Pagaripärmis kasutusel olevad plasmiidid
Pagaripärmis Saccharomyces cerevisiae on kasutusel väga erinevad plasmiidid. Neid kasutatakse DNA järjestuste genoomi integreerimisel, genoomis olevate geenide ja järjestuste deletsioonil ning muutmisel, geenide ekspressioonil. Enamus pagaripärmis kasutatavatest plasmiididest on nn. süstik-vektorid ("shuttle vectors"). Süstik-vektorid sisaldavad järjestusi, mis on vajalikud plasmiidi replikatsiooniks ja selektsiooniks bakteris E. coli. Samuti sisaldvada nad järjestusi, mis tagavad plasmiidi säilimise, pärandumise ja selektsiooni pärmis.
Enamus kasutusel olevatest plasmiididest on alguse saanud E. coli plasmiidist pBR322 (või selle põhjal konstrueeritud plasmiididest pUC, pBluescript jne.). E. coli plasmiidist pärinevad bakterirakus töötav replikatsiooni alguspunkt ori ("origin"), selektsioonimarker
-laktamaasi geen bla (nimetatakse ka AmpR) ja polülinker. Polülikner (MCS, "multiple cloning site") koosneb unikaalsetest restriktaaside lõikamiskohtadest, mis esinevad plasmiidis ainult üks kord. Bakterirakus töötavad elemendid võimaldavad süstik-vektorite paljundamist ja selektsiooni E. coli-is ning nende plasmiidide muutmist kasutades in vitro meetodeid.
![](eXe_LaTeX_math_1.gif)
Süstik-vektorid sisaldavad ka pärmirakus töötavaid järjestusi. Nendeks elementideks on selektsioonimarker, replikatsiooni alguspunkt ja tsentromeerne järjestus. Tänu nendele järjestustele on võimalik süstik-vektoreid pärmis selekteerida, paljundada ja säilitada.
Põhjalikumalt tutvustatakse pärmide selektsioonimarkereid õpiobjektis "Pärmigeneetika: pärmitüvede genotüübid, tüvede kasvatamiseks kasutatavad söötmed". Enamus süstik-vektorites kasutusel olevatest selektsioonimarkeritest on auksotroofsed markergeenid - URA3, HIS3, LEU2, TRP1, LYS2 - mis komplementeerivad spetsiifilisi auksotroofseid mutatsioone (näiteks: ura3-52, his3-
1, leu2-
1, trp1-
1, lys2-201). Need geenid on olulised vastava aminohappe või nukleotiidi biosünteesi radades. URA3 ja LYS2 markergeenid
võimaldavad lisaks poolt selektsioonile ka vastuselektsiooni. Vastuselektsioon e. negatiivne selektsioon võimaldab lahti saada pärmitüves olevast markergeenist. Süstik-vektorites kasutatakse ka dominantseid selektsioonimarkereid e. antibiootikumide resistentsusgeene (kanMX6, hphMX6, natMX6).
![](eXe_LaTeX_math_1.1.gif)
![](eXe_LaTeX_math_1.1.gif)
![](eXe_LaTeX_math_1.1.gif)
Kokkuvõtteks, süstik-vektoreid kloonitakse ning paljundatakse bakteris E. coli ning seejärel transformeeritakse pärmirakkudesse.