Pärmi kuntslikud kromosoomid (YAC)
Pärmi kuntslikud kromosoomid (YAC) on süstik-vektorite eriliik. Neid paljundatakse ja pärandatakse bakeris E. coli kui episomaalseid tsirkulaarseid plasmiide. Pärmirakus on nad lineaarsed DNA molekulid, mis käituvad sarnaselt pärmi kromosoomidele. Tsirkulaarne YAC vorm on umbes 12 kb pikk. Lineaarne YAC koos inserdiga võib olla, sõltuvalt inserdi suurusest, mitusada kb pikk. Seega võimaldavad YAC-id kloonida väga pikki (200-800 kb) DNA fragmente. Tavalisse süstik-vektorisse saab kloonida 10-20 kb pikkusi DNA fragmente.
YAC-id sisaldavad järgmisi geene ja DNA elemente (Joonis 10):
- bakteri replikatsiooni alguspunkt - ori
- bakteri selektsioonimarker - AmpR
- 3 pärmi selektsioonimarkerit (näiteks URA3, HIS3, TRP1)
- unikaalsed restriktaaside lõikamiskohad - asuvad SUP4-ochre (SUP4) järjestuses
- autonoomselt replitseeruv järjestus pärmi kromosoomist - ARS element
- tsentromeerne järjestus pärmi kromosoomist - CEN element
- pärmi telomeersed järjestused - TEL element
Joonis 10. Pärmi kuntslike kromosoomide plasmiidi kaart. AmpR, 
-laktamaasi geen; ori, E. coli replikatsiooni alguspunkt; URA3, HIS3, TRP1, pärmi selektsioonimarkerid; SUP4, supressor türosiin tRNA geen; ARS, pärmi autonoomselt replitseeruv järjestus; CEN, tsentromeerne järjestus; TEL, telomeerne järjestus.
-laktamaasi geen; ori, E. coli replikatsiooni alguspunkt; URA3, HIS3, TRP1, pärmi selektsioonimarkerid; SUP4, supressor türosiin tRNA geen; ARS, pärmi autonoomselt replitseeruv järjestus; CEN, tsentromeerne järjestus; TEL, telomeerne järjestus.
YAC-is kasutatavad TEL elemendid on pärit alglooma Tetrahymena pyriformis ribosomaalse DNA molekuli otstest. Pärmis töötavad nad kui funktsionaalsed telomeerid. YAC-is olevad TEL järjestused paiknevad pööratud orientatsioonis ning nende vahel asub üks selektsioonimarkeritest (näiteks HIS3). Vektori lõikamisel BamHI restriktaasiga eemaldatakse HIS3 selektsioonimarker ning moodustuvad lineaarsed DNA molekulid (Joonis 11).
SUP4 geen sisaldab unikaalseid restriktaaside lõikamiskohti. SUP4 kodeerib suppressor türosiin tRNA-d, mis tunneb ära ade2-1 alleelis oleva UAA (ochre) mutatsiooni. Juhul kui SUP4 ekpresseerub, siis terminatsioonikoodon ade2-1 alleelis kodeerib aminohapet ning transleeritakse funktsionaalne Ade2 valk. Need rakud on valget värvi. Uuritav DNA fragment kloonitakse SUP4 geeni keskele. Selle tulemusena ei ekspresseeru funktsionaalne supressor tRNA, alleeli ade2-1 ei supresseerita ja Ade2 ei ekspresseeru. Rakkudes kuhjub vaheühend AIR, mis oksüdeerumisel muutub punaseks.
YAC plasmiidi kloonimine koosneb kolmest etapist:
1. Plasmiidi restriktsioon kahe erineva restriktaasiga.
Esmalt lõigatakse YAC plasmiid BamHI restriktaasiga. Selle tulemusena eemladatakse plasmiidist HIS3 markergeen ning tekib lineaarne DNA molekul, mille otstes on TEL elemendid. HIS3 markergeeni olemasolu või puudumise kaudu saab vahet teha lineaarsete ja rõngasmolekulide vahel. Teine restriktsioon viiakse läbi restriktaasiga, mille lõikamiskoht asub SUP4 geenis (Joonisel 11 on teiseks restriktaasiks EcoRI). Selle tulemusena tekib kaks lineaarset DNA molekuli e. tulevase YAC-i vasak ja parem õlg. Alles jäänud kaks selektsioonimarkerit asuvad eraldi õlgades: TRP1 koos ARS ja CEN elementidega vasakus õlas ja URA3 paremas õlas.
2. Kloonitava DNA restriktsioon ja ligatsioon.
Kloonitav DNA lõigatakse osaliselt restriktaasiga, mida kasutati SUP4 geeni lõikamiseks. Saadud DNA fragmendid ligeeritakse defosforüleeritud YAC-i õlgadega.
3. Transformatsioon pärmirakkudesse ja selektsioon.
Saadud DNA molekulid transformeeritakse pärmitüvesse, mille genotüüp on ade2-1 ura3-52 trp1-
1. Selekteeritakse transformante, kes oleks Ura+ Trp+ Ade- ja oleks punase värvusega st. sisaldaks YAC-i mõlemat õlga ning SUP4 geeni kloonitud DNA fragmenti.
1. Selekteeritakse transformante, kes oleks Ura+ Trp+ Ade- ja oleks punase värvusega st. sisaldaks YAC-i mõlemat õlga ning SUP4 geeni kloonitud DNA fragmenti.