Ülesande lahendamisel tuleb arvestada, et
- GEEN Y on pagaripärmile eluks hädavajalik geen
- signaaljärjestus asub valgu C-terminuses
- GEEN Y ei ole võimalik rakkudes üleekspresseerida
- ei ole võimalik kasutada spetsiifilisi valk Y ära tundvaid antikehasid
Kõike seda arvesse võttes tuleks konstrueerida pärmitüvi, mis sisaldaks epitoobi järjestust valk Y N-terminuses.
Modifitseeritud GEEN Y ekspressioon on tema enda promootori kontrolli all. Kasutada tuleb sellist epitoopi, mille vastased antikehad on olemas.
Alustama peab diploidsest tüvest, sest GEEN Y on eluks hädavajalik geen. Rakkudesse transformeeritakse konstrukt, mis sisaldab GEEN Y avatud lugemisraami algusalaga homoloogilisi järjestusi, loxP järjestuste vahel paiknevat pärmi selektsioonimarkerit ja epitoobi järjestust. Konstrukti integreerumisel kromosoomi tekib heterosügoot, kus vaid üks GEEN Y alleel on funktsionaalne. Teine alleel ei ekspresseeru, sest selle promootorisse on integreerunud epitoobi järjestus koos selektsioonimarkeriga. Heterosügootsetesse rakkudesse transfomeeritakse Cre rekombinaasi ekspressiooniplasmiid. Cre rekombinaas eemaldab loxP järjestuste vahel paikneva selektsioonimarkeri. Lookusesse jääb alles üks loxP järjestus ja GEEN Y-ga samas lugemisraamis olev epitoobi järjestus. Saadud diploid sporuleeritakse ning analüüsitakse ühe diploidse raku järglasi kasutades tetraadide analüüsi. Tehakse kindlaks millised kaks kolooniat on moodustunud epitoobi järjestust omavatest rakkudest ja millised kaks on metsiktüüpi kolooniad.
Probleemülesanne II