Ülegenoomne geenidevaheliste interaktsioonide uuring
SGA ("synthetic genetic array") meetod võimaldab süstemaatiliselt konstrueerida topeltmutante ning analüüsida nende mutantide fenotüüpe. Meetod eeldab protsessi automatiseerimist: rakkude külvamiseks kasutatakse roboteid, rakkude kasvatamine toimub arvuti poolt juhitud kasvukambrites, fenotüüpide analüüs viiakse läbi vastava arvutiprogrammi poolt jne. Saadud tulemusi kontrollitakse pisteliselt tetraadide analüüsi või juhuslike spooride analüüsi kasutades.
Meetod koosneb 4 etapist (joonis 14):
1. Uuritava tüve ristatamine deletsioonimutantide kollektsiooniga
Uuritav tüvi on MAT
paardumistüübiga. Selles tüves on YFG1 deleteeritud dominantse selektsioonimarkeriga (näiteks nourseotritsiini resistentsusgeeniga natMX). Lisaks on selle tüve CAN1 lookusesse viidud reporter, mis sisaldab a-feromooni kodeeriva geeni promootori kontrolli all ekspresseeruvat HIS3 markergeeni (can1
::MFA1pr-HIS3). Uuritav tüvi on resistentne kanavaniini suhtes. Deletsioonimutantide kollektsiooni tüved on MATa paardumistüübiga. See kollektsioon sisaldab tüvesid, kus kõik mittehädavajalikud geenid on ükshaaval deleteeritud teise dominantse markergeeniga (näiteks genetitsiini resistentsusgeeniga kanMX). Ristamisel selekteeritakse moodustunud heterosügootsed diploidid söötmel, mis sisaldab mõlemat antibiootikumi - nourseotritsiini ja genetitsiini.
paardumistüübiga. Selles tüves on YFG1 deleteeritud dominantse selektsioonimarkeriga (näiteks nourseotritsiini resistentsusgeeniga natMX). Lisaks on selle tüve CAN1 lookusesse viidud reporter, mis sisaldab a-feromooni kodeeriva geeni promootori kontrolli all ekspresseeruvat HIS3 markergeeni (can1::MFA1pr-HIS3). Uuritav tüvi on resistentne kanavaniini suhtes. Deletsioonimutantide kollektsiooni tüved on MATa paardumistüübiga. See kollektsioon sisaldab tüvesid, kus kõik mittehädavajalikud geenid on ükshaaval deleteeritud teise dominantse markergeeniga (näiteks genetitsiini resistentsusgeeniga kanMX). Ristamisel selekteeritakse moodustunud heterosügootsed diploidid söötmel, mis sisaldab mõlemat antibiootikumi - nourseotritsiini ja genetitsiini.
2. Heterosügootsete diploidide sporulatsioon
Saadud heterosügootsed diploidid külvatakse sporulatsioonisöötmele. Diploidsed rakud läbivad meioosi ning sporulatsiooni käigus moodustuvad askused nelja askospooriga.
3. MATa haploidsete tüvede selektsioon
Spoorid külvatakse sünteetilisele söötmele, millest puudub histidiin. Sellel söötmel idanevad vaid MATa paardumistüübiga haploidsed spoorid, sest vaid nendes ekspresseerub reporter MFA1pr-HIS3. Selektsiooni tugevdamiseks lisatakse söötmesse kanavaniini. CAN1 metsiktüüpi geeni omavad rakud on kanavaniini suhtes tundlikud ning surevad. Vaid reporterit sisaldavad rakud, kellel on CAN1 lookus deleteeritud, on võimelised kanavaniini sisaldaval söötmel kasvama.
4. Topeltmutantide selektsioon
Haploidsed topeltmutandid selekteeritakse kahe dominantse markergeeni järgi. Rakud külvatakse nourseotritsiini ja genetitsiini sisaldavale söötmele. Sellel söötmel kasvavad vaid need rakud, kelle genoomis on nii yfg1 kui ka kollektsioonist saadud deletsioon xxx. Saadud topeltmutante kasutatakse fenotüüpide analüüsil.
kui ka kollektsioonist saadud deletsioon xxx. Saadud topeltmutante kasutatakse fenotüüpide analüüsil.
