktsioonis kasutati saadud fragmente praimeritena ning amplifitseeriti pärmi selektsioonimarker. Saadud DNA molekulid, mis sisaldasid selektsioonimarkerit koos otstes paiknevate 100-500 nukleotiidi pikkuste lookuse spetsiifiliste järjestustega, transformeeriti pärmirakkudesse.
Joonis 3. Geeni deletsioon kasutades kahe-etapilist PCR meetodit.
Homoloogiline rekombinatsioon pagaripärmis toimub väga efektiivselt. Piisab vaid 30 nukleotiidi pikkustest homoloogilistest järjestustest lineaarse DNA molekuli otstes, et see integreeruks vastavasse lookusesse. Tänapäeval kasutatakse selektsioonimarkeri paljundamisel nn. liitpraimereid (Joonis 4). Need koosnevad kahest osast: 20 nukleotiidist, mis on homoloogiline seletsioonimarkeri järjestusega ning 40-50 nukleotiidist, mis on homoloogiline vastava lookuse järjestusega. Saadud PCR fragment transformeeritakse rakkudesse ning selekteeritakse geeni deletsiooni sisaldavad kolooniad.
Joonis 4. Geeni deletsioon kasutades spetsiifiliste (liitpraimerid) praimeritega PCR meetodit.