Pärmi kaksikhübriidi meetodi variatsioonid
Pärmi kaksikhübriidi meetodit on edasi arendatud ning välja on töötatud erinevad variatsioonid:
- pärmi üksikhübriidi meetod
- tagurpidi kaksikhübriidi meetod
- pärmi kolmikhübriidi meetod
1. Pärmi üksikhübriidi meetod võimaldab analüüsida kindlale DNA elemendile seonduvaid valke, st. uuritakse valk-DNA vahelisi interaktsioone (Joonis 13). Konstrueeritakse kaks pärmitüve, mille genoomi viiakse reportergeenid HIS3 või lacZ. Mõlema reportergeeni ees paikneb uuritav DNA element. Konstrueeritakse ka cDNA raamatukogu, mis sisaldab ekspressiooniplasmiide. Nendelt plasmiididelt ekspresseeruvad valgud kui liitvalgud koos Gal4 aktivatsioonidomeeniga (AD) ning ekspressioon on tugeva promootori kontrolli all. Raamatukogu transformeeritakse HIS3 reportertüvesse ning analüüsitakse rakkude võimet moodustada kolooniaid histidiini mittesisaldaval selektiivsöötmel. Liitvalgu seostumisel uuritavale DNA elemendile aktiveeritakse reportergeeni HIS3 ekspressioon ning need rakud kasvavad selektiivsöötmel milles puudub histidiin. Kandidaatplasmiidid isoleeritakse ning transformeeritakse lacZ reportertüvesse. Analüüsitakse lacZ reportergeeni ekspressiooni. Kahe reporteri kasutamine võimaldab teha kindlaks nn. "vale positiivsed" kloonid.
Joonis 13. Pärmi üksikhübriidi meetod.
2. Tagurpidi kaksikhübriidi meetod põhineb olemasoleva interaktsioon lõhkumisel kas mutatsioonde, mürkide või võistlevate valkude abil (Joonis 14). Selle meetodi puhul kasutatakse reportergeeni, mida saab selekteerida nii poolt kui vastu. Üheks selliseks reporteriks on URA3. Vastuselektsioon toimub söötmel, mis sisaldab 5-fluoro-oroothapet (5-FOA). Kui kaks valku omavahel interakteeruvad, siis aktiveeritakse URA3 ekspressioon. Need rakud on võimelised kasvama uratsiili mittesisaldaval selektiivsöötmel. Söötmel, mis sisladab 5-FOA-d, need rakud surevad. URA3 kodeerib orotidiin-5´-fosfaat dekarboksülaasi, mis katalüüsib 5-FOA toksiliseks 5-fluorouratsiiliks. Kui kahe valgu vaheline interaktsioon lõhutakse, siis raporterit URA3 enam ei ekspresseerita ning rakud on võimelised kasvama 5-FOA-d sisaldaval söötmel.
Joonis 14. Pärmi tagurpidi kaksikhübriidi meetod.
3. Pärmi kolmikhübriidi meetod võimaldab uurida RNA-valk vahelisi interaktsioone või rohkem kui kahest valgust koosneva kompleksi moodustumist (Joonis 15). Kasutatakse liitvalke, mis omavad kas Gal4 aktivatsioonidomeeni (AD) või DNA-ga seondumise domeeni (BD). Nendega koos ekspresseeritakse rakus ka kolmas valk, mis on oluline kompleksi tekkeks. Kolme valgu interakteerumisel aktiveeritakse reportergeeni ekspressioon. Kolmanda valgu asemel võib kasutada RNA molekuli või RNA molekulide raamatukogu. Sellisel juhul uuritakse valk-RNA-valk vahelisi interaktsioone.
