Mitokondri transformatsioon

 
Pagaripärmi mitokondri transformatsiooni võimaldavad kaks asjaolu:
  • pagaripärm talub mitokondriaalse DNA (mtDNA) kadu (nimetatakse rho0 genoom) või mutatsioone selles (nimetatakse rho- genoom) juhul kui kasvukeskkonnas on fermenteeritavat süsiniku allikat (näiteks glükoosi)
  • mtDNA replikatsioon toimub raku valgulisest sünteesist sõltumatult ning ei vaja spetsiifilist replikatsiooni alguspunkti järjestust
Eksogeense DNA sisestamiseks mtDNA-sse kasutatakse biolistilist transformeerimise meetodit. Rakke pommitatakse kahe plasmiidi seguga - üks plasmiid sisaldab auksotroofset selektsioonimarkerit (näiteks LEU2), teine plasmiid sisaldab mitokondrisse transformeeritavat DNA-d. Transformantide selektsioon toimub kahes etapis. Esmalt selekteeritakse transformandid tuuma selektsioonimarkeri järgi. Teises etapis selekteeritakse nendest kolooniatest mtDNA transformandid. Plasmiidne DNA, mis sisaldab mitokondriaalset järjestust, säilub rakkude mitokondris kui rho- genoom. Saadud tüve ristamisel rho+ mtDNA-d sisaldva tüvega moodustuvad diploidsed rakud, kus toimub mitokondrite liitumine ning eksogeense DNA rekombineerumine rho+ mtDNA-ga.
Rekombinatsiooni tulemusena asendatakse järjestused rho+ genoomis plasmiidis olevate järjestustega.
mtDNA transformatsiooni etapid (Joonis 14):
1. Sünteetiliste rho- transformantide saamine.
Alustatakse tüvest, kellel puudub täielikult mtDNA (rho0), tuumagenoomis sisalduvad auksotroofsed mutatasioonid ja kar1-1 mutatsioon.
  • KAR1 on pagaripärmi eluks hädavajalik geen. Kar1 on vajalik pärmirakus käävi organiseeriva keskuse (spindle pole body, SPB) duplikatsioonil ja karüogaamias. kar1-1 mutatsiooniga rakkude paardumisel tuumade ühinemist ei toimu. Tekivad kahetuumsed diploidsed rakud.
Pärmirakkudesse transformeeritakse biolistilisel meetodil korraga kaks DNA molekuli. Kasutatakse markergeeni (näiteks LEU2) sisaldavat plasmiidi, mis komplementeerib genoomse auksotroofse mutatasiooni (näiteks leu2-3,112). Kasutatakse ka plasmiidi, mis sisaldab mtDNA järjestusi, mille vahele on kloonitud ARG8m markergeen.
  • ARG8 asub tuumagenoomis. Ta kodeerib atsetüül-ornitiin aminotransferaasi, mis osaleb ornitiini ja arginiini biosünteesi rajas. Ensüüm transleeritakse tsütoplasmas ning transporditakse seejärel mitokondrisse. On võimalik kasutada ka mitokondriaalset markergeeni ARG8m, mis komplementeerib tuumagenoomi mutatasiooni arg8. Seega peab transformeeritav tüvi sisaldama mutatsiooni arg8.
Esmalt selekteeritakse tuuma transformandid, st. need kolooniad, kes sisaldavad markergeeni (näiteks LEU2). Tavaliselt saadakse ligi 3000 transformanti. Seejärel selekteeritakse transformandid, kes on võimelised kasvama arginiini mittesisaldaval söötmel. Nende rakkude mitokondris asub plasmiid, mis sisaldab mtDNA järjestusi koos ARG8m markergeeniga. Selliseid transformante nimetatakse sünteetilisteks rho- mutantideks.

2. Modifitseeritud mtDNA-ga tüve saamine.
Saadud sünteetilised rho- tüved ristatakse metsiktüüpi rho+ mtDNA sisaldava arg8 kar1-1 tüvega. Rakkude ühinemisl tekib diploid, kus ei toimu tuumade ühinemist. Diploidis toimub mitokondrite liitumine. Kahe mtDNA genoomi vahel toimub homoloogiline rekombinatsioon ning soovitud DNA järjestus integreerub koos markergeeniga ARG8m mitokondri genoomi. Saadud mtDNA mutandid on võimelised komplementeerima tuumagenoomis paiknevat arg8 mutatsiooni. Modifitseeritud mtDNA-ga rakkude tekkimise sagedus varieerub 1% kuni 50% eraldatud sügootidest ning sõltub kastutatavast pärmitüvest.
 
Joonis 14. Modifitseeritud mtDNA-ga tüve saamine kasutades sünteetilist rho- mutanti.
« Eelmine | Järgmine »