TAP liitvalke ekspresseeriv pagaripärmi kollektsioon
TAP ("tandem affinity purification") järjestus koosneb kalmoduliini siduva peptiidi järjestusest, TEV proteaasi lõikamise kohast ja kahest Staphylococcus aureus valk A IgG sidumise domeeni kodeerivast järjestustest. TAP järjestus võimaldab valkude kahe-etapilist puhastamist. Esmalt seotakse valgud IgG-ga kaetud kandjale. TEV proteaas lõikab puhastatava valgu kandja küljest lahti. Teises etapis seotakse uuritav valk Ca2+ juuresolekul kalmoduliiniga kaetud kandjale. Valk elueeritakse etüleen-glükool-tetraäädikhappega (EGTA).
TAP liitvalke ekspresseeriv pagaripärmi tüvede kollektsioon valmistati Ghaemmaghami ja kaastöötajate poolt.
Kollekstiooni valmistamisel lisati iga pagaripärmi genoomis oleva avatud lugemisraami (ORF) järjetsue järele TAP järjetsut kodeeriv järjestus (Joonis 16). Haploidsesse pärmitüvesse transformeeriti PCR porduktid, mis sisaldasid lookuse spetsiifilsi homoloogilisi järjestusi, TAP järjestust ja selektsioonimarkerit HIS3MX6. Homoloogilise
rekombinatsiooni toimumisel lisandus TAP järjestus ORF-i järjestusele
enne selle stop koodonit. Seega ekspresseerus TAP eesoleva ORF-iga
samas lugemisraamis ja ekspressioon oli ORF-i promootori kontrolli all. Alustati 6234 tüve konstrueerimisega. Valgu ekspressiooni uurimiseks kasutati Western blot meetodit. 4251 tüve puhul detekteeriti liitvalgu ekspressioon.
Joonis 16. TAP liitvalke ekspresseeriva kollektsiooni valmistamise strateegia.
Kollektsiooni kasutati rakus sisalduvate valkumolekulide arvu mõõtmiseks. Kasutati kvantitatiivset Western blot analüüsi. Lisaks uuritavale liitvalgule määrati sisemise standardvalgu kogus. Leiti, et erinevate valkude hulk rakus varieerub väga palju: 50 molekulist kuni 106 molekulini raku kohta.