Diploidsete rakkude isoleerimine
Kuigi Schizosaccharomyces pombe diploidsed rakud on ebastabiilsed, on neid võimalik siiski isoleerida (vt. Pärmigeneetika: pärmitüvede ristamine, juhuslike spooride analüüs, tetraadide analüüs). Diploidide kasvatamisel rikkal söötmel nad jagunevad mitootiliselt pooldumise teel (joonis 15). Sattudes lämmastikuallika nälga nad sporuleeruvad. Moodustunud askused omavad diploidse raku kuju ning on silindri kujulised. Neid askusi nimetatakse asügootsed askused.
Diploidsete rakkude isoleerimiskes kasutatakse:
- haploidse h- tüve ristamist mat2-102 mutandiga
- erinevaid selekstioonimarkereid omavate haploidsete h- ja h+ tüvede ristamist
- protoplastide eraldamist ja liitmist
Klassikaline diploidsete rakkude isoleerimine koosneb 3 etapist (joonis 16):
1. Haploidsete tüvede ristamine sporulatsioonitassil. Segatakse kokku erineva paardumistüübiga haploidsed rakud ning lastakse neil paarduda 12-24 tundi. Saadud ristamissegu koosneb haploidsetest rakkudest, diploidsetest rakkudest ja sügootsetest askustest.
2. Diploidsete rakkude selektsioon. Tekkinud diploidid selekteeritakse vastavate selektsioonimarkerite abil. Kõige sagedamini kasutatakse markergeenidena ade6 alleele: ade6.M210 ja ade6.M216.
Kui need alleelid esinevad rakus üksikult, siis haploidsed tüved on fenotüübilt Ade-. Rakkudes peatub adeniini biosünteesi rada ning nad vajavad minimaalsöötmel
kasvamiseks adeniini. Kui need kaks alleeli paiknevad samas rakus, siis toimub
geenisisene komplementatsioon. Selline diploid on fenotüübilt Ade+. Rakkudes taastub adeniini biosünteesi rada ning neid diploide saab selekteerida minimaalsöötmel, millest puudub adeniin.
3. Diploidsete rakkude eraldamine. ade6 alleelide kasutamisel tuleb selektsioon läbi viia minimaalsöötmel. Diploidse koloonia keskel olevad rakud satuvad nälga ning nad sporuleeruvad. Diploidsete rakkude eristamiseks külvatakse rakud rikkale söötmele, millele on lisatud värvainet Phloxin B. Diploidsed rakud moodustavad tumeroosa värvusega kolooniaid, haploidsete rakkude poolt moodustunud kolooniad on aga heleroosa värvusega. Edaspidi kasvatatakse isoleeritud diploide rikkal söötmel, et takistada sporuleerumist.
