Alleeli isoleerimine genoomist
Autonoomselt replitseeruvaid plasmiide kasutatakse alleeli isoleerimiseks genoomist ilma integratsioonita (Joonis 6.). See meetod põhineb fenomenil, et lineriseeritd DNA molekul saab pärmirakus säilida vaid siis kui ta integreerub kromosoomi või retsirkulariseerub. Alleeli isoleerimise meetod kasutabki plasmiidi rõngasmolekulide teket.
Meetod koosneb järgmistest etappidest:
- YRp plasmiid, mis sisaldab metsiktüüpi alleeli, lineariseeritakse. Alles jääb umbes 100 nukleotiidi alleelist ülespoole ja allapoole jäävatest homoloogilistest järjestustest. See lineaarne DNA molekul transformeeritakse pärmirakku.
- Lineariseeritud DNA-d sisaldavates rakkudes toimub rekombinatsioon ja geeni duplikatsioon. Plasmiid retsirkulariseeritakse.
- Pärmirakus olev DNA eraldatakse ning transformeeritakse E. coli rakkudesse. Plasmiide paljundatakse ja eraldatakse bakterirakust ning analüüsitakse otsitava alleeli olemasolu.