Poolduvas pärmis töötavad selektsioonimarkerid
Poolduvas pärmis Schizosaccharomyces pombe on positiivsel selektsioonil kasutusel:
1. auksotroofsed markerid (vt. tabel 7).
ura4+ geen kodeerib orodiin-5'-fosfaat dekarboksülaasi, mis osaleb pürimidiinide biosünteesi rajas. Mutatsioonid ura4+ põhjustavad Ura- auksotroofsust. Kuna see markergeen on väga laialt kasutusel, siis enamus laboris kasutatavatest tüvedest sisaldavad ura4.d18 retsessiivset mutatsiooni. Pagaripärmi ortoloog URA3 ei ekspresseeru poolduvas pärmis hästi ning komplementeerib ura4- alleele halvasti. Seepärast poolduvas pärmis URA3 markergeeni eriti ei kasutata. ura4+ rakke on võimalik vastuselekteerida kasutades 5-fluoro-oraathapet (5-FOA) (vt. alapeatükki "Vastuselektsiooni võimaldavad markerid"). Söötmetel, mis sisaldab 5-FOA-d, jäävad ellu rakud, kes kaotavad metsiktüüpi ura4+ geeni.
leu1+ kodeerib 3-isopropüülmalaat dehüdrogenaasi, mis osaleb leutsiini biosünteesi rajas. Kuna leu1+ on samuti üks enamkasutatavatest markerites, siis paljud laboritüved omavad leu1.32 alleeli ning on Leu- auksotroofid. Pagaripärmi ortoloog LEU2 komplementeerib poolduva pärmi leu1- mutatsioone juhul kui seda geeni üle-ekpresseerida. Seepärast kasutatakse LEU2 markergeeni kõrge koopia arvuga plasmiidides.
ade6+ kodeerib fosfo-ribosüül-amiino-imidasool karboksülaasi, mis osaleb puriini nukleotiidide biosünteesi rajas. Kuna ade6+ geen sisaldab palju restriktaaside poolt äratuntavaid järjestusi, siis seda markerit väga laialdaselt ei kasutata. Poolduva pärmi ade6- mutandid on sarnase fenotüübiga kui pagaripärmi ade2- mutandid: nad kasvavad söötmel, kus on vähem adeniini (10 mg/l) ja moodustavad punaseid või roosasid kolooniaid. Poolduva pärmi ade6.M210 ja ade6.M216 alleelid komplementeerivad üksteist ning neid kasutatakse diploidsete tüvede isoleerimisel. Mõlemad mutandid on Ade- auksotroofid. Söötmel, kuhu on lisatud vähe adeniini, moodustab ade6-M210 mutant tumeroosad kolooniad ja ade6-M216 mutant heleroosad kolooniad. Diploid ade6.M210/ade6.M216 ei vaja kasvuks söötmes adeniini ning moodustuvad kolooniad on valged. Poolduva pärmi ade6.704 alleel sisaldb nonsense mutatsiooni, mida supresseerib sup3-5 (sup3 kodeerib translatsiooni terminatsiooni faktorit eRF3, sup3-5 aga tRNA-d). Seda markergeeni kasutatakse juhul kui on vaja värvi järgi selekteerida plasmiidi olemasolu rakkudes. Kui ade6.704 rakkudesse transformeerida plasmiid, mis sisaldab sup3-5 alleeli, siis moodustuvad kolooniad on heleroosad. Heleroosat värvust põhjustavad vead plasmiidi pärandumisel. Juhul kui enamus rakke plasmiidi kaotavad, siis moodustuvad tumeroosad kolooniad. Kui sup3-5 alleel integreerida poolduva pärmi genoomi, siis moodustuvad valged kolooniad tänu alleeli 100% pärandumisele.
Tabel 7. Poolduva pärmi auksotroofsed markergeenid.
Markergeen |
Ensüümi nimi |
Sagedamini kasutatavad alleelid
|
Pagaripärmi ortoloog |
ade6+ |
fosfo-ribosüül-amiino-imidasool karboksülaas |
ade6-M210, ade6-M216, ade6-704 |
ADE2 |
arg3+ |
ornitiin karbamüültransferaas |
arg3.d4 |
ARG3 |
his1+ |
ATP fosforibosüül transferaas |
his1.102 |
HIS1 |
his3+ |
histidinool-fosfaat aminotransferaas | his3.237 |
HIS5 |
leu1+ |
3-isopropüülmalaat dehüdrogenaas |
leu1-32 |
LEU2 |
ura4+ |
orodiin-5'-fosfaadi dekarboksülaas |
ura4.d18 |
URA3 |
2. resistentsusgeenid (vt. tabel 8).
Poolduvas pärmis kasutatakse kõige rohkem kanMX6 kassetti, mis koosneb Ashbya gossypii translatsiooni elongatsioonifaktori 1 TEF1 geeni promootori ja terminaatori järjestustest ning Escherichia coli transposooni Tn903 kanR geenist. kanR geen tagab resistentsuse genetitsiini (G418) vastu.
Tabel 8. Poolduvas pärmis kasutatavd resistentsusgeenid.
Marker | Selektsioonil kasutatav antibiootikum |
Selektsiooniks sobilik sööde |
bleMX6 |
bleomütsiin |
ainult rikas sööde |
hphMX6 |
hügromütsiin B |
ainult rikas sööde |
kanMX6 |
genetitsiin |
ainult rikas sööde |
natMX6 |
nourseotritsiin |
rikas sööde ja miinimumsööde |