TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT GENEETIKA ÕPPETOOL Triin Korb Biodegradatiivse potentsiaaliga mikroobikooslused Eesti graptoargilliidist Magistritöö Juhendaja PhD Anne Menert TARTU 2016 Biodegradatiivse potentsiaaliga mikroobikooslused Eesti graptoargilliidist Eesti aluspõhjas olevad suhteliselt kõrge orgaanilise aine sisaldusega kivimid (nt graptoliitargiliit) on elupaigaks mikroorganismidele. Metallid esinevad argilliidis kas sulfiidsete mineraalidena või on metallorgaaniliste ühendite koosseisus. Metallorgaaniliste komplekside mikrobioloogilise lagundamise kohta kivimites on andmeid vähe. Kivimites elavate mikroorganismide biodegradatsioonivõime ja liigilise koosseisu põhjalik tundmine võimaldab selgitada argilliidi kompleksse kasutuselevõtu võimalusi. Käesoleva eesmärk ongi iseloomustada argilliidi orgaanilist komponenti lagundavat mikroobikooslust ja selgitada isoleeritud mikroorganismide võimekust seda protsessi läbi viia. Töö teadusala CERCS kood: B230 Mikrobioloogia, bakterioloogia, viroloogia, mükoloogia T490 Biotehnoloogia Märksõnad: biodegradatsioon; metanogenees; graptoliitargilliit; geoporfüriinid. Microbial consortia with biodegrading potential from Estonian graptolite argillite Estonian basement minerals with relatively high content of organic matter (e.g. graptolite argillites) are habitat for microorganisms. Metals are in argillite as sulfides or in the composition of organometallic compounds. The microbial decomposition of organometallic complexes is less known. The project examines impact of microorganisms on argillite degradation from the viewpoint of organic matter decomposition. In-depth knowledge of biodegrading potential and species composition of inherent microorganisms in minerals offers complex deployment options for argillite. The aim of this thesis is to characterize the biodegradative microbial communities of argillite organic component and to explain their capability to carry out this process. CERCS research specialization: B230 Microbiology, bacteriology, virology, mycology T490 Biotechnology Keywords: biodegradation; geoporpyrins; graptolite argillite; methanogenesis. 2 Sisukord KASUTATUD LÜHENDID ...................................................................................................... 5 SISSEJUHATUS ........................................................................................................................ 6 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ................................................................................................. 7 1.1 Biogaas ja anaeroobse lagundamise tehnoloogia .............................................................. 7 1.1.1 Anaeroobne lagunemine ja selles osalevad mikroorganismid ................................... 8 1.2 Metallide bioleostamine .................................................................................................. 20 1.2.1 Metallisulfiidide bioleostamine ................................................................................ 21 1.2.2 Metallorgaaniliste ühendite biodegradatsioon ......................................................... 24 1.3 Graptoargilliit .................................................................................................................. 26 1.4 Graptoliitargilliidi lõhustamine mikroobikoosluse abil koos kaasneva metallide leostumisega .......................................................................................................................... 28 1.4.1. Gaasi eraldumine argilliidiproovidest ..................................................................... 29 2. TÖÖ EESMÄRK .................................................................................................................. 32 3. MATERJALID JA MEETODID .......................................................................................... 32 3.1 Katsemetoodika .............................................................................................................. 32 3.1.2 Substraat ja söötmed................................................................................................. 33 3.1.3 Inokulum .................................................................................................................. 34 3.1.4 Katseplaan ................................................................................................................ 34 3.2 Analüüsimetoodika ......................................................................................................... 37 3.2.1 Meetodid kasvukeskkonnast eralduvate gaasiliste produktide uurimiseks. ............. 37 3.2.2 Mikrobioloogilise analüüsi meetodid ....................................................................... 40 4. TULEMUSED ...................................................................................................................... 44 4.1. Fakultatiivsete anaeroobide isoleerimine ....................................................................... 44 4.1.1 Isolaatide kirjeldus biokeemiliste testide põhjal ...................................................... 44 4.1.2 Isolaatide kirjeldus 16S rRNA analüüsi põhjal ........................................................ 46 4.1.3 Identifitseeritud tüvede kirjeldused kirjanduse põhjal ............................................ 47 4.2. Selekteeritud isolaatide toime argilliidi orgaanilise osa lagundamisele ........................ 50 3 4.2.1 Isoleeritud mikroorganismide mõju gaasi eraldumisele argilliidist ......................... 51 4.2.2 Gaasiliste metaboliitide kontsentratsioonide muutused kultiveerimiskatses ........... 52 4.2.4 Mikroorganismide arvukus, metaani teke ja söötme pH .......................................... 55 5. ARUTELU ........................................................................................................................... 57 6. JÄRELDUSED ..................................................................................................................... 60 7. KOKKUVÕTE ..................................................................................................................... 61 8. SUMMARY ......................................................................................................................... 62 KASUTATUD KIRJANDUS .................................................................................................. 65 KASUTATUD VEEBIAADRESSID ...................................................................................... 71 LIHTLITSENTS ....................................................................................................................... 77 LISAD ...................................................................................................................................... 73 4 KASUTATUD LÜHENDID G '0 standardne Gibbsi vabaenergia muut ARGCON5 argilliidi metallorgaanilisi komplekse lagundav mikroobikooslus, mis on deponeeritud mikroobitüvede kollektsiooni CELMS CELMS Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudi juures asuv mittemeditsiinilise päritoluga looduslike ja laboratoorsete mikroobitüvede kollektsioon inok inokulum KA kuivaine (TS - total solids) KA% proovi kuivaine sisaldus, massi% msubs substraadi mass, g nbiogaas kumulatiivne biogaasi kogus, mmol nCH4,subs ainult substraadi lagunemisel eraldunud biometaani kogus, mmol nCH4,subs/OS substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus orgaanilise süsiniku massi kohta, mmol/g LA nCH4,t kumulatiivne biometaani kogus, mmol nsubs ainult substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biogaasi kogus, mmol nsubs/OS substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biogaasi kogus orgaanilise süsiniku massi kohta, mmol/g LA OS orgaaniline süsinik OS% proovi orgaanilise süsiniku sisaldus, %. Psum,t kumulatiivne rõhk reaktoris, hPa R universaalne gaasikonstant, cm3 kPa K-1 mol-1 ROS reaktiivsed hapnikuühendid T temperatuur, K VCH4,A substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus argilliidi massi kohta, m3/t MM VCH4,OS substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus orgaanilise süsiniku kohta, m3/t LA xCH4 metaani moolosa biogaasis 5 SISSEJUHATUS Inimkonna arvukuse plahvatuslik kasv ja erinevate tehnoloogiavahendite kasutamine on suurendanud oluliselt nõudlust viimaste järele. Valitsused soovivad parandada oma riigi elanike heaolu, kusjuures erinevaid tehnoloogiatooteid peetakse hea ja „normaalse“ elatustaseme elementaarseks ja lahutamatuks osaks. Eestiski unistatakse juba pikemat aega meie oma „Nokiast“, mis tõstaks elatustaseme vähemalt Soome riigiga samale tasemele. Paraku on need otsingud seni sarnanenud Pipi Pikksuka „spungi“ otsingutega... Tehnoloogiavahendid sisaldavad toimimiseks vajalikke metalle, sh väärismetalle, mille looduslikud varud on tavametallidest väiksemad. Suurenev nõudlus tehnoloogiavahendite järele tingib ka suurenenud metallidevajaduse. Kõrgema metallidesisaldusega maagivarud on ammendumas, mistõttu tuntakse aina enam huvi vähemkvaliteetsete ja raskemini töödeldavate maakide vastu. Üheks selliseks on must kilt ehk graptoliitargilliit, mida leidub suurtes kogustes ka Eestis ja mis sisaldab U, Mo, Va, Pb, Zn, Re, Ni kümme korda rohkem kui maakoores keskmiselt. Nimetatud metallide sisaldused jäävad siiski liiga madalaks, et neist iga üksikut oleks mõistlik eraldi kaevandada, mitut neist korraga aga küll. Metallid esinevad argilliidis kas sulfiidsete mineraalidena (nt FeS2, PbS) või on metallorgaaniliste ühendite (geopolümeeride) koosseisus. Metallide bioleostamine sulfiidsetest mineraalidest on juba kasutuses olev tehnoloogia, kuid metallide bioloogiline eraldamine metallorgaanilisi ühendeid sisaldavatest mineraalidest veel mitte. Argilliidi orgaanilise osa lagundamist anaeroobsetes tingimustes heterotroofsete mikroorganismide ja metanogeenide abil uuritakse Eestis Tartu Ülikoolis koostöös firmaga BiotaP OÜ. Tehtud on esimesed mikroobikoosluse liigilise koosseisu analüüsid ja katsetatud selle koosluse võimet argilliidi orgaanilist komponenti lagundada; käesolev töö on osa nendest uuringutest. Töö eesmärgiks on seega iseloomustada argilliidi loomulikus mikroobikoosluses olevaid ja selle orgaanilist komponenti lagundavaid fakultatiivselt anaeroobseid mikroorganisme ning selgitada isoleeritud mikroorganismide võimekust seda protsessi läbi viia. Märksõnad: biodegradatsioon, metanogenees, graptoliitargilliit, geoporfüriinid. 6 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Biogaas ja anaeroobse lagundamise tehnoloogia Biogaasi toodetakse biolagunevate materjalide anaeroobsel lagundamisel mikroorganismide abil ja selle peamised koostisosad on toodud tabelis 1. Tabel 1. Biogaasi keskmine koostis (Normak et al, 2009) Koostisosa Kontsentratsioon Metaan (CH4) 50 – 75 mahu% Süsinikdioksiid (CO2) 25 – 45 mahu% Divesiniksulfiid (H2S) 20 – 20 000 ppm Vesi (H2O) 2 – 7 mahu% (20-40°C) Hapnik (O2) <2 mahu% Lämmastik (N2) <2 mahu% Vesinik (H2) <1 mahu% Anaeroobsel lagundamisel tekib kõige rohkem metaani, mistõttu nimetatakse biogaasi tekke protsessi ka metaankääritamiseks. See on mitmete biokeemiliste reaktsioonide kompleksne protsess, erinevate anaeroobsete protsesside sümbioos, mille käigus multimolekulaarsed orgaanilised substraadid lagundatakse lihtsateks ühenditeks. (Biogaas, Wikipedia) Protsessi viivad rangelt anaeroobsetes tingimustes läbi kaks bioloogilist riiki: bakterid ja arhed. Looduses esineb seda protsessi näiteks rabades, soodes, järvedes, kuumaveeallikates, prügilates, ookeanides ja loomade soolestikus. (Merlin Christy et al, 2014) Kui samad tingimused luua tehislikult biogaasi kääritis, st temperatuur vähemalt 37°C, anaeroobne keskkond ja piisava koguse biomassi olemasolu, siis saab nimetatud gaasi tehislikult toota ja kasutada kütusena. Biogaasi kütteväärtus jääb enamasti vahemikku 5-7 kWh/Nm3.(Biogaas, Energiatalgud) Anaeroobse lagundamise protsessis on olulised mitmed keskkonnatingimused, mille sobivusest sõltuvad reaktsioonide toimumine ja biogaasi teke. Hapniku kontsentratsioon reaktoris peaks olema võimalikult väike, et tagada mikroobidele anaeroobsed elutingimused. Protsess võib toimuda erinevatel temperatuuridel, kas mesofiilses (t = 32–42ºC) või termofiilses (t = 50–57ºC) reaktoris. Kõige levinumad on mesofiilsed reaktorid, kus on tagatud kõrge gaasi produktsioon ja tootmisprotsessi stabiilsus suhteliselt madala reaktori 7 kütmisvajaduse juures. Lisaks tuleb jälgida pH väärtust, piisava koguse substraadi olemasolu ja võimalike inhibiitorite (ammooniumioon NH +4 , divesiniksulfiid H2S, raskmetallid jt) kontsentratsiooni. (Biogaas, Wikipedia) 1.1.1 Anaeroobne lagunemine ja selles osalevad mikroorganismid Metaankäärimine jaguneb neljaks faasiks – hüdrolüüs, fermentatsioon e. atsidogenees, atsetogenees ja metanogenees ning selle üldine skeem on esitatud joonisel 1. Kompleksne orgaaniline aine Süsivesikud Valgud Lipiidid Fakultatiivsed anaeroobsed bakterid Hüdrolüüs Monosahhariidid Aminohapped Pika ahelaga rasvhapped Atsidogeensed Atsidogenees bakterid Propionaat, butüraat, valeraat Atsetog enees (alkoholid, laktaat) Atsetogeensed bakterid Atsetaati oksüdeerivad bakterid Atsetaat H2, CO2 Homoatsetogeensed bakterid CH , CO Metanogeensed 4 2 arhed Metano genees Joonis 1. Anaeroobse lagunemise põhimõtteline skeem koos selles osalevate mikroorganismidega. See on mitmete biokeemiliste reaktsioonide kompleksne protsess, erinevate anaeroobsete protsesside sümbioos, mille käigus multimolekulaarsed orgaanilised substraadid lagundatakse lihtsateks ühenditeks. (Merlin Christy et al, 2014) 8 1.1.1.1 Hüdrolüüs Anaeroobse lagunemise esimene etapp on kogu lagundamisprotsessi kiirust limiteeriv hüdrolüüs, mille käigus lõhustatakse lahustumatud polümeriseerunud orgaanilised ühendid, nagu süsivesikud, rasvad, valgud, väiksemateks molekulideks: suhkruteks, rasvhapeteks, aminohapeteks (võrrand 1.1). C6H10O4 + 2H2O → C6H12O6 + 2H2 (1.1) Hüdrolüüsi teostavad obligatoorsed ja /või fakultatiivsed anaeroobid ekstratsellulaarsete hüdrolaaside (amülaaside, proteaaside, lipaaside) abil. Nendeks mikroorganismideks on hõimkonnast Firmicutes liigid perekondadest Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Selenomonas, Acetivibrio, Ruminococcus; hõimkonnast Bacteroidetes liigid perekonnast Bacteroides; hõimkonnast Actinobacteria liigid perekonnast Micrococcus ning hõimkonnast Proteobacteria liigid perekondadest Enterobacterium ja Pseudomonas. Hüdrolüüsi teostavad bakterid viivad läbi ka järgmist faasi – atsidogeneesi. (Shah et al, 2014; Merlin Christy et al, 2014) 1.1.1.2 Atsidogenees Atsidogenees on kiire happemoodustumise faas, milles happebakterid muudavad vees lahustunud (sh ka hüdrolüüsil tekkinud) ühendid lühikeseahelalisteks (lenduvateks) orgaanilisteks hapeteks (äädikhape, propaanhape, butüürhape, pentaanhape, sipelghape), alkoholideks (etanool, metanool), aldehüüdideks, süsinikdioksiidiks, vesinikuks. Põhiline atsidogeneesi rada on atsetaadi, CO2 ja H2 kaudu, kusjuures ülejäänud atsidogeneesi produktide roll on tühine (võrrandid 1.2-1.4). (Shah et al, 2014; Merlin Christy et al, 2014) C6H12O6 ↔ 2CH3CH2OH + 2CO2 (1.2) C6 H12O6 + 2H2 ↔ 2CH3CH2COOH + 2H2O (1.3) C6H12O6 → 3CH3COOH (1.4) Neid produkte saavad metanogeenid substraadi ja energiaallikana otse kasutada. Vesiniku kontsentratsiooni suurenemise vastusena akumuleerivad bakterid laktaati, etanooli, propionaati, butüraati ja kõrgemaid lenduvaid rasvhappeid, mida metanogeenid ei saa otse kasutada. Neid konverteeritakse atsetogeneesis. Atsidogeneesi bakterid (atsidogeenid) 9 kasutavad ära ka juhuslikult tekkinud hapniku, luues soodsa keskkonna obligatoorsetele anaeroobidele. (Shah et al, 2014) Atsidogeneesi viivad läbi erinevad fakultatiivsed anaeroobid – Clostridium sp., Enterobacteriaceae, Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Propionibacterium ja Clostridium propionicum (Insam et al, 2010) ja obligatoorsed anaeroobid – peamiselt Clostridium nii mesofiilses kui termofiises süsteemis, aga ka Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium (Shah et al, 2014), Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus, Escherichia coli, Salmonella (Merlin Christy et al, 2014). 1.1.1.3 Atsetogenees Vesiniku suurenev kontsentratsioon reaktsioonikeskkonnas põhjustab metanogeenide poolt mittetarbitavate elektronide allikate (laktaat, etanool, propionaat, butüraat ja kõrgemad lenduvad happed) akumuleerumise. Neid lagundavad edasi atsetogeensed bakterid (atsetogeenid) ja seda protsessi nimetatakse atsetogeneesiks (Insam et al, 2010) e. käärimisfaasiks, milles bakterid perekondadest Syntrophomonas, Syntrophobacter, Clostridium ja Acetobacterium muudavad pikema ahelaga orgaanilised happed ja alkoholid äädikhappeks, CO2- ks ja molekulaarseks vesinikuks H2. (Kriipsalu et al, 2016). Atsetogeenid saavad kasutada erinevaid elektroni doonoreid (süsivesikud, lühikeseahelalised rasvhapped, alkoholid...) ja aktseptoreid (CO2, fumaraat, püruvaat, prootonid) ja seega tekitada mitmeid produkte peale atsetaadi (võrrandid 1.5.-1.10). (Insam et al, 2010; Merlin Christy et al, 2014) C6H12O6 + 2H2O ↔ 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 (1.5) CH3CH2OH + 2H2O ↔ CH3COO - + 2H2 + H + (1.6) CH CH COO- + 3H O → CH COO- + HCO - + H+ + 3H 3 2 2 3 3 2 G ' 0 = +76 kJ/reakts. (1.7) CH3(CH2) 2COO - + 2H2O → 2 H - 3CH2COO + H + +2H '2 G0 = +48 kJ/reakts. (1.8) 2HCO -3 + 4H + 2 + H ↔ CH - 3COO + 4H2O G ' 0 = −105 kJ/reakts. (1.9) CH -2COO + 4 H2O → H2 + 2HCO - 3 + H + G '0 =+105 kJ/reakts. (1.10) Atsetogeenid on ranged anaeroobid, kes kasvavad aeglaselt ja on tundlikud orgaanilise aine sisalduse kõikumiste ja keskkonnatingimuste muutuste suhtes (Merlin Christy et al, 2014). Atsetogeenid on fülogeneetiliselt mitmekesised, kuid enamus neid klasterduvad madala G+C sisaldusega hõimkonna Firmicutes harusse. Enamus atsetogeenseid liike hõlmavad perekonnad, sh Clostridium, Eubacterium või Ruminococcus, sisaldavad ka mitteatsetogeenseid liikmeid. (Insam et al, 2010) Methanobacterium suboxydans lagundab 10 pentaanhappe propioonhappeks; Methanobacterium propionicum lagundab propioonhappe atsetaadiks. (Ziemiński, 2012) Elektroni aktseptorina võidakse kasutada ka sulfaate (Syntrophobacter, Desulfotomaculum). Desulfovibrio osaleb koos perekonnaga Metanobacterium sulfaate ja laktaati kasutades atsetaadi ja H2 tootmises. (Ziemiński, 2012) Mõned atsetogeneesi reaktsioonid (võrrandid 1.7, 1.8 ja 1.10) on standardtingimustel termodünaamiliselt ebasoodsad (Insam et al, 2010), sest reaktsiooniprodukt H2 inhibeerib oksüdatsiooni ja on atsetogeenidele toksiline. Reaktsioonid saavad toimuda vaid madalal H2 osarõhul (Ostrem, 2004). Syntrophomonas, Syntrophospora, Syntrophobacter oksüdeerivad propionaati ja butüraati, kasutades H+ elektroni aktseptorina (Ostrem, 2004, Plugge et al, 2009), kuid vajavad selleks H2 tarbivaid metanogeenseid arhesid, homoatsetogeene või teisi H2 tarbijaid (k.a. sulfaadi redutseerijaid) (Angelidaki et al, 2011). Mõned atsetogeenid (homoatsetogeensed bakterid) konkureerivad metanogeenidega substraatide – H2, metanaat ja metanool – pärast. (Angelidaki et al, 2011), kuid enamasti esineb atsetogeensete bakterite (H2 tootjate) ja metanogeensete arhede (H2 tarbijate) vahel süntroofia – kahe erineva metabolismiga mikroobide sümbioos, mis võimaldab erinevaid substraate lagundada ja on anaeroobses protsessis kriitilise tähtsusega. (Ziemiński, 2012, Angelidaki et al, 2011) butüraat kaproaat metanogeenid propionaat Joonis 2. Rasvhapete metabolism atsetogeenide ja metanogeenide süntroofia käigus. (Ziemiński, 2012) Süntroofsed atsetaati oksüdeerivad bakterid võivad atsetaadi konverteerida ka CO2-ks ja H2- ks. Neid leidub nii mesofiilsetel (Clostridium ultunense ja Syntrophaceticus schinkii) kui ka termofiilsetel (Thermacetogenium phaeum ja Thermotoga lettingae) tingimustel. Süntroofsed bakterid toodavad oma metabolismis alkohole ja rasvhappeid lagundades substraadipõhise fosforüleerimise või oksüdeerimise abil ATP-d. (Shah et al, 2014) 11 Atsetogenees määrab biogaasi tootmise efektiivsuse, sest ca 70% metaanist moodustub atsetaadi redutseerumisel. Seetõttu on atsetaat kõige olulisem vaheühend metaankäärimise protsessis. (Shah et al, 2014) Ülejäänud 30% moodustub vesinikust, CO2-st või formaadist (Angelidaki et al, 2011). 1.1.1.4 Metanogenees Metanogeneesi käigus konverteeritakse atsetogeneesi produktid metanogeensete mikroorganismide poolt metaaniks ja CO2-ks. Metanogeensed mikroorganismid klassifitseeruvad arhede domeeni Euryarchaeota gruppi (joonis 3), nad on rangelt anaeroobsed kemolitotroofid, väga tundlikud temperatuuri ja pH muutustele (optimaalne pH 6,8-7,2). Nende seas on nii psühro-, meso- kui ka termofiilseid liike. Nad on väga mitmekesise morfoloogiaga, suurusega 0.3 kuni 7.4 𝜇m. (Shah et al, 2014) Joonis 3. Domeenid fülogeneesi puul (https://et.wikipedia.org/wiki/Domeen_%28bioloogia%29) Metanogenees võib toimuda mitut rada pidi (vt tabel 2). Tabel 2. Tüüpilised metanogeenide poolt läbiviidavad reaktsioonid metanogeneesis ja nendele vastavad Gibbsi vabaenergiad, ∆G˚ (kJ mol-1 reaktsioon). (Zhuang 2014) 12 Hüdrogenotroofsel metanogeneesil kasutavad mikroobid ainult CO2 ja H2 : CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O (1.11) Selles osalevad mikroobid seltsidest Methanobacteriales ja Methanomicrobiales nii mesofiilses kui termofiilses süsteemis ning liigid perekonnast Methanosarcina. Süntroofne atsetaadi oksüdatsioon koos hüdrogenotroofse metanogeneesiga on ülekaalus orgaaniliste hapete akumuleerumisel, termofiilses keskkonnas, kõrgel ammooniumi kontsentratsioonil. (Shah et al, 2014) Atsetoklastilisel metanogeneesil kasutavad mikroobid atsetaati: CH3COOH → CH4 + CO2 (1.12) Atsetoklastilisel metanogeneesil osalevateks mikroobideks on liigid perekondadest Methanosarcina (domineerivad kõrgema atsetaadi kontsentratsiooni juures) ja Methanosaeta (domineerivad madala atsetaadi kontsentratsiooni juures). (Plugge et al, 2009) Mesofiilsetel tingimustel on soodustatud atsetoklastiline metanogenees. (Shah et al, 2014) Üle 70% biometaanist tekib atsetaadi konversioonil, mistõttu on ka enamus biogaasi reaktoreid mesofiilidele sobiva temperatuuriga. Joonis 4. Atsetogeenide ja metanogeenide süntroofia anaeroobses reaktoris. SAB Clostridium sp, HM – põhiliselt Metanobacteriales ja Methanomicrobiales (Shah et al, 2014). Metülotroofsel metanogeneesil on substraatideks metüleeritud C1 ühendid, nt metanool, metüülamiinid või dimetüülsulfiidid. Mitmete uuringute põhjal pärineb metanoolist vähem kui 5- 10% kogu metanogeneesist. 4CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O 1.13 13 Metülotroofsel metanogeneesil osalevad liigid perekonnast Methanosarcina, nt Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Methanolobus zinderi (obligatoorne metülotroof) (Penger et al, 2012). Tabel 3. Metanogeensete arhede omadused ja võimalikud substraadid (Ziemiński 2012). Liik Substraadid Optimaalne Optimaalne temperatuur pH (C) Methanobacterium Brytanii H2/CO2 37 6,9-7,2 Methanobacterium formicum H2/CO2, formaat 37-45 6,6-7,8 Methanobacterium thermoalcaliphilum H2/CO2 58-62 8,0-8,5 Methanotermobacter thermoautotrophicum H2/CO2 65-70 7,0-8,0 Methanotermobacter wolfii H2/CO2 55-65 7,0-7,5 Methanobrevibacter smithii H2/CO2, formaat 37-39 - Methanobrevibacter ruminatium H2/CO2, formaat 37-39 - Methanothermus fervidus H2/CO2, formaat 83 <7,0 Methanothermococcus thermolithotrophicus H2/CO2, formaat 65 - Methanococcus voltaei H2/CO2, formaat 35-40 6,0-7,0 Methanococcus vannilelii H2/CO2, formaat 65 7-9 Methanomicrobium mobile H2/CO2, formaat 40 6,1-6,9 Methanolacinia paynteri H2/CO2 40 7,0 Methanospirillum hungatei H2/CO2, formaat 30-40 - Methanosarcina acetivorans metanool, atsetaat 35-40 6,5 Methanosarcina barkeri H2/CO2, metanool, 35-40 5-7 atsetaat Methanosarcina mazeii metanool, atsetaat 30-40 6-7 Methanosarcina thermophila H2/CO2, metanool, 50 6-7 atsetaat Methanococcoides methylutens metanool 42 7,0-7,5 Methanosaeta consilii atsetaat 35-40 7,0-7,5 Methanosaeta thermophila atsetaat 55-60 7 Metallid metanogeneesis Metanogenees on üks metalliderikkamaid ensümaatilisi radu bioloogias. Täpne metallide vajadus võib, olenevalt rajast erineda, kuid üldine tendents on sarnane: kõige enam vajab metanogenees Fe, seejärel Ni ja Co ning väiksemas koguses Mo (ja/või W) ja Zn. Vähene Fe, Ni ja Co saadavus limiteerib metanogeneesi nii puhas- kui segakultuuris. (Glass & Orphan, 2012). 14 Koensüüm F430 Metanopteriin Joonis 5. Mõned koensüümid ja prosteetilised rühmad metanogeneesis (coenzymes and prosthetic groups of methanogenes) (Scheller et al, 2010; Ziemiński, 2012). Fe vajadus metanogeneesis on tohutu – peaaegu iga ensüüm rajas sisaldab mitut Fe2S2, Fe3S4, või Fe4S4 klastrit. Joonis 6. Metallide sisaldus metalloensüümides kolmes metanogeneesi rajas: H2/CO2 (mustad nooled), atsetoklastiline (rohelised nooled) ja metülotroofne (sinised nooled). Iga täpp tähendab metalliaatomit. (Glass & Orphan, 2012) 15 Liigid perekonnast Methanosarcina liigid on biogaasi tootmises väga olulised: nad on võimelised kasutama nii hüdrogenotroofset kui atsetoklastilist rada ehk nii CO2, H2 kui ka atsetaati, lisaks võimelised kasutama metanooli ja metüülamiine, on suurema kasvukiirusega (poolestusaeg 1-1,2 päeva) kui teised metanogeenid (poolestusaeg 4-6 päeva), on pH suhtes vähem tundlikud ja taluvad kõrgemat ammooniumi kontsentratsiooni (Shah et al, 2014). Samas on andmeid, et mõned hüdrogenotroofsed metanogeenid (Methanospirillum hungatei, Methanoculleus receptaculi) on kiirema kasvuga (poolestusaeg kuni 6h) kui mõned atsetoklastilised metanogeenid (Methanosarcina thermophila) (poolestusajaga 2,6 päeva). (Merlin Christy et al, 2014) Perekonna Methanosarcina mitmekesise metabolismi oletatav põhjus Atsetoklastiline metanogenees algab metanogeensetel arhedel atsetaadi aktiveerimisega atsetüülkoensüüm A-ks. Methanosaetaceae sugukonna liikmed kasutavad selleks üheastmelist atsetüül-CoA süntaasi (ACS) rada, kuid perekond Methanosarcina liikmed kaheastmelist atsetaatkinaasi (AckA)-fosfoatsetüültransferaasi (Pta) rada. AckA/Pta rada (võrrand 1.14) on energeetiliselt tõhusam, vajades ainult ühte ATP molekuli ühe atsetaadi molekuli aktiveerimiseks: (Rothman et al, 2014) 1.14 1.15 (Fournier & Gogarten, 2007) ACS rada (võrrand 1.15) vajab selleks kahte ATP molekuli (Rothman et al, 2014) konverteerides ATP, CoA ja atsetaadi atsetüül-CoA-ks ja pürofosfaadiks (PPi). (Berger et al, 2012) Methanosarcina tõhusam rada arenes pärast Kesk-Ordoviitsiumi maismaa soontaimede evolutsiooni – 450-500 miljon aastat (Ma) tagasi üheainsa horisontaalse geeniülekande sündmuse tagajärjel, tõenäoliselt tsellulolüütilistelt Clostridia bakteritelt. Hilis-Permis, umbes 252,28 (Ma) tagasi, leidis aset suurim organismide väljasuremine Maal (Rothman et al, 2014), kui kadus umbes 95% mereliikidest ja 75% mandriliikidest. (Shen & Bowring, 2014). Samal ajastul, Hilis-Permis toimus AckA/Pta horisontaalne ülekanne Methanosarcina perekonna siseselt. Vahetult enne väljasuremist toimus Maal suurim teadaolev vulkaaniline sündmus, Siberi vulkanism, mis vabastas metanogeneesiks hädavajalikku kofaktori Ni, võimaldades metanogeenide arvukuse kiiret kasvu. Selle tulemusena suurenes plahvatuslikult metaani tase, 16 tõusis süsihappegaasi ja vähenes niigi madal hapniku tase, ookeanid hapestusid. Anaeroobne metaani oksüdeerimine võis suurendada ka sulfiidide tasemeid, tõenäoliselt vabastades atmosfääri toksilist vesiniksulfiidi. (Rothman et al, 2014) Anaeroobse metanogeense mikrobioomi mitmekesisust mõjutavad: • keskkond – temperatuur, pH, substraadi tüüp, metaboliidid (lenduvad rasvhapped, NH3, H2S jne) • uute liikide ilmumine. Hüdrolüütilised, atsetogeensed ja metanogeensed prokarüoodid erinevad oluliselt füsioloogia, toitumisvajaduste, kasvukineetika ja keskkonnatingimustele tundlikkuse poolest. Atsidogeensete ja metaani tootvate mikroorganismide vahelise tasakaalu puudumine on peamine biogaasi reaktori ebastabiilsuse põhjus. (Braun et al, 2010) Biogaasi mikroobikooslusi moodustavad bakterite domeenist peamiselt hõimkonnad Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Chloroflexi ja arhede domeenist rühma Euryarchaeota metanogeenid. Rasvarikas substraat soodustab Thermosediminibacter litoperuensis esinemist. Kõrgem orgaanika sisaldus soodustab hõimkonna Firmicutes liikide domineerimist. Mesofiilsetel temperatuuridel domineerivad hõimkonnad Bacteroidetes ja Chloroflexi. (Carballa et al, 2015) Metaboliidid, nagu lenduvad rasvhapped, NH3, H2S häirivad tihti metaankääritamist. Metaani teket võib mõjutada nii lämmastiku puudus kui liig. NH3 difundeerub vabalt rakku, põhjustades prootonite tasakaalu muutust ja/või kaaliumi puudust. (Braun et al, 2010) Hõimkonnast Firmicutes klassi Clostridia liigid panustavad valkude ja tselluloosi lagundamisse, klassi Bacilli liigid lagundavad rasvu ja süsivesikuid. Hõimkondade Bacteroidetes and Proteobacteria liigid on ära mainitud olulistena tahkete jäätmete põhistes reaktorites. (Carballa et al, 2015) Kolm põhilist mikroobikoosluse säilimise mehhanismi Anaeroobsete reaktorite haldamisel on vaja teada, kuidas reageerivad mikroobikooslused protsessi ja keskkonna häiretele. Funktsionaalse stabiilsuse ja efektiivsuse säilitamises mängivad olulist rolli kolm ökoloogilist parameetrit:  mikroobikoosluse mitmekesisus  mikroobikoosluse struktuuri ühtlus  mikroobikoosluse dünaamika ajas. 17 Kuigi on ka vähese mitmekesisusega reaktoreid, mis töötavad stabiilsetel tingimustel (nt. sellised, mis töötlevad lihtsaid substraate või töötavad kõrgel temperatuuril), võimaldab funktsionaalselt mitmekesine mikroobikooslus iga troofilise astme paralleelsete radade toimimist. Seepärast on suur mitmekesisus tihti korrelatsioonis hästitoimiva anaeroobse reaktoriga. Selle seletuseks on anaeroobse mikrobioomi vastupidavus, paindlikkus ja funktsionaalne redundantsus kui kolm põhilist mikroobikoosluse säilimise mehhanismi:  Vastupidavus (ingl. k. resistance) – populatsioon võime muutustele vastu pidada ilma, et kooslus muutuks, tuumikmikrobioom.  Paindlikkus (ingl. k. resilience) – populatsiooni võime taastuda pärast häirimist. Nt süntroofsed kooslused – üldkoosluses on vähemuses, kuid oma funktsioonile äärmiselt spetsialiseerunud st. süsteemi taastumine sõltub nende taastumisest.  Funktsionaalne redundantsus – uus populatsioon asendab vana, kuid funktsioon jääb samaks, mis eelmisel, nt hüdrolüütilised-fermentatiivsed kooslused. Arhed on vähem mitmekülgsed, metaboolselt aeglasemad ja vähem paindlikud kui bakterid, seega metanogenees on tundlikum stressi ja ebastabiilsuse suhtes. Metanogeenide seas võiksid olla: Methanobacteriales – vastupidavad; Methanosaeta – redundantsed; Methanosarcina ja Methanomicrobiales - paindlikud ja redundantsed. Nende kolme tüüpi mikroobipopulatsioonide kombineerimine tagab igakülgse funktsionaalse stabiilsuse ja võimaldab mikroobikooslusel toime tulla keskkonnastressi või protsessi kõrvalekalletega. (Carballa et al, 2015) Joonis 7 kujutab anaeroobse mikrobioomi reaktsiooni häiretele, kus  Hüdrolüüsi-fermentatsiooni häirimine ei mõjuta reaktori toimimist tänu mikroorganismide funktsionaalsele redundantsusele (orgaanilise aine lagundamine on konstantne);  Atsetogeneesi-süntroofia häirimine (atsetaadi kuhjumine) mõjutab reaktori toimimist, kuid populatsioon taastub tänu mikroorganismide paindlikkusele;  Metanogeneesi häirimine mõjutab samuti reaktori toimimist (metaani teke vähenenud), kuid protsess taastub tänu mikroorganismide paindlikkusele ja funktsonaalsele redundantsusele;  Resistentsed mikroorganismid esinevad eeldatavasti kõigis staadiumites. 18 Joonis 7. Anaeroobse mikrobioomi reaktsioon häiretele (selgitused tekstis) (Carballa et al, 2015). Argilliidi orgaanilise aine lagunemise mehhanism Sügavate pinnasekihtide orgaanikarikkad kihistud nagu kildad ja söelademed, kus terminaalseid elektronaktseptoreid on limiteeritult, esindavad ühte elu piiriala. Selles anaeroobses keskkonnas lagundab mikroobide konsortsium raskesti lagundatava orgaanilise materjali CO2-ks ja atsetaadiks, mille metanogeenid metaboliseerivad looduslikuks (ehk biogeenseks) gaasiks. Geopolümeeride biodegradatsiooni etappide ja nendes osalevate mikroorganismide uuringud on algusjärgus. Joonisel 8 on toodud kilda orgaanilise aine võimalikud biodegradatsiooni etapid ja nendega seotud ning metaani tekkeks vajalikud ühendid. Kilda ligniinilaadsest orgaanilisest ainest (kerogeenist) tekivad pikaahelalised alkaanid, ühe benseenituumaga aromaatsed ühendid ning polütsüklilised aromaatsed ühendid jms., mis kõik lagundatakse butüraadiks ja propionaadiks, need edasi atsetaadiks ja lõpuks metaaniks. (Schlegel et al, 2013) Domineerivaks rajaks on atsetoklastiline metanogenees (joonis 8). 19 Joonis 8. Kildas sisalduvate geopolümeeride biodegradatsiooni mehhanism. (Schlegel et al, 2013; Kutschke 2015) Kildas sisalduvate geopolümeeride biodegradatsiooni mehhanismi on selgitanud Kutscke 2015 ja sellest on juttu alljärgnevas metallide bioleostamist käsitlevas peatükis. 1.2 Metallide bioleostamine Bioleostamine on metallide lahustumine maagist, kasutades bioloogilisi süsteeme, peamiselt prokarüootseid mikrorganisme. (Johnson 2014) Kõrge metallide sisaldusega maagid on ammendumas, mistõttu muutub vajalikuks eraldada metalle madala metallide sisaldusega ja komplekssematest maakidest, et rahuldada maailma nõudlust metallide järele. Seal, kus need maagid sisaldavad mineraalseid sulfiide, saavad kindlad rauda ja väävlit oksüdeerivad atsidofiilsed mikroorganismid katalüüsida sulfiidide oksüdatiivset lahustumist. Potentsiaalne madala metallide sisaldusega polümetalse sulfiidse kõrge orgaanilise süsiniku sisaldusega maagi bioleostamise tehnoloogia on päevakajaline teema. (Watling 2013) 20 1.2.1 Metallisulfiidide bioleostamine Atsidofiilsete kemolitotroofsete bakterite ja arhede võimet kiirendada sulfiidsete mineraalide oksüdatiivset lahustumist on rakendatud sulfiidsetest maakidest või kontsentraatidest metallide eraldamiseks. Praegusel ajal kasutatakse bioleostamist peamiselt vase leostamiseks sulfiididest, kuid seda kasutatakse ka teiste põhimetallide nagu Co, Ni ja Zn eraldamiseks. Mõnel juhul, näit. kulla ja teiste väärismetallide biokaevandamisel, kasutatakse mikroorganisme metalle sisaldavate mineraalide eraldamiseks; metallid lahustatakse sellele järgnevas protsessis. Sellist bioloogilist eeltöötlust nimetatakse biooksüdatsiooniks. Nii bioleostamine kui biooksüdatsioon toimivad samadel põhimõtetel ja sarnaste mikroorganismide konsortsiumitega. Hinnanguliselt 15% vaske, 5% kulda ja väiksemad kogused teisi metalle (Ni, Zn) kaevandatakse maailmas praegu bioleostamise tehnoloogia abil. (Johnson 2014) Bioleostamist ja biooksüdatsiooni vahendavad atsidofiilsed konsortsiumid jagunevad:  raud(III)iooni genereerivad autotroofid (primaarsed prokarüoodid) – kes toodavad mineraalset oksüdeerijat;  väävelhapet genereerivad autotroofid (sekundaarsed prokarüoodid) – tagavad keskkonnas madala pH;  heterotroofsed ja miksotroofsed (tertsiaarsed) prokarüoodid – lagundavad orgaanilisi ühendeid. Nende rühmade vahel on olulisi kattuvusi, sest mõned autotroofid kui ka heterotroofid ja miksotroofid võivad oksüdeerida nii rauda kui väävlit (või mõlemat). Bioleostamise keskkonna ekstreemne füüsikalis-keemiline olemus - madal pH, kõrgendatud (toksiliste) metallide, mittemetallide, lahuste kontsentratsioonid ja kõrge redokspotentsiaal - on tugevalt toksiline suuremale osale elusvormidele, sh ka mikroorganismidele. Kuigi on teada paljud erinevad madala pH juures raud(II)iooni oksüdeerivad bakterite ja arhede liigid, kes teoreetiliselt võiksid oksüdeerida ka sulfiidseid mineraale (raud(III)iooni vahendusel), siis tundlikkus ekstreemsetele tingimustele jätab biokaevandamise kontekstis „sõelale“ vaid mõned neist - Leptospirillum ferriphilum on tihti domineeriv rauda oksüdeeriv autotroof, Acidithiobacillus caldus on domineeriv väävlit oksüdeeriv autotroof. Sulfobacillus spp. (fakultatiivsed autotroo fid) ja/või rauda oksüdeerivad Euryarchaeotes (Ferroplasma või Acidiplasma spp.; obligatoorsed heterotroofid) vahendavad orgaanilise süsiniku degradatsiooni (Johnson 2014). 21 1.2.1.1. Metallisulfiidide lahustumise rajad Metallisulfiidide (MS) bioleostamist viivad läbi väga erinevad bakterid, kuid metallisulfiidide lahustumise (bio)keemia järgib vaid kahte rada, mille määrab sulfiide lahustuvus happes (Rohwerder & Sand, 2007): Tiosulfaadi rada – happes lahustumatutele metallisulfiididele (FeS2, MoS2 ja WS2). FeS 3+ 2- 2+ 2 + 6Fe + 3H2O → S2O3 + 7Fe + 6H + (toimub spontaanselt) (1.16) S O 2- + 8Fe2+ + 5H O → 2SO 2- + 8Fe2+ 2 3 2 4 + 10H + (1.17) (Dempers et al, 2003) Polüsulfaadi rada – happes lahustuvatele metallisulfiididele (ZnS, PbS, FeAsS, CuFeS2 ja MnS2) MS + Fe3+ + H+→ M2+ + 0.5H 2+ 2Sn + Fe (n≥2) (1.18) 0.5H 3+ 2Sn + Fe → 0.125S 2+ 8 + Fe + H + (1.19) 0.125S8+1.5O 2- + 2+ H2O → SO4 +2H (väävli oksüdeerijad) (1.20) Raua oksüdeerijad regenereerivad Fe3+ : Fe2+ + 2H+ +0,5O 3+2 →2Fe + H2O (1.21) (Johnson, 2014) Joonis 9. Tiosulfaadi raja (A) ja polüsulfiidi raja (B) võrdlus metallisulfiidide bioleostamises (selgitused tekstis). (Rohwerder & Sand, 2007; Vera et al, 2013). 22 Raud(III) ioon redutseeritakse reaktsioonis metalli sulfiidiga (MS) raud(II) iooniks ning vabanevad metalli katioon (M2+) ja väävli vaheühendid. Raud(II)iooni oksüdeerivad bakterid Acidithiobacillus ferrooxidans ja Leptospirillum ferrooxidans tagavad raud(III) iooni regenereerimise happelises keskkonnas. (B) Polüsulfiidi mehhanismi puhul lisandub metalli sulfiidi mikroobsele oksüdatsioonile veel prootonite toime. Väävliühendite oksüdatsioon toimub enamasti abiootiliselt, kuid võimalik on ka oksüdeerumine bakterite (Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans) vahendusel. Lühendid: Af - Acidithiobacillus ferrooxidans, Lf - Leptospirillum ferrooxidans, At - Acidithiobacillus thiooxidans. Kui bakterite lühendid on sulgudes, siis toimub protsess peamiselt abiootiliselt. Elektronaktseptorid paiknevad nooltest paremal. Kastiga on märgitud peamised reaktsiooni produktid k.a. väävelhape tiosulfaadi rajas ja elementaarne väävel polüsulfiidi rajas, mis akumuleeruvad väävliühendite oksüdeerijate puudumisel. Antud võrrandid ei ole stöhhiomeetrilised. (Rohwerder & Sand 2007) 1.2.1.2 Hapete ja kelaativate ainete biogenereerimine Mikrobioloogiliselt genereeritud anorgaanilised happed, nagu lämmastikhape, lämmastikushape, väävelhape, väävlishape ja süsihape, võivad muuta mineraalide struktuuri nõrgemaks. Väävelhapet ja väävlishapet toodavad Acidithiobacillus liigid, aga ka Thiothrix, Beggiatoa ja mõned seened. Lämmastikhapet ja lämmastikushapet toodavad ammoniaaki ja nitritit oksüdeerivad organismid, heterotroofsed nitrifitseerivad organismid ja mõned seened. Süsihape on energiametabolismi lõpp-produkt, kui süsinikdioksiidi reageerib veega, kuid see on nõrk hape ja tõenäoliselt mineraalide lahustumisse oluliselt ei panusta. (Watling 2015) Kõik mikroorganismid eritavad orgaanilisi happeid, eriti kui kasv ei ole tasakaalustatud. Hästi on see teada piimhappe- ja äädikhappebakterite kohta. Orgaanilised happed nagu oblikhape, sidrunhape, glükoonhape, õunhape, merevaikhape, aminohapped, nukleiinhapped ja uroonhapped, võivad soolade moodustumise ja kompleksimoodustamise reaktsioonide vahendusel mineraale lahustada. Siderofoorid on mikroorganismide poolt toodetavad ühendid raua omastamiseks vähese raua saadavuse korral, neil on tugev afiinsus raud(III) ja mangaan(III) suhtes, mida nad kelaadivad ja transpordivad rakku. Uuringutes on näidatud siderofooride põhjustatud mangaani oksiidide ja hematiidi (Fe2O3) lahustumist orgaaniliste hapete juuresolekul. Siderofoorid ja orgaanilised happed toimivad sünergistiliselt – mikroorganism ja/või orgaaniline hape seonduvad mineraali pinnaga ja eraldavad raua või mangaani mineraalist, siderofoor kelaadib raua 23 lahusest, vähendades sellega vaba raua kontsentratsiooni ja soodustades lahustumisreaktsiooni. (Watling 2015) 1.2.2 Metallorgaaniliste ühendite biodegradatsioon Cu, Fe, Se, Ag, Cd ja Bi esinevad kiltades tüüpiliselt mineraalses vormis. V, Ni, Mo, Re ja U domineerivad raskemini eraldatavate porfüriini-seoseliste metallidena. Metalloporfüriine peetakse lagundamisele kõige resistentsemateks ühenditeks. Mikroobse mitmekesisuse uuringud on oluline osa mõistmaks, kuidas lademed moodustusid, kuid ainult vähesed uuringud kirjeldavad kultiveeritavaid liike. Isoleeriti kaks heterotroofsete bakterite tüve, Bacillus (B.) cereus ja B. amyloliqueficiens, ja kasutati neid metallide eraldamiseks (pH 7 juures) Kupferschiefer´i musta kilda maagi metallorgaanilisest komponendist. Metallorgaanilisi komponente lagundavate heterotroofsete isolaatide hulgas oli Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas, Brevibacillus, Microbacterium ja Bacillus liike. Enamus isolaate olid võimelised kasutama lihtsaid orgaanilisi ühendeid, nagu happed ja suhkrud; üks isolaat oli võimeline lagundama fenantreeni (aromaatne süsivesinik) ja mitmed isolaadid suutsid lagundada sünteetilisi metalloporfüriine. Kõik tüved kasvasid musta kilda maagil kui ainsal energia- ja süsinikuallikal, mille tulemusena suurenes vähesel määral lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon (14–16 mg·L−1) võrreldes kontrolliga (10 g·L−1) 30 päeva möödumisel. (Watling 2015) Uuringus, kus kasutati erinevaid valitud segakultuure liikidest Bacillus, Streptomyces, Burkholderia ja/või Pseudomonas naturaalset konsortsiumi kohalikest bakteritest leiti, et sünteetiliste Cu-, V-, Ni- ja Fe-oktaetüülporfüriini ühendite lagundamine oli aeglane. Maksimaalne eraldumine sünteetilistest metalloporfüriinidest 8 nädala pärast oli Cu 80%, Ni 72% ja V 4% , kui eraldumine kilda orgaanilisest materjalist oli Cu 32%, Ni 81% ja V 12%. Metalli eraldumise suurenemine nendes eksperimentides oli kooskõlas lahuses olnud lahustunud orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemisega. Saksamaal, Ranstadi uraanikaevanduses (praeguseks suletud), rakendati heterotroofsed bakterid, Pm. fluorescens, Shewanella (Sh.) putrefaciens ja Pm. stutzeri, uraani eraldamiseks maagijääkidest. Uuringu eesmärk oli pigem metallide mobiliseerimine jääkidest ja testideks valitud liigid olid tuntud ligande tootvad bakterid. Autorid leidsid, et ligandid võivad suurendada mikrotoitainete - Cr, Co, Cu, Mn, Fe, Mo, Ni, V or Zn ning võimalike lantaniidide ja aktiniidide elementide, liikuvust pH 7 juures. (Watling 2015) 24 Mitmed autorid (Kim & Crowley, 2007; Matlakowska et al., 2012, 2010; Petsch et al., 2005; Sadowski et al., 2007) on näidanud eraldatava orgaanilise materjali edukat lagundamist Lubin Kupferschiefer-is ja teistes mustades kiltades. Vaadeldud lagundamine tugines peamiselt fakultatiivsete aeroobsete heterotroofsete neutrofiilide nagu, Acinetobacter sp., Bacillus sp., Microbacter sp., Pseudomonas sp., ja Streptomyces sp. kui ka mitmete seente metaboolsel aktiivsusel. Matlakowska et al. (2013) tõestasid 70% orgaanilise aine lagunemist heterotroofse konsortsiumiga pärast 30 päevast inkubeerimist. (Kutschke 2015) Bakterite ekstratsellulaarsete metaboliitide roll Ca, Na, Mg, Si, Al, Cu, Co, As, V, Zn, Ni, Mo, Fe ja Mn mobiliseerimises oli selgelt tõestatud. (Matlakowska et al, 2014) Heterotroofsete bakteritega leostamise puhul tekivad küsimused, missugust süsinikuallikat peaks kasutama maksimeerimaks nende kasvu ja orgaanilise happe tootmist, samuti missugused happed oleksid kõige tõhusamad sihtmetallidele ja kas orgaanilise süsinikuga allikaga varustamine on taotletava protsessi jaoks ökonoomne. (Watling 2015) 1.2.2.1 Porfüriinide lagundamine Geoporfüriinide mikroobse lagundamise mehhanism pole senini hästi teada. Eelpoolmainitud mikroorganismide kasutamisega saab lagundada vaid leostuvaid, st veeslahustuvaid ühendeid; mitteleostuv orgaaniline aine (k.a. kerogeen) on endiselt probleem. Lähtuvalt kerogeeni ligniinisarnasest struktuurist võivad lahenduseks olla nt Dyp-Type peroksidaasid e. bakteriaalsed peroksidaasid, nt heemi peroksidaasi ensüümide perekond liigil Rhodococcus (https://en.wikipedia.org/wiki/DyP-type_peroxidase_family) Peroksidaasid on radikaalreaktsiooniga võimelised lagundama väga keerukaid ja ebakorrapäraseid struktuure (joonis 10). Joonis 10. Dyp-Type peroksidaaside radikaalataki mehhanism. (Kutschke 2015) 25 Natiivsed Dyp-Type peroksidaasid sisaldavad raud(III)iooni kofaktorina. Pärast oksüdeerumist vesinikperoksiidi toimel moodustuv raud(IV)ioon on seotud hapnikuga ning tekib katioonne radikaal. See tugevalt reaktiivne kompleks on võimeline eemaldama hüdriidi kõigilt substraadiks olevatelt ühenditelt sh ligniinilt ja kerogeenilt. Järgmise etapina toimub hüdroksüülradikaali ülekanne uuele juhuslikule ühendile, mis omakorda moodustab radikaali ligniini või kerogeeni maatriksisse ning regenereerib natiivse ensüümi. Jätkuv radikaalatakk vabastab lõpuks väiksemaid ühendeid, mida on võimalik edasi lagundada. (Kutschke 2015) Reaktiivsed hapnikuühendid (reactive oxygen species, ROS), nagu H2O2 or H võivad tekkida ka anaeroobses keskkonnas (Sabumon 2009). 1.3 Graptoargilliit Graptoliitargilliit ehk diktüoneemaargilliit (nimetatakse ka veel diktüoneemakildaks) on tavapärane põlevkiviliik - orgaanilise ainega (12–17%, nim. ka kerogeen) läbi imbunud Joonis 11. Graptoliitargilliit kõvastunud savikivim, mis levib katkematu http://kivid.blogspot.com/2011_11_01_archive.html kihina Eesti põhja- ja loodeosas Hiiumaalt Narvani. Kuid arvestatavad paksused (>3 m, max 8 m Osmussaarel) on jälgitavad siiski vaid Haapsalu-Tallinna vahelisel alal (joonis 12). Joonis 12. Graptoargilliidi levik Eestis http://www.ut.ee/BGGM/maavara/dityoneema.html Põlevat orgaanilist ain et sisaldava argilliidi varud on hiiglaslikud, hinnanguliselt ligikaudu 60 miljardit tonni. Suurem osa neist lasub ka kaevandamiseks kättesaadavas sügavuses, avanedes paekaldajärsaku jalamil üsna madalal. Paraku on kõnealuse kivimi kasutamine maavarana tõkestatud mitme asjaoluga. Esiteks on temas leiduva orgaanilise aine sisaldus madal (12- 17%, keskmiselt 13-14%), mis teeb kütteväärtuseks üksnes 1500-1600 kcal/kg (5-7 MJ/kg, 26 õlisaagis 2-6%). Teisisõnu, nii kõrge tuhasusega kütuseliigi kasutamine ei tule tänapäeva tehnilistes oludes kõne alla ei tehnoloogiliselt ega majanduslikult. Teiseks piirajaks on argilliidi kõrge rauasulfiidse mineraali - püriidi (FeS2) - sisaldus, mis tõuseb kohati 8-9%, püsides enamasti siiski 2,4-6,0% piires. See väävliühend laguneb põletusprotsessidel vääveloksiidseks gaasiks, mis põhjustab atmosfäärisaastet. (http://www.ut.ee/BGGM/maavara/dityoneema.html) Perspektiivikamaks on loetud argilliidis esinevate haruldaste ja hajutatud elementide kõrgendatud sisaldust. Märkimist väärivad uraan, molübdeen, vanaadium, plii, tsink ja reenium, mille sisaldus kivimis ületab kümneid kordi nende maakoores esineva keskmise hulga. (http://www.ut.ee/BGGM/maavara/dityoneema.html) Eesti argilliit sisaldab märkimisväärses koguses raskmetalle (Lippmaa et al, 2009), olles rikastatud uraani (minimaalne rikastusväärtus, minimum enrichment value, m.e.v. 30 ppm), molübdeeni (m.e.v. 200 ppm), vanaadiumi (m.e.v. 1000 ppm), plii (m.e.v. 100 ppm) ja koobaltiga (m.e.v. 30 ppm), aga ka tsingi, reeniumi, nikli jt. elementidega. (Petersell, 2008, Voolma et al, 2013) Metallid esinevad argilliidis kas sulfiidsete mineraalidena Joonis 13. Püriit galeniidi soonega http://www.ut.ee/BGGM/miner/pyriit.html või metallorgaaniliste ühendite (geopolümeeride) koosseisus. [21] Joonis 14. Porfüriin raua aatomiga https://en.wikipedia.org/wiki/Porphyrin 27 Siiski ei tõuse see sisaldus kusagil tänapäevaste maakide tasemele, mistõttu neist metallidest saaksime rääkida üksnes kui kaasnevatest maavaradest, mille kasutamine tuleks kõne alla vaid argilliidi komplekssel kasutamisel. Kõige kaugemale on sel teel mindud uraani kasutuselevõtul, milleks rajati Sillamäele vastav rikastuskombinaat. Teisele maailmasõjale järgnenud aastatel, 1946-1952 kaevandati Sillamäel toorainena uraani, milleks rajati ka Sillamäele vastav rikastuskombinaat. Sillamäe kaevanduses toodeti üle 270 000 tonni argilliiti, millest saadi ainult 22,5 tonni uraani. Sobivamate maagilasundite leidmisel Venemaalt sellest aga loobuti. (http://www.ut.ee/BGGM/maavara/dityoneema.html) 1.4 Graptoliitargilliidi lõhustamine mikroobikoosluse abil koos kaasneva metallide leostumisega Argilliidi orgaanilise osa lagundamist anaeroobsetes tingimustes heterotroofsete mikroorganismide ja metanogeenide abil on juba uuritud Eestis Tartu Ülikoolis koostöös firmaga BiotaP OÜ. Tehtud on esimesed mikroobikoosluse analüüsid ja katsetatud selle võimet argilliidi orgaanilist komponenti lagundada. Värskelt purustatud argilliidi ja erinevate söötmetega kultiveerimiskatsete abil selekteeriti argilliidi orgaanilist osa lagundav mikroobikooslus (CELMS No EEUT ARGCON5, Menert et al, 2016), mida käesolevas töös nimetatakse inokulumiks 5A, kusjuures ühtlasi toimus metallide bioleostumine. Eelnevalt selekteeriti tõhusaim argilliidi orgaanika (kerogeeni) lagundamist soodustav sööde. Metanogeensete mikroorganismide kasvatamisel segakultuuris on eriti oluline toitainelahuse piisav puhverdusvõime, sest kasvukeskkond kipub fermentatiivsete mikroorganismide metabolismiproduktide tõttu kiiresti hapustuma, metanogeenidele on aga soodne vaid leeliseline kasvukeskkond (vahemikus pH 7–9). Oluline on mikroelementide ja vitamiinide lisand, samuti soodustab metanogeenide kasvu metabolismi vaheproduktide ja metanogeensete substraatide (atsetaat, metanool, trimetüülamiin, CO2 ja H2 segu jms) lisamine. Toitelahusega R2A puljong + NaHCO3 + betaiin isoleeritud kooslus sisaldas muuhulgas metalle leostavate omadustega ja ureaasset aktiivsust omavat perekonda Ureibacillus sp, kes võib olla vastutav porfüriinringi lõhustamise ning metallide ja orgaanika vabastamise eest. Ühtlasi saadi selle toitelahusega kõige mitmekesisem mikroobikooslus, kes kasutas efektiivselt argilliidi orgaanilist osa, mis viis edasisele metaani genereerimisele. 28 1.4.1. Gaasi eraldumine argilliidiproovidest Argilliidi metallorgaaniliste komplekside lagunemise üheks tõendiks on metaani eraldumine gaasifaasi. Mikroorganismide abil võib mustast kildast eralduda 10-250 µmol CH4 / g kivimi kohta. (Wuchter et al, 2013, Meslé et al, 2015). Katsetes kasutatud toitelahusega (R2A + betaiin) eraldus gaasifaasi aga tunduvalt rohkem metaani – maksimaalselt 14.52±0.72 liitrit metaani kg (648±32 µmol/g) argilliidi kohta (joonised 15 ja 16). Argilliidi orgaanika lagundatav osa moodustas kuni 36,40±1,80% kogu orgaanilisest ainest. Metaani päritolu argilliidi orgaanilisest osast kontrolliti isotoopanalüüsiga 13C meetodil (tabel 4), kus kerogeensest materjalist pärit metaani tüüpiline väärtus on -50 ‰. Joonis 15. Metaani eraldumise dünaamika argilliidist adapteerumata, argilliidile omase kultuuriga, kasutades söödet R2A puljong + NaHCO3 + betaiin. Joonis 16. Metaani eraldumise dünaamika argilliidist adapteerunud kultuuriga, kasutades söödet R2A puljong + NaHCO3 + betaiin. 29 Tabel 4. Isotoopanalüüs 13Cmeetodil metaani päritolu määramiseks. CH4 Inkubeeri- 13C Jrk gaasi- Proovi ID2 Kasvukeskkonna koostis mise aeg, (VPDB), nr faasis, päeva ‰ % 1 proov 16 argilliit +R2A(3g/L) + betaiin 98 -52,20 46,0 2 proov 16a argilliit +R2A(3g/L) + betaiin 98 -47,90 38,0 proov 16a 3 argilliit +R2A(3g/L) + betaiin 98 -48,10 38,0 (kordus) 4 proov 17 R2A(3g/L)+betaiin 98 -67,90 2,72 5 proov 17a R2A(3g/L)+betaiin 98 -74,40 18,4 proov 17A 6 R2A(3g/L)+betaiin 98 -72,10 18,4 (kordus) 7 proov 18 R2A(1,5g/L)+betaiin 69 -61,40 10,8 8 proov 19 argilliit +R2A(1,5g/L) + betaiin 69 -52,20 5,3 9 proov 19 (kordus) argilliit +R2A(1,5g/L) + betaiin 69 -52,60 5,3 10 proov 20 argilliit +R2A(1,5g/L) + betaiin 69 -49,50 7,2 11 proov 19b R2A(1,5g/L)+betaiin 69 -81,20 15,6 12 proov 20b R2A(1,5g/L)+betaiin 69 -68,70 10,0 Argilliidi ja söötmega proovid, 13C, ‰ -50,42  2,18 Vaid söötmega proovid, 13C, ‰ -70,95  6,69 Argilliidi metallorgaaniliste komplekside lõhustumist näitab ka metallide leostumine kasvukeskkonda. Kasutades kultiveerimise katsetes graptoliitargilliiti nii mikroorganismide allika kui substraadina vabanesid kasvukeskkonda metallidest kõige enam Co ja Ni. Katsetes kasutatud toitelahustega (R2A + NaHCO3 ja R2A + glükoos) eraldus kasvukeskkonda vastavalt 262-281 ppm Co ja 91-146 ppm Ni nende metallide maksimaalsest sisaldusest argilliidis (joonis 17). Joonis 17. Metallide bioleostumine argilliidist erinevates kasvukeskkondades; Y-teljel on metallide saagis metalli maksimaalsest sisaldusest argilliidis (rikastusväärtus). 30 Biogeenset gaasi tootvate mikroorganismide koosluse määramiseks eraldati DNA ja sekveneeriti, kasutades teise põlvkonna 454 Life Sciences pürosekveneerimise tehnoloogiat. Pürosekveneerimise tulemuste põhjal olid metaani moodustumist stimuleerivas kasvukeskkonnas R2A + betaiin ülekaalus klassi Bacilli esindajad – (bakterite 16S rRNA geenile spetsiifiliste praimerite järgi) praimeritega MCRf-MCRr perekond Ureibacillus (87,43% taksonitest). Arhede 16S rRNA geeni praimeritega BSR357-BSF8 määrati ka metanogeenide perekond Methanosarcina (3.69% taksonitest). Seevastu kasvukeskkondades R2A ja R2A + metanool olid ülekaalus klassi Clostridia esindajad, peamiselt väävli metabolismiga seotud perekond Desulfotomaculum, kes moodustasid 50-85% kõigist määratud taksonitest. Seega betaiini lisamine soodustab tasakaalu sulfaadi redutseerijate ja metanogeenide vahel, nii et protsess läheb metanogeneesi suunas. 31 2. TÖÖ EESMÄRK Iseloomustada argilliidi orgaanilist komponenti lagundavat mikroobikooslust, isoleerida sellest kultiveeritavad mikroobitüved ning selgitada nendest tüvedest koostatud inokulumi võimekust argilliidi orgaanilist komponenti lagundada. 3. MATERJALID JA MEETODID 3.1 Katsemetoodika 3.1.1 Katseseade OxiTop® Kultiveerimiskatsed teostati OxiTop® süsteemi abil, mis koosnes rõhumõõtmis aparatuuriga varustatud hermeetiliselt suletavates 300 ml ruumalaga reaktoritest ning andmete lugemiseks andmehõiveseadest, mille vahendusel sai andmed üle kanda arvutisse (joonis 18). Reaktoril e. pudelil oli kolm kaela, millest ühele sai kinnitada manomeetrilise mõõtepeaga korgi Joonis 18. OxiTop® katseseade ja ning külgmistele gaasi- ja vedelfaasi proovide andmehõiveseade. võtmiseks kujundatud korgid. Oxitop® süsteemiga katsetes on mõõdetavateks parameetriteks katsepudeli sisene rõhk ja gaasisegu koostis, mille alusel on võimalik genereerida mikroorganismide kasvukõver. Anaeroobsel lagundamisel eralduv biogaas tõstab rõhku korgiga suletud gaasikindlas kalibreeritud Oxitop® klaaspudelis. Rõhku mõõdetakse hektopaskalites (1 hPa = 102,1 Pa = 1mbar). Rõhumuutuse alusel arvutatakse eraldunud gaasi kogus võrrandi 3.1 järgi (Menert, 2015): pV = nRT, kus (3.1) p – gaasi rõhk [N/m2] või [hPa] V – gaasi ruumala [m3] R – universaalne gaasikonstant [J/mol*K], R = 8,314 J/mol*K T – absoluutne temperatuur [K] n – moolide arv [mol]; moolide arvule n = 1 vastab normaaltingimustel 22,4 L gaasi. 32 3.1.2 Substraat ja söötmed Kultiveerimiskatsetes kasutati substraadina Eesti Geoloogiakeskuselt saadud proove argilliidikihindist (sügavuselt 50 m). Proovid purustati haamriga väiksemateks tükikesteks, suurima mõõtmega vahemikus 0,5 kuni 1cm. Saadud argilliidiproov oli üheaegselt nii inokulumiks (sisaldas nii fakultatiivselt anaeroobseid mikroorganisme kui ka obligatoorselt anaeroobseid baktereid ja arhesid) kui ka substraadiks (toitainete allikas), sest proovitüki orgaanilise süsiniku sisaldus oli 11,4% (sh väävlit 2,3%). (http://www.eas.ee/images/doc/sihtasutusest/uuringud/ettevotlus/uuring-argilliidist-biogeense- metaangaasi.pdf) Tabel 5. Uuritava proovi füüsikalis-keemilised näitajad. (http://www.eas.ee/images/doc/sihtasutusest/uuringud/ettevotlus/uuring-argilliidist-biogeense- metaangaasi.pdf) 33 Keskkonnaproovidest eraldatakse mikroorganisme tavaliselt minimaalsöötmetega, mida antud kontekstis võib käsitleda baassöötmena. Käesolevas projektis valiti selleks R2A, mis on sobiv sööde keskkonnast, sh veest mikroorganismide eraldamiseks (Reasoner et al, 1985). (Menert – Uuring argilliidist) Tabel 6. R2A puljongi koostis. [http://www.labm.com/products/r2a-broth.asp] Tüüpiline koostis g/l Pärmiekstrakt 0,5 Liha peptoon 0,5 Casamino happed 0,5 Glükoos 0,5 Tärklis 0,5 K2HPO4 0,3 MgSO4 0,05 Naatriumpüruvaat 0.3 Täiendavalt lisati R2A põhisöötmele filtersteriilimise (Whatman süstlafilter poori suurusega 0,2 μm) teel erinevaid süsinikuallikaid ja metanogeneesi soodustavaid substraate - betaiini, tsüsteiini, NaHCO3, N2S. 3.1.3 Inokulum Inokulumina kasutati -80°C säilitatud glütserooli kultuure (5A etalonina, isolaadid 1-29). Puhaskultuurid (isolaadid 1-29) kasvatati ette eraldi R2A + betaiin tardsöötmel sektorkülvidena 2-4 päeva, kogu biomass suspendeeriti 1 ml 0,9% NaCl, millest edasi 15 ml vedelsöötmetesse (R2A + betaiin + NaHCO3 + Na2S + tsüsteiin) pandi kokku 3 komplekti: isolaadid 1-29 (katse 28), isolaadid 1-13 (katse 29) ja isolaadid 14-29 (katse 30). Need konsortsiumid lisati kohe katsete kasvukeskkonda (7,5 g argilliiti + sööde). -80°C säilinud 5A) inokuleeriti külviaasaga 15 ml vedelsöötmesse, kasvatati ette anaeroobselt 2-4 päeva argooni keskkonnas ja lisati sealt katsesse (katse 26). 3.1.4 Katseplaan Varasematest kultiveerimiskatsetest isoleeriti üksikud tüved (joonis 20, A), iseloomustati nende biokeemilisi omadusi ning määrati 16S rRNA geeni sekveneerimisega lähimad vasted. (vt lisad). Eesmärk oli näidata, kas need tüved toimivad samaväärselt varem äraproovitud, argilliidi orgaanikat lagundava kooslusega (kooslus 5A) ja kas nad toimivad sama hästi koos, 34 eraldi või teatud kombinatsioonis. Selleks tehti uued kultiveerimiskatsed (joonis 19, B), mille jaoks koostati isoleeritud tüvedest 3 erinevat inokulumi (tabel 8) – üks katse koos kõigi tüvedega (katse 28) ning kaks katset juhuliku valiku alusel kahte ossa jagatud tüvedega (katse 29 ja 30). Joonis 19. Väljakülvidest (A) isoleeriti 29 puhaskultuuri, millest 25-ga tehti kolmes erinevas kombinatsioonis uued OxiTop® kultiveerimiskatsed argilliidiga (B). Erinevatel ajapunktidel analüüsiti katsetest võetud gaasiproove, määrati mikroorganismide (MO- de) arvukusi ja kasvukeskkonna pH-d. Kokku käivitati 9 OxiTop® reaktorit, kus oli 4 põhikatset koostisega inokulum + argilliit + sööde (katsed nr 26-30), neile võrdluseks 4 ilma argilliidita katset koostisega inokulum + sööde (katsed nr 26B-30B) ja 1 katse 0,9%NaCl lahus + argilliit (katse 27). Katsepudelid steriliseeriti koos põhisöötmega (R2A). Järgnevalt lisati filtersteriilimise teel labiilsed söötmekomponendid (NaHCO3, betaiin, tsüsteiin, Na2S), argilliidiproovide kaalutised, inokulumid (tabel 7) ning komplekteeriti katsepudelid rõhuandurite ja proovivõtuportidega. Põhjusel, et argilliidis elunevad mikroorganismid ei talu hapnikku, saab neid kasvatada vaid anaeroobses keskkonnas. Selleks juhiti enne katsete käivitamist katsepudelite gaasifaasi argooni (5 min). Kultiveeritavatele mikroorganismidele sobivate temperatuuride saavutamiseks ja hoidmiseks ning toitekeskkondade segamiseks kasutati termostateeritavat loksutit. Katsed teostati t=37°C juures. 35 Tabel 7. Katsete 26-30 ja 26B-30B koostised. Täpne koostis ja arvutused on lisades. Katsesegu koostis Söötme R2A Betaiin (1,35g/L), mL + Na2S (0,22 g/L) + maht Inokulum, 0,9% söödet Argilliit, g NaHCO3 (2,52 g/L), mL tsüsteiin (0,45 g/L) kokku, ml NaCl (3g/L), mL Katsete nr mL 26-30 135 7,5 7,5 150 7,5 7,5 27 0 0 0 0 7,5 0 150ml 26B-30B 135 7,5 7,5 150 7,5 7,5 Tabel 8. Isolaatide valik kultiveerimiskatsetesse. Isolaadi Katsed Katsed Katsed 16S rRNA järgi lähim tüvi nr 28, 28B 29, 29B 30, 30B 1 Pseudomonas stutzeri strain SLG510A3-8 1 1 0 2 Pseudomonas stutzeri strain SLG510A3-8 1 1 0 3 Pseudomonas sp. HPC26 1 1 0 7 Bacillus subterraneus strain CW27-B11 1 1 0 9 Bacillus humi strain RHM_120 1 1 0 10 Bacillus fusiformis strain LL 58 1 1 0 11 Bacillus sp. NBK45 1 1 0 12 Bacillus cereus strain R-14 1 1 0 5 Enterobacter cloacae strain 34978 1 1 0 6 Enterobacter cloacae strain 34978 1 1 0 13 Staphylococcus warneri strain mammoth-17 1 1 0 14 Bacillus thermoamylovorans strain O21 1 0 1 15 Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 1 0 1 16 Bacillus sp. NBK45 1 0 1 17 Microbacterium oxydans strain Pp15 1 0 1 18 Rothia sp. R2A-A1X-SW 1 0 1 19 Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 1 0 1 20 Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 1 0 1 21 Enterobacter cloacae strain 34998 1 0 1 22 Bacillus humi strain RHM_120 1 0 1 24 Bacillus sp. NBK45 1 0 1 25 Microbacterium oxydan isolate M3_I7 1 0 1 26 Bacillus sp. NBK45 1 0 1 27 Bacillus sp. EF1A-B810 1 0 1 29 Bacillus humi strain RHM_120 1 0 1 Kokku 25 11 14 36 3.2 Analüüsimetoodika 3.2.1 Meetodid kasvukeskkonnast eralduvate gaasiliste produktide uurimiseks. 3.2.1.1 Gaasi koguse määramine OxiTop® kultiveerimisest võeti gaasiproovid koostise ja päritolu analüüsiks. Gaaside protsentuaalseid sisaldusi kasutades saab arvutada metaani moolosa biogaasis: , (3.1) kus cCH4 – metaani molaarne kontsentratsioon, mol/L, ckõik – kõigi gaasikomponentide molaarne kontsentratsioon kokku, m/L, ρCH4 – metaani tihedus normaaltingimustel, g/L, MCH4 – metaani molaarmass, g/mol, CH4,mahu% – metaani sisaldus biogaasis, mahu%, ρCO2 – süsihappegaasi tihedus normaaltingimustel, g/L, MCO2 – süsihappegaasi molaarmass, g/mol, CO2,mahu% – süsihappegaasi sisaldus biogaasis, mahu%. Asendades valemisse konstandid, saadi metaani moolosa arvutamiseks järgmine valem: . (3.2) OxiTop® andmehõiveseadmest saadud toorikfaili andmete põhjal arvutati esmalt kumulatiivne rõhk (hPa) reaktoris: , (3.3) kus Psum,t-1 – summaarne rõhk eelmises katsepunktis, hPa, Pt – rõhu hetkeväärtus antud katsepunktis, hPa, Pt-1 – rõhu hetkeväärtus eelnevas katsepunktis, hPa. 37 Järgnevalt oli võimalik arvutada kumulatiivne biogaasi kogus millimoolides: , (3.4) kus Pbiogaas – biogaasi rõhk reaktoris, kPa, Vbiogaas – biogaasi ruumala reaktoris, cm 3, R – universaalne gaasikonstant, cm3 kPa K-1 mol-1, T – temperatuur, K. Enne katsete alustamist inokulumi ei pestud, seega selles sisaldus samuti vähesel määral toitaineid, mille lagundamisel eraldus biogaasi. Ainult substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biogaasi kogus millimoolides arvutatakse järgnevalt: , (3.5) kus nbiogaas – substraadi ja inokulumi lagunemisel kokku tekkinud biogaasi, mmol, ninok – inokulumi lagunemisel eraldunud biogaasi kogus, mmol, minok.segus – inokulumi mass, mis oli lisatud substraadile, g, minok – inokulumi mass, mis oli tühiproovi pudelis, g. Substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biogaasi kogus orgaanilise süsiniku massi kohta (mmol/ OS): , (3.6) kus nsubs – substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biogaasi kogus, mmol, msubs – substraadi mass, g, KA% – proovi kuivaine sisaldus, %, OS% – proovi orgaanilise süsiniku sisaldus, %. 38 Kumulatiivne biometaani kogus (mmol): , (3.7) kus nCH4,t-1 – kumulatiivne biometaani kogus eelmises katsepunktis, mmol, nbiogaas,t – kumulatiivne biogaasi kogus antud katsepunktis, mmol, nbiogaas,t-1 – kumulatiivne biogaasi kogus eelnevas katsepunktis, mmol, xCH4 – metaani moolosa antud katsepunktis. Substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus orgaanilise süsinikumassi kohta (mmol/g OS): , (3.8) kus nCH4subs – substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus, mmol, msubs – substraadi mass, g, KA% – proovi kuivaine sisaldus, %, OS% – proovi orgaanilise süsiniku sisaldus, %. Substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus argilliidi kohta (m3/t A): , (3.9) kus nCH4subs – substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus, mol, 22,4 – ühe mooli gaasi ruumala normaaltingimustel, L, mproov,A – argilliit, g, 1000 – tulemuse teisendamiseks tonnideks (ilma teisenduseta on ühikuks L/g ehk m3/kg). 39 Substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus orgaanilise süsiniku kohta (m3/t OS): , (3.10) kus nCH4subs – substraadi lagunemisel eraldunud kumulatiivne biometaani kogus, mol, 22,4 – ühe mooli gaasi ruumala normaaltingimustel, L, mproov,OS – kääritatavas proovis sisalduva orgaanilise süsiniku mass, g, 1000 – tulemuse teisendamiseks tonnideks (ilma 1000 korrutamata tuleks ühikuks L/g ehk m3/kg). (Menert, 2015) 3.2.1.2 Kromatograafiline analüüs Eralduva gaasisegu koostist kõigis kultiveerimise katsetes mõõtis A. Teemusk Tartu Ülikooli Ökoloogia ja maateaduste instituudis gaaskromatograafiga Shimadzu GC-2014 (metaani määramispiirkond 10ppb -30%) ja K. Orupõld Maaülikoolis gaaskromatograafiga Varian Inc., Model CP-4900 (metaani määramispiirkond 0-100%). Varian Inc., Model CP-4900 on varustatud 2 kolonniga : Molsieve 5A Backflush kuumutatud kolonn (20 m x 0.53 mm), kus kandjagaasina kasutatakse argooni ning PoraPLOT U kuumutatud kolonn (10 m x 0.53 mm), kus kandjagaasina kasutatakse heeliumi. Esimese kolonni sisestustemperatuur oli 110°C, kolonnitemperatuur 120°C ja rõhk 50 Psi. Teise kolonni sisestustemperatuur oli 110°C, kolonnitemperatuur 150°C ja rõhk 22 Psi. (Luna-delRisco et al, 2011) 3.2.2 Mikrobioloogilise analüüsi meetodid 3.2.2.1 MO-de arvukused Kultiveerimiskatse käigus määrati erinevatel katse ajapunktidel lahjenduskülvide meetodil (R2A + betaiin tardsöötme) mikroorganismide arvukused, mida võrreldi gaasitekke ja – koostise dünaamikaga. Kolooniad loendati visuaalsel vaatlusel. Keskmist kolooniate arvu, külvimäära ja lahjendufaktorit arvestades leiti elusrakkude arvukus väljakasvanud kolooniate järgi (CFU/ml ehk kolooniaid moodustavate ühikutena/ml). 40 Lahjenduse pöördarv on lahjendusfaktor, mis matemaatiliselt väljendatuna oleks järgmine: (3.11) Söötmeplaadil väljakasvanud mikroobikolooniate loendamise järel on võimalik leida rakkude kaudne arvukus algproovis, arvestades kasutatud lahjendusfaktorit ja külvimäära. See väljendatakse kolooniaid moodustavate ühikutena (CFU – colony-forming units) 1 ml algproovi kohta: (3.12) (Heinaru & Vedler, 2011) 3.2.2.2 pH analüüs Metanogeensete mikroorganismide kasvatamisel segakultuuris on eriti oluline toitainelahuse piisav puhverdusvõime, sest kasvukeskkond kipub fermentatiivsete mikroorganismide metabolismiproduktide tõttu kiiresti hapustuma, metanogeenidele on aga soodne vaid leeliseline kasvukeskkond (vahemikus pH 7–9). Kultiveerimiskatse käigus määrati erinevatel ajapunktidel kasvukeskkonna pH Whatman® Panpeha™ pH indikaatorribadega. 3.2.2.3 Bakteritüvede isoleerimine Väljakülvide jaoks võeti a) OxiTop katsetest nr 19, 20, 21 ja 22 ning b) +4C juures säilinud katsete 16 ja 16A proovidest 1,5ml vedelikuproovi, millest tehti 10-1 kuni 10-4 lahjendused ning külvati R2A + betaiin tardagarile. Külve inkubeeriti 37C juures 24-48h. Puhaskultuuride saamiseks tehti morfoloogiliselt erinevatest kolooniatest lahjenduskülvid R2A + betaiin agarile. Puhaskultuure säilitatakse 30%-lises glütseroolis -80C juures. 3.2.2.4 Biokeemilised testid isoleeritud tüvedega Gramreaktiivsuse määramiseks tehti tüvedele gram järgi värvimine ja KOH lüüsi test. Testiti järgmiste süsinikuallikate kasutamist isolaatide poolt: glükoos, sahharoos, fruktoos, arabinoos, ksüloos, mannoos, maltoos, tsitraat. Käärimistüübi määramiseks tehti Voges- Proskaueri test, denitrifitseerimisvõimet testiti Hiltay söötmega. Määrati järgmiste ensüümide 41 aktiivsust: cyt c oksüdaas, katalaas, amülaas (tärklis), trüptofanaas (indooltest), proteaas (kaseiin, želatiin) , ureaas, DNaas, arginiini dihüdrolaas (ADH), β-galaktosidaas ja β- glükosidaas (eskuliin). KingB söötmel testiti fluorestseeruvate pigmentide olemasolu. Testiti isolaatide soolataluvust (2, 5, 7 ja 10% NaCl sisaldusega tardsöötmel) ja pH taluvust (pH 5,7,9 ja 11 tardsöötmetel). Isolaatide biokeemiliste omaduste määramiseks tehtud biokeemilised testid ja ära toodud lisades 2 ja 3. 3.2.2.5 Isolaatide DNA eraldamine Õvede kõrvaldamiseks analüüsiti puhaskultuuride genoomseid sõrmejälgi BOX-PCR metoodikaga (mitmete erinevate pikkustega DNA fragmentide amplifitseerimine). Selleks valmistati tardsöötmel ettekasvatatud isolaatidest suspensioonid, mida kuumuti rakkude lüüsimiseks 96˚C juures 15 minutit. Lüsaadiga valmistati BOX-PCR reaktsioonisegu, BOX- PCR töötluse amplikonid lahuti geelelektroforeesiga 1,5 % (40ml TAE, 6g agaroosi) agaroosgeelil 1x TAE puhvris, millega saadi igale isolaadile iseloomulik erineva pikkusega geenifragmentide muster. Saadud tulemusi võrreldi biokeemiliste testide tulemustega. 3.2.2.6 Geenifragmentide amplifitseerimine 16S rRNA geeni sekveneerimiseks BOX-PCR-ga väljavalitud tüvedest tehti uus lüsaat, mida kasutati 16S rRNA PCR-i reaktsioonisegu valmistamisel. Geenifragmentide amplifitseerimiseks kasutati PCR reaktsioonisegu lõppmahuga 25 µl. Segu sisaldas 1x lõppkontsentratsiooniga PCR puhvrit [75 mM Tris-HCl, pH 8,8; 20 mM (NH4)2SO4; 0,01% Tween 20], 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM igat nukleotiidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,8 µM praimereid (Tabel 3), 0,5 U Taq DNA Polymerase ja 0,5-6µl raku lüsaati. Lüüsimiseks kuumutati rakke 15 minutit 96°C juures, jahutati jääl ning rakukestad eraldati tsentrifuugimisel (13000 x g, 1 min). Amplifikatsiooniprogramm koosnes initsiatsioonietapist 95°C juures 5 minutit, millele järgnes 40 tsüklit. Iga tsükkel koosnes kolmest etapist: DNA ahelate denatureerimine 95°C juures 1 minut, praimerite seondumine vastava seondumistemperatuuri (Tabel 3) juures 1 minut, DNA süntees 72°C juures 2 minutit ning pärast 40 tsüklit toimus lõppekstensioon 72°C juures 10 minutit. 42 Tabel 9. Töös kasutatud praimerid. (Toomik, 2015) Järjestus 5’ – 3’ Tüvede iseloomustamiseks 16S PCR1 AGAGTTTGATCATGGCTCA Weisburg 55 2 ̴450 rRNA G et al., Seq1 (1991) GTATTACCGCGGCTGCTGG Vedler et al., (2000) Kordus- BOXA1R CTACGGCAAGGCGACGCTG Louws et 5368 18 erinev järjestus ACG al., (1994) 3.2.2.7 Geelelektroforees PCR edukuse kontrollimiseks kasutati 1,5% (40ml TAE, 6g agaroosi) agaroosgeeli 1x TAE puhvris. Geeli hambasse kanti 6 µl proovi segatuna 3,5 µl laadimispuhvriga (6x MassRulerTM Loading Dye Solution; 10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 0,03% broomfenoolsinine; 60% glütserool; 60 mM EDTA; Thermo Scientific™, Leedu). Produkti suuruse hindamiseks kasutati 1 kb DNA suurusmarkerit (GeneRulerTM; Thermo Scientific™; Leedu). Geelelektroforees viidi läbi 1x TAE puhvris 100 V juures. Seejärel immutati geeli 1xTAE puhvris, millele lisati 3µg ml-1 kontsentratsiooniga etiidiumbromiidi (EtBr). Geeli pildistati UV transilluminaatoris. 3.2.2.8 16S RNA geeni Sangeri sekveneerimine Geenifragmentide sekveneerimiseks töödeldi PCR segu praimerite katki lõikamiseks ja nukleotiidide inaktiveerimiseks ensüümidega eksonukleaas I (ExoI; Thermo Scientific™, Leedu; lõppkontsentratsiooniga 0,36 U µl-1) ja kreveti aluselise fosfataasiga (SAP; Thermo Scientific™, Leedu; lõppkontsentratsiooniga 0,14 U µl-1) 37°C juures 15 minutit. Seejärel ensüümid inaktiveeriti 80°C juures (15 minutit). Sekveneerimiseks kasutati BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit-i (Applied Biosystems Inc., USA) vastavalt protokollile. Reaktsioon viidi läbi kasutades PCR programmi, mis koosnes 30 tsüklist. Iga tsükkel sisaldas kolme etappi: ahelate denaturatsioon 95°C juures 15 sekundit, praimerite seondumine Tabelis 3 toodud temperatuuri juures 10 sekundit ja DNA süntees 60°C juures 45 sekundit. Geenifragmendid sekveneeriti Applied Biosystems täisautomaatse kapillaarsekvenaatoriga 3730xl DNA Analyzer. (Toomik, 2015) 43 Praimerite sihtmärklaud Praimerite nimetus Viide Seondumis- temperatuur (°C) Sünteesiaeg (min) Produkti suurus (bp) 3.2.2.8 Sekveneeritud järjestuste analüüs Sekveneerimisjärjestusi analüüsiti BioEdit (v7.2.5) programmiga, neile leiti vasted ja referentstüved BLAST [http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/] otsingumootoriga. (Toomik, 2015) 4. TULEMUSED Algse inokulumiga tehtud kultiveerimiskatsetest eraldati aeroobsetes tingimustes 29 isolaati (isolaadid 1-29, fakultatiivsed anaeroobid). Minimaalse toimiva tüvede arvuga koosluse leidmise eesmärgil vähendati isolaatide hulka, välja valiti 25 isolaati. Eraldatud isolaate kaasavate kultiveerimiskatsetega kirjeldati argilliidi orgaanika lagundamise dünaamikat, kusjuures jälgitavaks parameetriks oli tekkinud metaani kogus. Võrdluseks kasutati algset inokulumi (ARGCON 5 ehk 5A). Argilliidi orgaanilist osa lagundava koosluse mikroorganismide rolli selgitamiseks tehtud katsete ja analüüside tulemused on järgmised: 4.1. Fakultatiivsete anaeroobide isoleerimine 4.1.1 Isolaatide kirjeldus biokeemiliste testide põhjal Isolaatide Gram järgi värvimine ei andnud paljude isolaatide (Batsillused ja Mikrobakteerium) puhul selgelt eristatavat tulemust, seepärast tehti isolaatidele gramreaktiivsuse määramiseks ka KOH lüüsitest. Hiljem näitasid 16S rRNA tulemused, et ka KOH lüüsitest ei andnud alati õiget tulemust. Sporulatsiooni testiks valiti esialgsed grampositiivsed isolaadid, 16S rRNA analüüsiga grampositiivseks osutunud tüvedele tuleb sporulatsiooni test teha tulevikus. Seni tehtud testi põhjal moodustavad spoore isolaadid 7, 10, 11,12, 14, 24, 27, kes 16S rRNA analüüsi põhjal osutusid Batsillusteks ja isolaadid 13, 19, 20, kes 16S rRNA analüüsi põhjal osutusid Stafülokokkideks (warneri) ning isolaat 17, kes 16S rRNA analüüsi põhjal osutus Mikrobakteeriumiks (oxydans). Denitrifikatsiooniks olid võimelise vaid isolaadid 1-4 (perekond Pseudomonas). Süsinikuallikana kasutasid suhkruid (happe tootmisega) vähesed. Kõiki suhkruid kasutasid ainult isolaadid 5,6,8 (Enterobakterid), kes tootsid sealjuures ka gaasi ja isolaat 15 (Stafülokokk). Osaliselt kasutasid suhkruid isolaadid 1-4 (Pseudomonased); 12, 27 44 (Batsillused) 17, 25 (Mikrobakeerium) ja 18 (Rothia). Isolaadid 10 ja 24 (Batsillused) kasutasid ainult mannoosi. Ülejäänud isolaadid ei kasutanud suhkruid üldse või ei olnud võimelised kasvama. Oksüdatsiooni/fermentatsiooni (O/F) testiga osutusid kääritajateks isolaadid 5, 6, 8 (Enterobakterid), 12 (B. cereus). Oksüdaasset aktiivsust näitasid isolaadid 1-4 (Pseudomonased). Katalaasset aktiivsust seevastu oli paljudel isolaatidel: 7, 10, 11, 12, 14, 16, 24, 26, 27 (Batsillused); 13, 15, 19, 20 (Stafülokokid); 17 (Mikrobakteerium). Ureaasset aktiivsust näitasid samuti paljud isolaadid: 9, 10, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 28, 29 (Batsillused); 15, 19, 20 (Stafülokokid); 18 (Rothia); 5, 6, 8 (Enterobakterid). β-galaktosidaas ja DNaasi aktiivsusega isolaate oli rohkem kui trüptofanaasi (idooltest), proteaasi (kaseiin, želatiin), -glükosidaasi (eskuliin) ja arginiindihüdrolaasi (ADH) aktiivsusega isolaate. Kasvukeskkonna soolasisalduse ja pH suhtes isolaatide hulgas ekstremofiile ei leitud. Suurem osa isolaate eelistas kasvada söötmel soolasisaldusega 2-5%, ca pooled isolaadid kasvasid vähem või rohkem ka 7% NaCl-ga söötmel, 4 isolaati (Stafülokokid ja üks Batsillus) kasvasid isegi 10% NaCl sisaldusega söötmel. Enamus isolaati olid võimelised kasvama söötmel pH 7- 11, isolaadid 5,6,8 (Enterobakterid) 13, 19, 20 (Stafülokokid) ja 17, 25 (Mikrobateeriumid) kasvasid pH 5-11 söötmetel. Tabelis 10 on ära toodud isolaatide ensümaatilised aktiivsused ja 16S rRNA geeni sekveneerimise analüüsi tulemused. Teiste biokeemiliste testide tulemuste tabelid ja 16S järgi määratud isolaatide klassifikatsiooni tabel on lisades. 45 Tabel 10. Isoleeritud tüvede biokeemilised testid ja lähim tüvi 16S rRNA geeni järgi Ensümaatiline aktiivsus 16S rRNA järgi lähim tüvi 12 - + + - + + + + + - + Bacillus cereus strain R-14 10 - + + - - - - - - - + Bacillus fusiformis strain LL 58 9 - - + - - - - - + - + Bacillus humi strain RHM_120 29 - - + - - - - - + - + Bacillus humi strain RHM_120 22 - - + - - - - - + - + Bacillus humi strain RHM_120 27 - + - - - 0 - + + - + Bacillus sp. EF1A-B810 11 - + + - - - - - + - + Bacillus sp. NBK45 24 - + + - - - - - + - + Bacillus sp. NBK45 26 - + + - - - - - + - + Bacillus sp. NBK45 16 - + + - - - + - + - + Bacillus sp. NBK45 7 - + - - + 0 - - - - + Bacillus subterraneus strain CW27-B11 14 - + - - + - - + - + Bacillus thermoamylovorans strain O21 17 - + - - - + - + + - + Microbacterium oxydans strain Pp15 25 - - - - - + - + + - + Microbacterium oxydan isolate M3_I7 18 - - + - - - - + + - - Rothia sp. R2A-A1X-SW 13 - + - - + - - + - + Staphylococcus warneri strain mammoth-17 15 - + + - - - - - + - - Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 19 - + + - - - - - - + + Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 20 - + + - - + - - + + - Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 5 - - + - - + - + + + - Enterobacter cloacae strain 34978 6 - - + - - + + + + + - Enterobacter cloacae strain 34978 21 - - + - - - - - + - + Enterobacter cloacae strain 34998 3 + - - - - - - - - - - + Pseudomonas sp. HPC26 2 + - - - - - - - + - - + Pseudomonas stutzeri strain SLG510A3-8 1 + - - - - - - - - - - + Pseudomonas stutzeri strain SLG510A3-8 4.1.2 Isolaatide kirjeldus 16S rRNA analüüsi põhjal 16S rRNA geeni järgi määramist tehti 29-st isolaadist 25-le, neli isolaati jäeti välja, sest BOX- PCR-i ja biokeemiliste testide tulemuste põhjal olid nad väga sarnased mõne teise isolaadiga:  isolaat 4 oli sarnane isolaadiga 3  isolaat 8 oli sarnane isolaadiga 5  isolaat 23 oli sarnane isolaadiga 22  isolaat 28 oli sarnane isolaatidega 9 ja 29 16S rRNA geeni fragmendi sekveneemise tulemuste analüüs (tabel 10 ja lisa 4) näitas, et uuritud järjestused klasterdusid kolme hõimkonda: grampositiivsed bakterid hõimkondadesse Firmicutes (16 isolaati) ja Actinobacteria (3 isolaati), gramnegatiivsed Proteobacteria 46 Gram- Grampositiivsed Gramreaktiivsus negatiivsed Isolaat Oksüdaas Katalaas Ureeaas Indool Tärklis Kaseiin Želatiin Eskuliin β-galaktosidaas ADH DNaas Denitrifikatsioon hõimkonda (6 isolaati). Kõigi BLAST otsingumootoriga uuritud järjestustele leitud referentstüved olid sarnasusega 99-100%. Kõige rohkem esines katsetest eraldatud kooslustes hõimkonna Firmicutes perekonna Bacillus esindajaid (12 isolaati), kelle hulgas omakorda oli kõige enam Bacillus sp. NBK45 – ga lähedasi tüvesid (4 isolaati) ja liigiga humi lähedasi tüvesid (3 isolaati). Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus sp. EF1A-B810, Bacillus subterraneus, Bacillus thermoamylovorans liikidega oli igaühega lähedane üks isolaat. Kõik ülejäänud hõimkonna Firmcutes esindajad olid perekonna Staphylococcus liigiga warneri lähedased tüved (4 isolaati). Actinobacteria hõimkonda liigitunud isolaatidest kaks olid lähedased perekonna Microbacterium liigiga oxydans ja üks isolaat lähedane perekonna Rothia sp. R2A-A1X-SW- ga. Proteobakteria hõimkonda klasterdusid perekonna Enterobacter liigiga cloacae lähedased tüved (3 isolaati) ja perekonna Pseudomonas liigiga stutzeri (2 isolaati) ning Pseudomonas sp. HPC26-ga (1 isolaat) lähedased tüved. Katsest 19 isoleeritud tüved osutusid kõik perekonna Pseudomonas esindajateks, katsest 21 isoleeritud tüved osutusid kõik isolaadid Enterobacter-iteks, katsest 20 isoleeritud tüved olid kõik Bacillus perekonna liigid. Kõige mitmekesisema kooslusega oli katse 16A, millest isoleeriti 7 erinevat tüve 5-st erinevast perekonnast. Katsetest 22 isoleeriti 2 tüve ja katsest 16 isoleeriti 4 erinevat tüve 2-st perekonnast. Tabel 10 ja lisa 4 4.1.3 Identifitseeritud tüvede kirjeldused kirjanduse põhjal Perekond Bacillus Bacillus liigid on pulgakujulised, endospoori moodustavad, aeroobid või fakultatiivsed anaeroobid, grampositiivsed, mõnes kultuurid võivad muutuda ajaga gramnegatiivseks. Paljude liikidega perekonnana esindab suurt valikut füsioloogiliste võimeid elamaks igas looduslikus keskkonnas. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7699/) Bacillus humi Isoleeritud pinnasest, grampositiivne, nõrga anaeroobse kasvuga, sporuleeruv, oksüdaas ja katalaas positiivne, ureaas negatiivne, T˚ optimum 30˚C, kasv pH 7-9, denitrifitseeriv. (Heyrman 2005) 47 Bacillus thermoamylovorans Isoleeriti palmiveinist (kirjeldus põhineb ühel tüvel), fakultatiivne anaeroob, spoore pole täheldatud, T˚ optimum 37˚C, katalaas positiivne, optimaalne pH 6.5–7.5. Toodab heksoose fermenteerides atsetaati, formaati, laktaati ja etanooli. (De 2009) H2 ei tooda. Ei denitrifitseeri. Metülotroofne – mõni tüvi kasvab ka etanoolil. (http://www.tgw1916.net/Bacillus/thermoamylovorans.html) Saksamaal isoleeriti termofiilsetest ja mesofiilsetest biogaasi tootvatest kultuuridest äädik-, propioon- ja butüürhapet tootvate isolaatide hulgas ka Bacillus thermoamylovorans. (Cibis et al, 2016) Bacillus subterraneus Isoleeritud maa-alt, termaalsest veesoonest 2km sügavuselt (71°C, pH 7.8). Gramnegatiivne fakultatiivne anaeroob, (värvus gramnegatiivselt aga elektonmikrograaf näitas grampositiivset rakuseina), spoore ei moodusta. T˚ optimum 37-40˚C, pH vahemik 6,5-9, katalaas positiivne. Kasutab amorfset raud(III), mangaan(IV), nitraati, nitritit ja fumaraati elektroni aktseptorina. Elektroni aktseptorid ei ole kasvuks hädavajalikud, kuid nitraadi olemasolul kasvab paremini. Vajab kasvuks biotiini ja tiamiini aga tsüsteiini mitte. (De 2009, Kanso et al, 2002) Bacillus cereus Grampositiivne, fakultatiivne anaeroob, sporuleeruv. Rakud üksikult, paaris või pikkade ahelatena. T optimum 37˚C, isoleeritud on ka psührotolerantseid isolaate, kes kasvavad t = 6˚C juures. Kasvab pH 5-7 juures. Katalaas positiivne, ureaas positiivne (varieeruv), denitrifitseeriv. Erinevates keskkondades laialt levinud, sh ka pinnases. (De 2009) Bacillus fusiformis (Lysinibacillus fusiformis) Isoleeritud pinnasest, gramvarieeruv; aeroob, sporuleeruv, kasvutemperatuur 17-37˚C, kasvu pH 6-9,5. Ei denitrifitseeri, katalaas positiivne, ureaas ja oksüdaas varieeruv, kasutab atsetaati, tsitraati, formaati, laktaati ja suktsinaati. (De 2009, http://www.tgw1916.net/Bacillus/fusiformis.html (ABIS Encyclopedia) Kan et al. on leidnud, et homoatsetogeenidest segakultuur, Clostridium ljungdahlii, Lysinibacillus fusiformis ja Bacillus cereus, on võimeline konverteerima H2 ja CO2 atsetaadiks, moodustades efektiivse mikroobse ressursi sünteesitud gaasi biokonversiooniks. (Kan et al, 2014) 48 Staphylococcus warneri Isoleeritud inimese ja loomade nahalt, grampositiivne, fakultatiivne anaeroob, paremini kasvab aeroobselt, spoore ei moodusta. T˚ optimum 30-40˚C, katalaas ja ureaas positiivne, denitrifitseeriv (nõrgalt). (http://www.tgw1916.net/Staphylococcus/warneri.html) Staphylococcus warneri on isoleeritud ka õlireostusega pinnasest. (Yele & Densai, 2014 ) Microbacterium oxydans Isoleeritud erinevatest keskkondadest, grampositiivne, aeroobne, T˚ optimum 30˚C, katalaas positiivne. Ei denitrifitseeri. (De 2009) M. oxydans-i on isoleeritud Alyssum murale (kilbirohi) risosfäärist ning tehti kindlaks, et võimeline lahustama pinnasest metalle (mis on seotud nii orgaanilise ja anorgaanilise mulla osaga). (Abou-Shanab et al, 2006) Venemaal Siberis isoleeriti radioaktiivsete jäätmete ladustamiskoha põhjaveest M. oxydansi tüved, mis akumuleerisid suures koguses uraani (pH 4,5 juures rohkem kui pH 2 juures). (Nedelkova et al. 2007) Perekond Rothia 16s rRNA geeni järjestuse analüüsil tulemustes oli Rothia sp. R2A-A1X-SW järel, teisel kohal R. terrea täpselt sama (100%) identsuse, kattuvuse, skoori ja E-väärtuse näitajatega. Esimese liigi omaduste kohta andmeid ei leitud, mistõttu märgime ära R. terrea omadused. Rothia terreae Isoleeritud pinnasest, grampositiivne, fakultatiivne anaeroob. Spoore ei moodusta, katalaas positiivne, T˚ optimum 35˚C, optimaalne pH 7-8, denitrifitseeriv. (Chou et al. 2008) Enterobacter cloacae Leidub vees, pinnases, loomade soolestikus jm. Gramnegatiivne, fakultatiivne anaeroob, T˚ optimum 30-37˚C. Katalaas positiivne, denitrifitseeriv, uureaas varieeruv. (http://www.tgw1916.net/Enterobacteria/Enterobacter.html) Perekonna Enterobacter liigid on peamiselt teada kui lihtsamate ühendite lagundajad, kuid on näidatud, et neid adapteerides võivad nad lagundada ka suuri koguseid metalloporfüriine ning teiste liikidega konsortsiumites on biodegradatsioon oluliselt suurem. (Cordero et al. 2015) 49 Pseudomonas stutzeri Isoleeritud pinnasest, veest (mageveest, mereveest, setetest), kliinilistest proovidest. Gramnegatiivne, rangelt aeroobne va. nitraati sisaldavas keskkonnas – siis on fakultatiivne anaeroob. T˚ optimum 35˚C, denitrifitseeriv (pool-aeroobses keskkonnas võib reaktsioon), oksüdaas positiivne. (http://www.tgw1916.net/Pseudomonas/stutzeri.html) Mõned P. stutzeri tüved sünteesivad siderofoore. Kasvutemperatuuri ulatus erinevatel tüvedel 4-45˚C. Happelisi tingimusi ei talu, alla pH 4,5 ei kasva. P. stutzeri oksüdeerib tiosulfaadi (S2O 2- 3 ) tetrationaadiks (S4O 2- 6 ) kasutades seejuures elektroni aktseptorina nitritit, nitraati või lämmastikdioksiidi. Anaeroobsetes tingimustes toimub see palju aeglasemalt kui aeroobselt, samuti sõltub orgaanilise elektroniaktseptori olemasolust. Tetrationaati moodustavad isolaadid on obligatoorsed heterotroofid. Denitrifikatsioon on stabiilne P. stutzeri omadus, mis toimub anaeroobsetes tingimustes, kuid vahel ka mikroaeroobselt või isegi aeroobselt. P. stutzeri on üks kõige aktiivsemaid denitrifitseerivaid heterotroofseid baktereid. Kõik kirjanduses hästi klassifitseeritud lämmastikku fikseerivad Pseudomonased on P.stutzeri liikmed. Lämmastiku fikseerimine toimub madalal hapniku rõhul, mikroaeroobsetes tingimustes. P. stutzeri tüvesid on kirjeldatud ka suure biosorbtsiooni potentsiaaliga ja resistentsusega metallidele nagu: alumiinium, kroom, koobalt, vask, germaanium, plii, mangaan, nikkel, plutoonium, seleen, hõbe, tallium, titaan, uraan, vanaadium ja tsink. (Lalucat et al, 2006) Oma suurepäraste metaboolsete omaduste (N fikseerimine, denitrifikatsioon, keskkonnareostuste lagundamine) tõttu on P. stutzeri äratanud palju tähelepanu. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/1432) Isoleeritud on teda ka kooslusest, mis eraldati veest, mida oli kasutatud kilda hüdraulilisel fraktsioneerimisel. Seal võis ta olla seotud lihtsamate või keerulisemate orgaaniliste ühendite (nt. alkaanid või aromaatsed ühendid) oksüdeerimisega kui ka nitraadi redutseerimisega. (Cluff et al, 2014) 4.2. Selekteeritud isolaatide toime argilliidi orgaanilise osa lagundamisele Nii looduses kui biotehnoloogilistes protsessides lagundavad mikroorganismide kooslused orgaanilist substraati paremini kui üksikud tüved eraldi. Käesoleva töö käigus kasutati algsetest kooslustest eraldatud ja iseloomustatud fakultatiivselt anaeroobseid isolaate uutes OxiTop® kultiveerimiskatsetes (tabel 11), selgitamaks nende rolli protsessis ning millise 50 kooseisuna toimiksid nad kõige tõhusamalt. Kooslused katsete nr 28-30 inokulumide jaoks koostati juhusliku valiku alusel. Võrdluseks kasutati katses nr 26 algset (5A) inokulumi. Tabel 11. Kultiveerimiskatsed eraldatud ja selekteeritud tüvedega. Katse koostis Katse nr 5A + argilliit + sööde 26 Isolaadid 1-29 + argilliit + sööde 28 Isolaadid 1-13 + argilliit + sööde 29 Isolaadid 14-29 + argilliit + sööde 30 Argilliit + 0,9% NaCl lahus 27 Lisaks käivitati paralleelkatsed (26B, 28B, 29B, 30B) samade inokulumidega, kuid ilma argilliidita, et eristada söötmest ja argilliidi orgaanilisest ainest toodetud gaasi ehk määrata argilliidist tekkinud gaasi hulk kogu tekkinud gaasi hulgast. 4.2.1 Isoleeritud mikroorganismide mõju gaasi eraldumisele argilliidist Rõhumuutused argilliidiproovide mikrokosmides (joonis 21) näitasid, et kõige rohkem tekkis gaasi katsetes 26, mis sisaldas algset kooslust sh ka metanogeene ning katses 28, mille inokulum sisaldas kõiki isoleeritud tüvesid. Katses 29 jäi eksponentsiaalne gaasiteke lühiajaliseks ning kogu toodetud gaasi hulk kõige väiksemaks. Katsel 30 oli teistest pikem lag-faas ja sellele ei järgnenud hüppelist gaasitekke kiiruse suurenemist nagu teisetel katsetel. Lõplik gaasi kogus oli keskmine. Kõigis paralleelkatsetes (26B-30B) oli gaasiteke ühtemoodi väike. Katses 27, kus oli vaid argilliit ja NaCl lahus, gaasi ei toodetud. Kõigis argilliiti sisaldanud ja gaasiteket näidanud pudelites (26, 28, 29, 30) muutus sööde katse käigus mustjaks. Ilma argilliidita ja vähe gaasi tootnud pudelites (26B, 28B, 29B, 30B) jäi sööde värvusetuks. Argilliidi ja NaCl lahusega pudelis jäi lahus kergelt pruunikaks (joonis 20). 51 26 26B 27 28 28B 29 29B 30 30B Joonis 20. Kultiveerimiskeskkonna värvuse muutus katse käigus. Joonis 21. Rõhumuutused argilliidiproovide mikrokosmides, t = −80°C säilitatud inokulumide ja puhaskultuuridega, t = 37ºC 4.2.2 Gaasiliste metaboliitide kontsentratsioonide muutused kultiveerimiskatses Katsete gaasiproovidest määrati metaani, CO2, lämmastiku, O2 sisaldus (graafikud a kuni h) ja osakaal kogu toodetud gaasist. Kõikide gaaside sisaldus hakkas tõusma samal ajal. Metaani toodeti kõige rohkem (max. 600 μmol/ g argillidi kohta) katsetes 26 ja 28, katsetes 29 ja 30 jäi saagis palju väiksemaks (joonis 22): 52 Katses 26 tekkis metaani 617 μmol/kg kohta, 60% kogu gaasist. Katses 28 492 μmol/kg kohta, algul 60% kogu gaasist, langes 40%-le. Katses 29 200 μmol/kg kohta, 29% kogu gaasist. Katses 30 242 μmol/kg kohta, 45% kogu gaasist. CO2 tekkemuster sarnanes üldiselt kõigis katsetes metaani tekke mustriga nii ajaliselt kui dünaamika poolest, erinedes vaid koguselt jäädes veidi rohkem kui poole väiksemaks metaani tekkest (max. 600 μmol/ g argillidi kohta). Rohkem tekkis süsihappegaasi katsetes 26 ja 28 (joonis 22). Lämmastiku tekkes erinevate katsete vahel väga suurt erinevust ei olnud (kõigil oli vahemikus 100-200 μmol/ g argillidi kohta) võrreldes metaani ja CO2 tekkega. Kuid metaani ja CO2 tootmises silma paistnud katse 28 oli lämmastiku tootmises kõige tagasihoidlikum (joonis 22). Hapniku sisaldus suurenes (NB! katsed viidi läbi argooni keskkonnas) katsetes vähesel määral koos teiste gaaside tekkega, katsetes 26-29 püsis seejärel ühtlasel ja sarnasel tasemel (10-20 μmol/ g argillidi kohta), katses 30 suurenes kõige rohkem (kuni 30 μmol/ g argillidi kohta) (joonis 22). 53 a b c d Joonis 22. Argilliidi loomuliku kooslusega ja eelnevatest katsetest isoleeritud tüvedega kultiveerimiskatse gaasi koostise (CH4, CO2, N2 ja O2) analüüsid. Vasakul tekkinud gaasi kogus (μmol/g argilliit) erinevates katsetes, paremal ühe gaasi osakaal (%) teistest gaasidest erinevates katsetes. a) CH4 b) CO2 c) N2 d) O2 54 4.2.4 Mikroorganismide arvukus, metaani teke ja söötme pH Kultiveerimiskatse käigus määrati vedelikuproovidest väljakülvidega fakultatiivselt anaeroobsete mikroorganismide arvukusi erinevatel ajapunktidel, samadel proovidel mõõdeti ka pH. Gaasiproove võeti siis kui rõhk pudelis oli piisavalt kõrge (≥ 200 hPa). Kasvukeskkonna pH analüüs näitas, et kõigi söödet sisaldavate katsete pH varieerus vaid vähesel määral neutraalse pH 7 läheduses kuni katse lõpuni (joonis 23) olles seega fakultatiivselt anaeroobsete mikrorganismide arvukuste kõikumistest mõjutamata (Joonis 24). Ilma söötmeta, NaCl lahusega katse 27 pH langes juba esimeste päevadega pH 4 – 4,5 vahemikku. Joonis 23. Söödet (katsed 26, 28-30 ja 26B, 28B-30) sisaldanud kultiveerimiskeskkondade pH oli katse jooksul stabiilne. Jooniselt 24 on näha, et intensiivne metaani teke algab pärast fakultatiivsete anaeroobide arvukuse langust. Aktiivse metanogeneesi ajal püsib aeroobselt kasvatatavate mikroobide arvukus stabiilsena. Katseperioodi viimases kolmandikus taastub fakultatiivsete anaeroobide arv hüppeliselt ning langeb seejärel taas. 55 a b ) C d c Joonis 24. Metaani, pH ja fakultatiivsete mikroorganismide tase OxiTop® kultiveerimiskatsetes argilliidi loomuliku kooslusega (a – katse 26) ja eelnevatest katsetest isoleeritud tüvedega (b – katse 28, c – katse 29, d – katse 30). 56 5. ARUTELU Eesti aluspõhjas olevad suhteliselt kõrge orgaanilise aine sisaldusega kivimid (nt graptoliitargiliit) on elupaigaks erinevatele mikroorganismidele. Käesolevas töös uuriti argilliidist eraldatud ja selle orgaanilist komponenti lagundavat fakultatiivselt anaeroobset mikroobikooslust, et selgitada nende mikroobide võimet seda protsesse läbi viia. Selleks tehti eelnevalt teostatud kultiveerimiskatsetest väljakülvid ja isoleeriti neist puhaskultuurid. Nende omadusi analüüsiti biokeemiliste testidega, määrati nende liigiline kuuluvus 16S rRNA geeni järjestuse põhjal ning erinevate liikide olulisuse hindamiseks lagundamisprotsessis kasutati neid uutes kultiveerimiskatsetes inokulumina lisaks argilliidis olevale loomulikule kooslusele. Kultiveerimiskatsed 28, 29 ja 30 tehti koos argilliidiga (+ sööde) ja paralleelkatsed 28B, 29B, 30B ilma argilliidita (ainult sööde) ning katsetes 26 ja 26B kasutati inokulumina varem isoleeritud ja adapteeritud 5A konsortsiumi, mis sisaldas mh ka metanogeene. Katse 27 viidi läbi vaid argilliidi ja 0,9% NaCl lahusega (ilma inokulumita). Katse 28 inokulumi kaasati kõik 16s rRNA põhjal määratud tüved (25 isolaati). Katse 29 j 30 inokulumide jaoks jagati isolaadid juhuliku valiku põhjal kahte ossa. Katsetesse 29 ja 30 sattusid mõlemasse Batsilluseid, Stafülokokke ja Enterobaktereid. Katse 29 sisaldas suuremat valikut Batsilluste tüvesid ja lisaks veel Pseudomonaseid. Katse 30 sisaldas lisaks ühistele liikidele veel hõimkonna Aktinobakteeria esindajaid, Mikrobakteeriumeid ja Rothiat. Kõigis inokulumi ja argilliiti sisaldavates kultiveerimispudelites tekkis gaasi oluliselt rohkem kui ainult söötme ja inokulumiga kontrollkatsetes. Katsetes 26 ja 28 tekkis gaasi palju enam kui katsetes 28 ja 29, millest võib arvata et: a) mitmekesisem kooslus on tõhusam orgaanilise aine lagundamises kui vähendatud mitmekesisusega kooslus b) kuigi kõik katsed sisaldasid ka argilliidi loomulikku kooslust, siis juhusliku valiku alusel koostatud inokulumide kooslused võisid ka loomuliku koosluse toimimist häirida. Kasvukeskkonna pH püsimine pH 7 läheduses kõigis söödet sisaldanud katsetes kogu katse aja on sobilik nii heterotroofsetele fakultatiivsetele anaeroobidele kui ka metanogeenidele. pH stabiilsus näitab söötme piisavat puhverdusvõimet. Katse 27 söödet ei sisaldanud ning selle pH muutus kiiresti happeliseks, mida metanogeenid ei talu. Seepärast ei toimunud seal ka gaasitootmist. 57 Metaani tekkis kõigis argilliiti ja söödet sisaldanud katsetes. Metaani maksimaalne saagis oli katses 26 ja seda tõenäoliselt seepärast, et katse inokulum, 5A, sisaldas ka metanogeene jt oblikatoorseid anaeroobe. Kuigi katsete 28, 29 ja 30 inokulumid arhesid ei sisaldanud ning on teada, et ainult arhed on võimelised metanogeneesiks, võib järeldada, et nendes katsetes metaani tootnud arhed pärinesid argilliidist. Metaani osakaal (%) kogu toodetud gaasis tõusis ka katses 28 katsega 26 samaväärsele tasemele. Isotoopanalüüsi tulemuste põhjal oli tekkinud metaan kerogeense päritoluga ehk tekkinud argilliidi orgaanilise aine lagundamise tulemusena. Fakultatiivsetete anaeroobide arvukuse kõikumised ja metaani teke oli kõigis katsetes üldjoontes vastasfaasis – intensiivne metaani tootmine algas siis kui arvukused oli langenud, mis näitab, et fakultatiivsete anaeroobide arvukuse vähenedes kasvas metanogeenide arvukus. Katsetes 28 ja 29 hakkas kultiveerimise lõpupoole metaanisisaldus vähema, mida võisid põhjustada argilliidi loomulikus koosluses olevad metanotroofid. Hapniku teke anaeroobselt käivitatud katse gaasifaasi võib olla põhjustatud porfüriinide lagundamise käigus tekkiva peroksiidi lagundamisel veeks ja hapnikuks mikroobsete katalaaside abil. Isolaatide biokeemiliste testidega selgus, et 50%-l isolaatidest on katalaasne aktiivsus. 2H2O2 → 2H2O + O2 (5.1) Kui üldiselt on metanogeenid oblikatoorsed anaeroobid siis, metanogeenid perekonnast Methanosarcina on võrdlemisi aerotolerantsed, sellepärast võimalik nende eksisteerimine keskkonnas kus 0,5-3% O2. Varem teostatud argilliidi mikroobikoosluse pürosekveneerimisega leiti koosluse hulgast ka Metanosarcina perekond. (Menert et al, 2016) Metanosarcina kasvu soodustab ka katsete söötmesse lisatud betaiin, mida nad saavad kasutada substraadina metülotroofses metabolismirajas. (Kinnunen, 2013) Kõigis katsetes sisaldas gaasiproov ka lämmastikku. Isolaatide mikrobioloogilise analüüsi põhjal olid denitrifitseeriva omadusega vaid Pseudomonased , keda sisaldasid katse 28 ja 29 inokulumid. Neis katsetes oligi lämmastiku osakaal märkimisväärselt suurem (vastavalt 30% ja 45%) kui katsetes 26 ja 30 (N2 sisaldus < 20%). Kirjanduse põhjal olid denitrifitseeriva võimega veel B.humi, B.cereus, S.warneri, Rothia, E.cloacae ja S.stutzeri ehk iga katse inokulumis mitu erinevat liiki. See seletab N2 tekke kõigis katsetes. 58 NO − 3 → NO − 2 → NO + N2O → N2 (5.2) (https://en.wikipedia.org/wiki/Denitrification) Lisaks võis katsetes toimuda ka nitrifikatsioon, milleks kirjanduse põhjal võivad võimelised olla Bacillus subterraneus ja P.stutzeri, kes juhusliku valiku tulemusena sattusid katsetesse 28 ja 29. Seda võimaldab kultiveerimise käigus tekkinud hapnik. Nitrifikatsioon toimub kahes faasis: (5.3) I faasis oksüdeeritakse ammoniaak või ammoonium nitritiooniks II faasis oksüdeeritakse nitrit nitraadiks (5.4) (http://mikroobidringetes.weebly.com/nitrifikatsioon.html) 59 6. JÄRELDUSED  Argilliidi orgaanilist osa on võimalik argilliidist isoleeritud mikroobikoosluse abil lagundada.  Algsest mikroobikooslusest eraldatud, fakultatiivsetest anaeroobsete tüvedest koostatud inokulumiga on samuti võimalik argilliidi orgaanilist osa lagundada.  Argilliidi orgaanilise osa lagundamise efektiivsus sõltub mikroorganismide mitmekesisusest ja konkreetsest kooseisust. 60 7. KOKKUVÕTE Graptoliitargilliit on raskemetalle sisaldav tavapärane põlevkiviliik, kus metallid esinevad kas sulfiidsete mineraalidena või geopolümeeride (kerogeeni) kooseisus. Muuhulgas on argilliit elupaigaks erinevatele mikroorganismidele. Katsed on näidanud, et argilliidis elavad heterotroofsed fakultatiivsed anaeroobid ja metanogeensed arhed on kooslusena võimelised pH 7 ja anaeroobsetes tingimustes kerogeeni lagundama, mille tulemusena tekib metaan ja CO2 ning lahustuvad metallid. Protsessi toimumist soodustavad metanogeneesi substraatide lisamine kasvukeskkonda. Käesoleva töö eesmärk oli iseloomustada argilliidi orgaanilist komponenti lagundavat fakultatiivselt anaeroobset mikroobikooslust ja selgitada isoleeritud mikroobide võimekust seda protsessi läbi viia. Eelnevalt argilliidist eraldatud loomuliku mikroobikooslusega 5A läbi viidud kultiveerimiskatsetest tehti väljakülvid, isoleeriti aeroobsetes tingimustes 29 tüve, iseloomustati nende biokeemilisi omadusi. 16S rRNA geeni sekveneerimisel saadud järjestuste analüüsiga määrati nende hulgast 25-le isolaadile lähimad tüved. Uuritud järjestused klasterdusid kolme hõimkonda: grampositiivsed bakterid hõimkondadesse Firmicutes (16 isolaati) ja Actinobacteria (3 isolaati), gramnegatiivsed Proteobacteria hõimkonda (6 isolaati). Kõige rohkem isoleeriti algsest kooslusest Bacilluseid, kellele järgnesid S.warneri, P.stutzeri, E.cloacae, M.oxydans ja Rothia. Biokeemiliste testid näitasid, et 14-l isolaadil oli katalaasne aktiivsus ja 19-l (osaliselt erinevatel) isolaatidel ureaasne aktiivsus, mis on olulised omadused raskesti lagundatava orgaanilise aine metaboliseerimisel. Selleks, et kontrollida kas need tüved toimivad samaväärselt argilliidi orgaanikat lagundava kooslusega ja kas nad toimivad sama hästi koos või teatud kombinatsioonis, tehti uued kultiveerimiskatsed, kus kasutati isoleeritud tüvesid inokulumina ning analüüsiti katse käigus tekkinud gaasi teket ja koostist. Kultiveerimiskatsete tulemused näitasid, et kõige parema inokulumina toimis argilliidi orgaanilise aine lagundamisel algne mh. ka metanogeene sisaldanud 5A inokulum katses 26, tootes kõige rohkem ja kõige suurema metaanisisaldusega gaasi. Pea-aegu samaväärselt toimis ka kõiki isoleeritud tüvesid sisaldanud ehk mitmekesisema kooslusega inokulum katses 28. Vähendatud isolaatide arvu ja mitmekesisusega kooslused tootsid oluliselt vähem gaas ja metaani sisaldus selles oli väiksem. 61 8. SUMMARY The explosive growth of humankinds and the implementation of various technological tools have significantly increased the demand for them. Technological devices contain metals (including precious metals) for operating. Increasing demand for technology leads to increased demand for metals resources. High grade ores are becoming depleted, and therefore intrest for low grade and complex ores is increasing. One of them is black shale that contains U, Mo,V, Pb, Zn, Re, Ni, ten times more than the average of the Earth's crust but not enough to be wise to separate each metal individually. Metals are in argillite as sulfides or in the composition of organo-metallic compounds. While the role of pyrite oxidation microorganisms in bioleaching of metals is clear, less is known about the microbial decomposition of organometallic complexes. Estonian basement minerals with relatively high content of organic matter (e.g. graptolite argillites) are habitat for microorganisms. Previous studies have shown that heterotrophic facultative anaerobes and methanogenic archaea of argillite community are capable under anaerobic conditions and at pH 7 to decompose the organic matter, which results in a methane and CO2, and liberating the metals. The aim of this thesis is to characterize the biodegradative potential microbial communities of argillite organic matter with methane producing / metal leaching properties, and explain their capability to carry out this process. 29 indigenous strains of argillite from cultivation experiments in anaerobic microcosms (OxiTop) were isolated for microbial idenfication in aerobic conditions. Various tests were performed with isolates for characterising their biochemical properties. Besides other things results showed that >50% of them had catalase and urease activity what might be nessesary for ability of degrading complex organic matter. For finding the nearest strains the 16S rRNA gene based on Sanger sequencing of argillite ingenious strains was performed for 25 isolates. The analysis of results showed that studied sequences clustered into three phylum: Firmicutes (16 isolates) and Actinobacteria (3 isolates), Proteobacteria (6 isolates). The most of them were nearest to genus Bacillus, followed S.warneri, P.stutzeri, E.cloacae, M.oxydans and Rothia. These isolates were used for a new cultivation (OxiTop) experiment to define whether these strains function as well as argillite ingenious community (5A), whether they work equally 62 well together, separately or in some combination. Isolates were used all together and randomly separated in two parts. The gas yield and composition were measured and analysed as parameters for biodegradation of organic matter of argillite. Results showed that the gas and methan yields were higher in cultivation with all isolates than in cultivations with smaller diversity. Based on results of this study, following conclusions were made:  Indigenous strains of argillite are able for biodegradation of argillite organic matter.  Facultative anaerobes isolated from Indigenous strains of argillite are also able for biodegradation of argillite organic matter.  The effectiveness of biodegradation depends on diversity on microbial community In further studies the metal analyses of cultivation liquid and isolation of strictly anaerobic strains should be performed. 63 9. TÄNUAVALDUSED Soovin tänada oma juhendajat, Anne Menertit, entusiastliku, vankumatult optimistliku ja positiivse suhtumise ja toetamise eest! Lisaks soovin tänada kõikvõimalikke valmistoidu valmistajaid, mikrolaineahju ja nõudepesumasina leiutajaid, kes aitasid selle töö valmimiseks oluliselt aega kokku hoida. Erilised tänud ka inglastele nende Twinings™ English Breakfast tee eest ja šveitslastele Lindt šokolaadi eest, kes varustasid mind töö valmimiseks oblikatoorse kofeiini- ja energiaallikaga! 64 KASUTATUD KIRJANDUS Abou-Shanab, R., Angle, J., Chaney, R. (2006). Bacterial inoculants affecting nickel uptake by Alyssum murale from low, moderate and high Ni soils. Soil Biology and Biochemistry, 38(9), 2882-2889. doi:10.1016/j.soilbio.2006.04.045 Angelidaki, I., Karakashev, D., Batstone, D. J., Plugge, C. M., Starns, A. J. M. (2011) Biomethanation and its potential. Methods in Enzymology, 494, 327-351. Berger, S., Welte, C., Deppenmeier, U. (2012). Acetate activation in Methanosaeta thermophila: characterization of the key enzymes pyrophosphatase and acetyl-CoA synthetase. Archaea, 2012, 1-10. doi:10.1155/2012/315153 Braun, R., Drosg, B., Bochmann, G., Weiß, S., Kirchmayr, R. (2009). Recent Developments in bio-energy recovery through fermentation. Microbes at Work, 35-58. doi:10.1007/978-3-642-04043-6_2 Carballa, M., Regueiro, L., Lema, J. M. (2015). Microbial management of anaerobic digestion: exploiting the microbiome-functionality nexus. Current Opinion in Biotechnology, 33, 103-111. doi:10.1016/j.copbio.2015.01.008 Chou, Y., Chou, J., Lin, K., Lin, M., Wei, Y., Arun, A. B., Young, C.C., Chen, W. (2008). Rothia terrae sp. nov. isolated from soil in Taiwan. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58(1), 84-88. doi:10.1099/ijs.0.65172-0 Cibis, K. G., Gneipel, A., König, H. (2016). Isolation of acetic, propionic and butyric acid- forming bacteria from biogas plants. Journal of Biotechnology, 220, 51-63. doi:10.1016/j.jbiotec.2016.01.008 Cluff, M. A., Hartsock, A., MacRae, J. D., Carter, K., Mouser, P. J. (2014). Temporal changes in microbial ecology and geochemistry in produced water from hydraulically fractured Marcellus shale gas wells. Environmental Science & Technology, 48(11), 6508-6517. doi:10.1021/es501173p Cordero, P. R., Bennett, R. M., Bautista, G. S., Aguilar, J. P., Dedeles, G. R. (2015). Degradation of nickel protoporphyrin disodium and vanadium oxide octaethylporphyrin by Philippine microbial vonsortia. Bioremediation Journal, 19(2), 93-103. doi:10.1080/10889868.2013.827616 De, V. P. (2009). Bergey's manual of systematic bacteriology: Volume three. The Firmicutes. Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W., Rainey, F.A., Schleifer, K.- H., Whitman, W. (Eds.) Dordrecht: Springer, 1317 pp. Dempers, C., Breed, A., Hansford, G. (2003). The kinetics of ferrous-iron oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans: effect of cell 65 maintenance. Biochemical Engineering Journal, 16(3), 337-346. doi:10.1016/s1369- 703x(03)00113-x Fournier, G. P., Gogarten, J. P. (2007). Evolution of acetoclastic methanogenesis in Methanosarcina via horizontal gene transfer from cellulolytic Clostridia. Journal of Bacteriology, 190(3), 1124-1127. doi:10.1128/jb.01382-07 Glass, J. B., Orphan, V. J. (2012). Trace metal requirements for microbial enzymes involved in the production and consumption of methane and nitrous oxide. Frontiers in Microbiology, 3. doi:10.3389/fmicb.2012.00061 Heinaru, E. Vedler, E. (2011). Praktilisi töid mikrobioloogiast. Tartu: AS Atlex. Heyrman, J. (2005). Bacillus arenosi sp. nov., Bacillus arvi sp. nov. and Bacillus humi sp. nov., isolated from soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55(1), 111-117. doi:10.1099/ijs.0.63240-0 Insam, H., Franke-Whittle, I., Goberna, M. (2010). Microbes in aerobic and anaerobic waste treatment. In: H. Insam et al. (eds.) Microbes at Work, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2-34. doi:10.1007/978-3-642-04043-6_1 Johnson, D. B. (2014). Biomining—biotechnologies for extracting and recovering metals from ores and waste materials. Current Opinion in Biotechnology, 30, 24-31. doi:10.1016/j.copbio.2014.04.008 Kanso, S., Greene, A. C., Patel, B. K. (2002). Bacillus subterraneus sp. nov., an iron- and manganese-reducing bacterium from a deep subsurface Australian thermal aquifer. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52(3), 869-874. doi:10.1099/00207713-52-3-869 Kim, J.-S., Crowley, D.E. (2007). Microbial diversity in natural asphalts of the Rancho La Brea tar pits. Applied and Environmental Microbiology, 73, 4579–4591. Kinnunen, M., (2013). Identifying archaea in anaerobic digester. Magistritöö, Tallinna Tehnikaülikool, 2013, 61 pp. Kriipsalu, M., Maastik, A., Truu, J. Jäätmekäitlus ja pinnase tervendamine. Tallinna Tehnikaülikooli Kirjastus, Tallinn, 2016, 376 lk. Kutschke, S., Guézennec, A., Hedrich, S., Schippers, A., Borg, G., Kamradt, A., Gouin, J., Giebner, F., Schopf, S., Schlömann, M., Rahfeld, A., Gutzmer, J., D’Hugues, P, Pollmann, K. Dirlich, S., Bodénan, F. (2015). Bioleaching of Kupferschiefer blackshale – A review including perspectives of the Ecometals Project. Minerals Engineering, 75, 116-125. doi:10.1016/j.mineng.2014.09.015 66 Lalucat, J., Bennasar, A., Bosch, R., Garcia-Valdes, E., Palleroni, N. J. (2006). Biology of Pseudomonas stutzeri. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), 510-547. doi:10.1128/mmbr.00047-05 Lippmaa, E., Maremäe, E., Pihlak, A., Aguraiuja, R. (2009). Estonian graptolitic argillites – ancient ores or future fuels? Oil Shale, 26(4), 530. doi:10.3176/oil.2009.4.08 Louws, F. J., Fulbright, D. W., Stephens, C. T., de Bruijn, F. J. (1994) Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Enviromental Microbiology, 60, 2286-2295. Luna-delRisco, M., Kaja Orupõld, K., Henri-Charles Dubourguier, H.-C. (2011). Particle-size effect of CuO and ZnO on biogas and methane production during anaerobic digestion. Journal of Hazardous Materials, 189, 603−608, j.jhazmat.2011.02.085. Luo, K., Fu, B., Zhang, L., Liu, H., Liu, H. (2014) Screening of homoacetogen mixed culture converting H2/CO2 to acetate. Chinese Journal of Biotechnology, 30(12), 1901-1911. Matlakowska, R., Narkiewicz, W., Sklodowska, A. (2010) Biotransformation of organic-rich copper-bearing black shale by indigenous microorganisms isolated from Lubin copper mine (Poland). Environmental Science and Technology, 44, 2433–2440. Matlakowska, R., Skłodowska, A., Nejbert, K. (2012) Bioweathering of Kupferschiefer black shale (Fore-Sudetic Monocline, SW Poland) by indigenous bacteria: implication for dissolution and precipitation of minerals in deep underground mine. FEMS Microbiology Ecology, 81, 99–110. Matlakowska, R., Wlodarczyk, A., Slominska, B., Sklodowska, A., (2014), Extracellular elements-mobilizing compounds produced by consortium of indigenous bacteria isolated from Kupferschiefer black shale – implication for metals biorecovery from neutral and alkaline polymetallic ores. Physicochemical Problems of Mineral Processing 50(1), 87−96. Menert, A.; Kivisaar, M.; Sipp Kulli, S.; Heinaru, A.; Maidre, T. Decomposition of graptolite argillite organic matter by microbial consortium accompanied by bioleaching of metals and production of methane. Estonian Patent Application P201600003, priority date: 16.02.2016. Menert, T., (2013) Hariliku pilliroo (Phragmites australis) biogaasi toorainena kasutamise võimalused, Magistritöö, Tallinna Tehikaülikool, 2015, 74 lk. Merlin Christy, P., Gopinath, L., Divya, D. (2014). A review on anaerobic decomposition and enhancement of biogas production through enzymes and microorganisms. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 34, 167-173. doi:10.1016/j.rser.2014.03.010 67 Meslé, M., Périot, C., Dromart, G., Oger, P. (2015). Methanogenic microbial community of the Eastern Paris Basin: Potential for energy production from organic-rich shales. International Journal of Coal Geology, 149, 67-76. doi:10.1016/j.coal.2015.07.002 Nedelkova, M., Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. (2007). Microbacterium isolates from the vicinity of a radioactive waste depository and their interactions with uranium. FEMS Microbiology Ecology, 59(3), 694-705. doi:10.1111/j.1574-6941.2006.00261.x Normak, A., Vollmer, E., Orupõld, K., Kask, Ü. (2009). Biogaasi tootmine ja kasutamine. Käsiraamat. Tartu: Eesti Põllumeeste Keskliit, Tartu, 157 lk. Ostrem, K. (2004) Greening waste: Anaerobic digestion for treating the organic fraction of municipal solid wastes. Earth Engineering Center Columbia University. Master’s thesis. 51 pp. http://www.seas.columbia.edu/earth/wtert/sofos/Ostrem_Thesis_final.pdf. Penger, J., Conrad, R., Blaser, M. (2012). Stable carbon isotope fractionation by methylotrophic methanogenic archaea. Applied and Environmental Microbiology, 78(21), 7596-7602. doi:10.1128/aem.01773-12 Petersell, V. Diktüoneemakilt, energia ja keskkond. Keskkonnatehnika, 2008, 8. Petsch , S.T. Edwards, K.J., Eglinton, T.I. (2005) Microbial transformations of organic matter in black shales and implications for global biogeochemical cycles. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology 219, 157– 170. Plugge, C. M., Van Lier, J. B., Stams, A. J. (2009). Syntrophic communities in methane formation from high strength wastewaters. Microbes at Work, 59-77. doi:10.1007/978- 3-642-04043-6_3 Purwantini, E., Torto-Alalibo, T., Lomax, J., Setubal, J. C., Tyler, B. M., & Mukhopadhyay, B. (2014). Genetic resources for methane production from biomass described with the gene ontology. Frontiers in Microbiology, 5. doi:10.3389/fmicb.2014.00634 Reasoner, D.J., Geldreich, E.E. (1985) A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology, 49(1) 1-7. Rohwerder, T., Sand, W. (2007). Mechanisms and biochemical fundamentals of bacterial metal sulfide oxidation. Microbial Processing of Metal Sulfides, 35-58. doi:10.1007/1- 4020-5589-7_2 Rothman, D. H., Fournier, G. P., French, K. L., Alm, E. J., Boyle, E. A., Cao, C., Summons, R. E. (2014). Methanogenic burst in the end-Permian carbon cycle. 68 Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(15), 5462-5467. doi:10.1073/pnas.1318106111 Sadowski, Z., Szubert, A., Maliszewska, I.H., Jazdzyk, E., 2007. A view on the organic matter and metalloporphyrins biodegradation as characteristic components of black shale ores. Advanced Material Research, 20–21, 95–98. Sabumon, P. (2007). Anaerobic ammonia removal in presence of organic matter: A novel route. Journal of Hazardous Materials, 149(1), 49-59. doi:10.1016/j.jhazmat.2007.03.052 Scheller, S., Goenrich, M., Boecher, R., Thauer, R. K., Jaun, B. (2010). The key nickel enzyme of methanogenesis catalyses the anaerobic oxidation of methane. Nature, 465(7298), 606-608. doi:10.1038/nature09015 Schlegel, M. E., McIntosh, J. C., Petsch, S. T., Orem, W. H., Jones, E. J., Martini, A. M. (2013). Extent and limits of biodegradation by in situ methanogenic consortia in shale and formation fluids. Applied Geochemistry, 28, 172-184. doi:10.1016/j.apgeochem.2012.10.008 Shah, A.F., Mahmood, Q., Shah, M.M., Pervez, A., Asad, A.S. (2014). Microbial ecology of anaerobic digesters: The key players of anaerobiosis. The Scientific World Journal, 2014, 1-21. doi:10.1155/2014/183752 Shen, S., Bowring, S. A. (2014). The end-Permian mass extinction: a still unexplained catastrophe. Nat. Sci. Rev, 1(4), 492-495. doi:10.1093/nsr/nwu047 Sepp, H. (2013) Holotseeni paleokeskkonna muutused Loode-Eestis järvesetete stabiilsete isotoopide ja jälgelementide põhjal Turvaste Valgejärve läbilõikest. Magistritöö, Tartu Ülikool, 46 lk. Souto, T. F., Aquino, S. F., Silva, S. Q., Chernicharo, C. A. (2009). Influence of incubation conditions on the specific methanogenic activity test. Biodegradation, 21(3), 411-424. doi:10.1007/s10532-009-9311-x Toomik, E., (2015), Puidujäätmete komposti mikrobioobikoosluse kirjeldamine. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool, 91 lk. Zhuang, G, (2014) Methylotrophic methanogenesis and potential methylated substrates in marine sediment. Doctoral dissertation, University of Bremen, 187 pp. Ziemiński, K., (2012). Methane fermentation process as anaerobic digestion of biomass: Transformations, stages and microorganisms. African Journal of Biotechnology, 11(18). doi:10.5897/ajbx11.054 Watling, H. (2014). Review of biohydrometallurgical metals extraction from polymetallic mineral resources. Minerals, 5(1), 1-60. doi:10.3390/min5010001 69 Watling, H., Collinson, D., Shiers, D., Bryan, C., Watkin, E. (2013). Effects of pH, temperature and solids loading on microbial community structure during batch culture on a polymetallic ore. Minerals Engineering, 48, 68-76. doi:10.1016/j.mineng.2012.10.014 Vera, M., Schippers, A., Sand, W. (2013). Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation—part A. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(17), 7529-7541. doi:10.1007/s00253-013-4954-2 Voolma, M., Soesoo, A., Hade, S., Hints, R., & Kallaste, T. (2013). Geochemical heterogeneity of Estonian graptolite argillite. Oil Shale, 30(3), 377. doi:10.3176/oil.2013.3.02 Wuchter, C., Banning, E., Mincer, T. J., Drenzek, N. J., & Coolen, M. J. (2013). Microbial diversity and methanogenic activity of Antrim Shale formation waters from recently fractured wells. Frontiers in Microbiology, 4. doi:10.3389/fmicb.2013.00367 Yele, V. U., Desai, K. (2014). A new thermostable and organic solvent-tolerant lipase from Staphylococcus warneri; optimization of media and production conditions using statistical methods. Applied Biochemistry and Biotechnology, 175(2), 855-869. doi:10.1007/s12010-014-1331-2 70 KASUTATUD VEEBIAADRESSID ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Bacillus/fusiformis.html (külastatud 24.05.2016) ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Bacillus/thermoamylovorans.html (külastatud 24.05.2016) ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Bacillus/thermoamylovorans.html (külastatud 24.05.2016) ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Enterobacteria/Enterobacter.html (külastatud 24.05.2016) ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Pseudomonas/stutzeri.html (külastatud 24.05.2016) ABIS Encyclopedia. http://www.tgw1916.net/Staphylococcus/warneri.html (külastatud 24.05.2016) Bacillus - Medical Microbiology - NCBI Bookshelf. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7699/ (külastatud 24.05.2016) Biogaas - Wikipedia, the free encyclopedia http://et.wikipedia.org/wiki/Biogaas (külastatud 01.05.2016) Biogaas – Energiatalgud http://www.energiatalgud.ee/index.php?title=Biogaas (külastatud 01.05.2016) Bioleaching - Wikipedia, the free encyclopedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Bioleaching (külastatud 24.05.2016) BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (külastatud 18.05.2016) http://kivid.blogspot.com/2011_11_01_archive.html (külastatud 12.04.2016) Denitrification - Wikipedia, the free encyclopedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Denitrification (külastatud 26.05.2016) Domeen (bioloogia) - Vikipeedia, vaba entsüklopeedia. https://et.wikipedia.org/wiki/Domeen_%28bioloogia%29 (külastatud (16.05.2016) DyP-type peroxidase family - Wikipedia, the free encyclopedia https://en.wikipedia.org/wiki/DyP-type_peroxidase_family (10.05.2016) EAS | Ettevõtluse Arendamise Sihtasutus, Uuring Eesti argilliidist biogeense metaangaasi puuraugus ( in situ ) tootmise võimalikkuse tõestamiseks. 71 http://www.eas.ee/images/doc/sihtasutusest/uuringud/ettevotlus/uuring-argilliidist- biogeense-metaangaasi.pdf. (külastatud 18.05.2016) Genomes - Genome - NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/1432 (külastatud 24.05.2016) Maavarad http://www.ut.ee/BGGM/maavara/dityoneema.html (12.04.2016) Nitrifikatsioon - Mikroobid erinevate ainete ringetes. http://mikroobidringetes.weebly.com/nitrifikatsioon.html (külastatud 26.05.2016) Porphyrin - Wikipedia, the free encyclopedia https://en.wikipedia.org/wiki/Porphyrin (13.04.2016) Püriit http://www.ut.ee/BGGM/miner/pyriit.html (12.04.2016) R2A Broth - Lab M http://www.labm.com/products/r2a-broth.asp (külastatud 23.05.2016) 72 LISAD LISA 1. Söötmete koostis OxiTop-idele 23.02.2016 73 LISA 2. Isoleeritud tüvede biokeemilised testid Ensümaatiline aktiivsus Gram KOH Raku kuju, agregatsioon 1 GN GN ülipisikesed, diplokokid või batsillid? X + - + + - - - - - - - - - - 2 GN GN ülipisikesed, diplokokid või batsillid? X + - + + - - - - - - - + - - 19 3 GN GN ülipisikesed, diplokokid või batsillid? X + - + + - - - - - - - - - - 4 GN GN ülipisikesed, diplokokid või batsillid? X + - + + - - - - - - - - - - 7 GP/GN GP Väga pisikesed, piklikud, mõned ahelas. + - - - - + - - + 0 - - - - + 9 GP/GN GN Väga väikesed, diplo- või streptokokid? X - - - - - + - - - - - + - + 20 10 GP/GN GP ovaalsed, osad ahelates, osad (sub)terminaalse sporangiumiga + - - / - + + - - - - - - - + 11 GP/GN GP Väga väikesed, lühemates ahelates + - - - - + + - - - - - + - + 12 GP/GN GP Suurtest rakkudest pikad ahelad + - - - F, G - + + - + + + + + - + 5 GP/GN GN Üliväikesed, pulgad X - - + F, G - - + - - + - + + + - 21 6 GP/GN GN Üliväikesed pulgad ja ahelad X - - + F, G - - + - - + + + + + - 8 GP/GN GN Ülipisikesed pulgad, paarispulgad ja ahelad X - - + F, G - - + - - + - + + + - 13 GP/GN GP Väikesed diplokokid ja streptokokid? (pigem pulgad, sh ahelad) + - - - + - - + - - + - + 22 14 GP/GN GP Peenikesed pikad ahelad + - - - - + - - + - - + - + 15 GP GP Väikesed kokid - - - - F - + + - - - - - + - - 16 GP/GN GP Piklikud - - - - - + + - - - + - + - + 17 GP/GN GP Väga väikesed kokid? Mõned vist reas (piklikud?) + - - + O - + - - - + - + + - + 18 GP/GN GN Tetrakokid X - - - F - - + - - - - + + - - 16A 19 GP/GN GP Väikesed, piklikud + - - - - + + - - - - - - + + 20 GP GP Ülipisikesed kokid + - - + F - + + - - + - - + + - 21 GP/GN GN Peenikesed, piklikud X - - - - - + - - - - - + - + 22 GP/GN GN Peenikesed, piklikud X - - - - - + - - - - - + - + 23 GP/GN GN Peenikesed, piklikud, mõned paksemad X - - - - - + - - - - - + - + 24 GP/GN GP Peenikesed, piklikud + - - - - + + - - - - - + - + 25 GP/GN GN Peenikesed, piklikud X - - + F - - - - - + - + + - + 26 GP/GN GP Peenikesed, piklikud - - - - - + + - - - - - + - + 16 27 GP/GN GP Pikad keskmise paksusega ahelad, hiljem pulgad ja lusikad + - - - - + - - - 0 - + + - + 28 GP/GN GN Peenikesed, piklikud X - - - - - + - - - - - + - + 29 GP/GN GN Peenikesed, piklikud, mõned paksemad X - - - - - + - - - - - + - + Katse nr Isolaat Sporulatsioon Denitrifatsioon KingB Liikuvus Ferm/oksüd Oksüdaas Katalaas Ureeaas Indool Tärklis Kaseiin Želatiin Eskuliin β-galaktosidaas ADH DNaas LISA 3. Isoleeritud tüvede biokeemilised testid C-allikad 1 - - - - + + - - - 2-5 (7) 7-11 2 + - + - + + - - - 2-5 (7) 7-11 19 3 + - + - + + - - - 2-5 7-11 4 + - + - + + - - - 2-5 (7) 7-11 7 - 0 0 0 0 0 0 - - 2-7 (7) 7-11 9 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-7 7 (9) 20 10 + - - - - - + - - 2-5 (5) 7-11 11 - 0 0 0 - 0 0 0 - 2-5 12 - + + + - - + + +/- 2-7 5-11 5 + + G + G + G + G + G + G + G +/- 2-7 5-11 21 6 + + G + G + G + G + G + G + G +/- 2-7 5-11 8 + + G + G + G + G + G + G + G +/- 2-7 5-11 13 - - 0 0 0 0 0 0 2 (5) 7-9 22 14 - 0 0 0 + 0 0 0 - 2-5 7-9 15 - + + + +/- +/- + + - 2-10 (5-9) 16 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-7 7-11 17 + + + + - - + + - 2-5 5-11 18 - + + + - - - + + 2-5 (7) 16A 19 - - 0 0 0 - - 0 - 2-10 5-9 (11) 20 - + + + - - + + - 2-10 (5) 7-9 21 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-7 7-11 22 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-5 7-11 23 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-5 7-11 24 - 0 0 0 0 0 + - 2-5 7-11 25 + + + - - - + + - 2-7 5-11 26 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-7 7-9 (11) 16 27 - - + X X X + + - 2-10 7-11 28 - 0 0 0 0 0 0 0 - 2-5 7-9 (11) 29 - - - - 0 - - 0 - 2-5 7-9 Katse nr Isolaat Tsitraat Sahharoos Glükoos Fruktoos Ksüloos Arabinoos Mannoos Maltoos VP Kasv NaCl 2, 5, 7, 10% pH 5, 7, 9, 11 LISA 4. Isoleeritud tüvede 16S rRNA geenifragmendi järjestus Katsed Katsed Katsed Määratud tüvi / Tüvi 16S järgi Klassifikatsioon 28, 28B 29, 29B 30, 30B 1 CP011854.1_Pseudomonas stutzer i strain SLG510A3-8 100% Proteobacteria; Gamma Proteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae 1 1 0 2 CP011854.1_ Pseudomonas stutzeri strain SLG510A3-8 99% Proteobacteria; Gamma Proteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae 1 1 0 19 3 AY571889.1_Pseudomonas sp. HPC26 99% Proteobacteria; Gamma Proteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae 1 1 0 4 X X X X X X 7 KP307815.1_Bacillus subterraneus strain CW27-B11 100% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 1 0 9 KT380670.1_Bacillus humi strain RHM_120 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 1 0 20 10 DQ826581.1_Bacillus fusiformis strain LL 58 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 1 0 11 GQ980247.1_Bacillus sp. NBK45 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 1 0 12 KP998178.1_Bacillus cereus strain R-14 100% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 1 0 5 CP012165.1_Enterobacter cloacae strain 34978 100% Proteoeobacteria; Gamma Proteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae 1 1 0 21 6 CP012165.1_Enterobacter cloacae strain 34978 100% Proteoeobacteria; Gamma Proteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae 1 1 0 8 X X X X X X 13 LN998066.1_Staphylococcus warneri strain mammoth-17 100% Firmicutes; Cocci; Bacillales; Staphylococcaceae 1 1 0 22 14 KT364469.1_Bacillus thermoamylovorans strain O21 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 15 KP771665.1_Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 100% Firmicutes; Cocci; Bacillales; Staphylococcaceae 1 0 1 16 GQ980247.1_Bacillus sp. NBK45 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 17 JQ861547.1_Microbacterium oxydans strain Pp15 100% Actinobacteria; Actinomycetales; Micrococcineae; Microbacteriaceae 1 0 1 18 JX869548.1_Rothia sp. R2A-A1X-SW 100% Actinobacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Micrococcineae; Micrococcaceae 1 0 1 16A 19 KP771665.1_Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 100% Firmicutes; Cocci; Bacillales; Staphylococcaceae 1 0 1 20 KP771665.1_Staphylococcus warneri strain SuMS_N03 100% Firmicutes; Cocci; Bacillales; Staphylococcaceae 1 0 1 21 CP012167.1_Enterobacter cloacae strain 34998 100% Proteoeobacteria; Gamma Proteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae 1 0 1 22 KT380670.1_Bacillus humi strain RHM_120 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 23 X X X X X 24 GQ980247.1_Bacillus sp. NBK45 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 25 HG934375.1_Microbacterium oxydans isolate M3_I7 100% Actinobacteria; Actinomycetales; Micrococcineae; Microbacteriaceae 1 0 1 26 GQ980247.1_Bacillus sp. NBK45 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 16 27 KC545247.1_Bacillus sp. EF1A-B810 100% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 28 X X X X X 29 KT380670.1_Bacillus humi strain RHM_120 99% Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae 1 0 1 Kokku 25 11 14 X - 16S rRNA geeni järgi määramist ei tehtud, sest BOX-PCR-i ja biokeemiliste testide tulemuste põhjal olid väga sarnased mõne teise isolaadiga. Identsus Isolaat Katse nr LIHTLITSENTS Lihtlitsents lõputöö reprodutseerimiseks ja lõputöö üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Mina, Triin Korb (sünnikuupäev: 10.06.1980), 1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) enda loodud teose Biodegradatiivse potentsiaaliga mikroobikooslused Eesti graptoargilliidist, mille juhendaja on Anne Menert, 1.1. reprodutseerimiseks säilitamise ja üldsusele kättesaadavaks tegemise eesmärgil, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace-is lisamise eesmärgil kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni; 1.2. üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Tartu Ülikooli veebikeskkonna kaudu, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace´i kaudu alates 30. mai 2019 kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni. 2. olen teadlik, et punktis 1 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile. 3. kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei rikuta teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse seadusest tulenevaid õigusi. Tartus, 27.05.2016 (kuupäev)