GFP liitvalke ekspresseeruv pagaripärmi kollektsioon
GFP ("green fluorescent protein") e. roheliselt fluorestseeruvat valku kodeeriv geen on isoleeritud millimallika Aequorea victoria genoomist. Pärmides kasutatakse selle ühte mutantset vormi S65T, millel on tugevam fluorestsents, ta on fotostabiilsem ja ergastuse lainepikkus on 488 nm. GFP ei vaja fluorestseerumiseks lisafaktorit. Seepärast saab tema ekspressiooni asukohta jälgida elusates rakkudes.
Pärmitüvede kollektsioon, kus valgud ekspresseeruvad kui liitvalgud GFP-ga valmistati Huh ja kaastöötajate poolt.
GFP kodeeriv järjestus liideti pagaripärmi kromosoomis iga avatud lugemisraami (ORF) järjestusega (Joonis 15). Pärmitüvesse transformeeriti PCR produktid, mis sisaldasid lookuse spetsiifilisi homoloogilisi järjestusi, GFP järjestust ja selektsioonimarkerit HIS3MX6. Homoloogilise rekombinatsiooni toimumisel lisandus GFP järjestus ORF-i järjestusele enne selle stop koodonit. Seega ekspresseerus GFP eesoleva ORF-iga samas lugemisraamis ja ekspressioon oli ORF-i promootori kontrolli all. Kollektsiooni valmistamisel sisestati GFP järjestus haploidse pärmitüve 6234 ORF-i järele. Saadi 6029 tüve, kelle kromosoomis asus ORF-i järel GFP järjestus. Liitvalkude ekspressiooni uurimiseks kasutati fluorestsents mikroskoopi. Rakkude analüüsil selgus, et 4156 tüve (so. 67% valmistatud tüvedest) puhul on võimalik detekteerida GFP signaal, mis erines GFP-d mitteekspresseeruvatest rakkudest. Need 4156 liitvalku moodustavad 75% pärmi proteoomist. GFP signaali järgi klassifitseeriti liitvalkude lokalisatsioon rakus: raku perifeeria, pung, punga kael, tsütoskelett, mikrotorukesed, tsütoplasma, tuum, mitokonder, endoplasmaatiline retiikulum, vakuool, vakuooli membraan, punkidena, ühtlaselt. Lisaks viidi läbi kolokalisatsiooni analüüs. See võimaldas liitvalkude lokalistasiooni täpsustada. Lisati järmised katekooriad: aktiiniga kolokalistasioon, käävi organiseeriv keskus, tuumake, tuumamembraan, Golgi kompleks, transpordi vesiikulid, endosoom, peroksüsoom, lipiidide partiklid.
Joonis 15. GFP liitvalke ekspresseerivate pärmitüvede tegemise strateegia.