Elektroporatsioon
Elektroporatsiooni kasutatakse laialdaselt loomarakkude, taimerakkude, bakterite ja pärmide transformeerimiseks. Arvatakse, et elektriline impulss tekitab rakumembraanis ajutised poorid ning see võimaldab makromolekulide sisenemise rakku. Pärmirakkude elektroporatsiooniks kasutatakse logaritmilises kasvufaasis olevaid rakke. Elektrilise impulsi andmiseks rakkudele kasutatakse elektroporaatorit ja kas spetsiaalseid küvette või pannakse rakud elektroodide vahele Petri tassil. Parameetrid, mida varieeritakse on: elektriväli (kV/cm), mahtuvus (
F) ja takistus (oom). Nende parameetrite väärtused sõltuvad kasutatavast protokollist ning pärmitüvest.
F) ja takistus (oom). Nende parameetrite väärtused sõltuvad kasutatavast protokollist ning pärmitüvest.
Esimese pagaripärmi rakkude elektroporatsiooni protokolli töötas välja Delorme 1989. a. Optimaalsed tingimused olid:
- pinge 900V
- kõige efektiivsem on kasutada varases logaritmilises faasis olevaid rakke (OD600 = 0.3-1.0)
- kasutatakse vähem kui 0.1 g plasmiidset DNA-d
- kandur DNA lisamine ei ole vajalik
Hiljem täiendati seda protokolli. Hakati lisama selektsioonisöötmesse osmostabilisaatorit (1M sorbitool). Transformatsiooni efektiivsuseks saadi 2-5 x 105 transformanti / g plasmiidse DNA kohta.
g plasmiidse DNA kohta.
Elektroporatsioon võtab vähem aega kui sferoplastide transformatsioon ja LiAc/kandur DNA/PEG transformatsioon. Samas on vajalik spetsiaalne aparatuur ning elektroporatsiooniküvetid.
Elektroporatsiooni meetodi etapid:
- Rakkude ettevalmistus. Rakud kasvatatakse rikkas söötmes tiheduseni 1 x 107 rakku/ml. Seejärel pestakse rakud veega ning säilitatakse -80 oC juures sorbitool-CaCl2-HEPES lahuses. Tähtis on rakkude lõppkontsentratsioon: 1-2 x 109 rakku/ml.
- Elektroporatsioon. Rakkudele lisatakse 0.5-10 ng puhastatud plasmiidset DNA-d. Kasutatakse 0.2 cm elektroodide vahega küvette ning järgmisi tingimusi: pinge 1500 V, takistus 200 oom, elektrimahtuvus 25 F.
- Rakkude väljakülv. Koheselt pärast elektrivooluga töötlust lisatakse rakkudele 1M sorbitooliga sööde ning kasvatatakse mitteselekteerivates tingimustes 1 tund. Seejärel külvatakse rakud selektiivsöötmetele.