TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT Ursula Ilo Vastsündinute laiendatud skriining kaasasündinud ainevahetushaiguste suhtes tandem mass-spektromeetria meetodil Magistritöö Juhendajad: Katrin Õunap, M.D., Ph.D Kadi Künnapas, MSc Karit Reinson M.D. Neeme Tõnisson, M.D., Ph.D TARTU 2015 SISUKORD KASUTATUD LÜHENDID……………………………………………………………….. 4 SISSEJUHATUS……………………………………………………………………………. 5 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE………………………………………………………. 6 1.1. Kaasasündinud ainevahetushaigused………………………………………………. 6 1.2. Vastsündinute sõeltestimine……………………………………………………….. 8 1.2.1. Sõeltestimise definitsioon ja kriteeriumid……………………………………… 8 1.2.2. VS meetodite ajalooline ülevaade……………………………………………… 9 1.2.3. MS/MS sõeltestimises…………………………………………………………. 10 1.2.3.1. VS MS/MS meetodi tööpõhimõte…..…………………………………………. 11 1.2.3.2. Ioonide skaneerimise võtted………………………………………………….. 12 1.2.4. MS/MS metoodika eelised ja piirangud……………………………………….. 13 1.2.5. Tehnoloogia mõju VS põhimõtetele…………………………………………… 15 1.3. MS/MS metoodikal põhineva skriiningu protokolli varieerumine……………….. 16 1.3.1. Proovide derivatiseeerimine…………………………………………………… 16 1.3.2. Suktsinüülatseooni analüüs I tüüpi türosineemia identifitseerimiseks……..…. 17 1.4. Erinevate riikide kogemus laiendatud VS-l…………………………………..….. 18 1.5. Rahvusvaheline koostöö……………………………………………………..….. 20 1.6. Sõeltestimise efektiivsus ja eetika…………………………………………..…… 21 1.7. Sõeltestimine Eestis………………………………………………………...……. 22 2. EKSPERIMENTAALOSA………………………………………………………. 24 2.1. Töö eesmärgid…………………………………………………………..……….. 24 2.2. Materjal ja metoodika…………………………………………………………..... 24 2.2.1. Proovid………………………………………………………………….....…. 24 2.2.2. Tarvikud, kemikaalid ja aparatuur…………………………………………… 24 2.2.3. Proovide ettevalmistus………………………………………………....…..... 25 2.2.4. UPLC-MS/MS süsteem……………………………………………………… 26 2.2.5. Verifitseerimine ja kvaliteedikontroll……………………………….….....…. 28 2.2.6. Võrdluskatsete läbiviimine ja interpretatsioon…………………………...….. 29 2.2.7. Protsentiilide arvutamine………………………....………………………….. 30 2.2.8. Eetika……………………………………………………………….…...…… 30 2 2.3. Tulemused………………………………………………………………………… 30 2.3.1. Meetodi verifitseerimine……………………………………………...….……. 31 2.3.2. Võrdluskatsete interpretatsioon……………………………………....……….. 31 2.3.3. Metaboliitide otsusepiiride määramine…….…....……………………………. 35 2.3.4. Pilootprojekti koondtulemused………………………………………….……. 37 2.4. Arutelu………………………………………………………………….....……… 38 KOKKUVÕTE…………………………………………………………………….……… 43 SUMMARY………………………………………………………………………....……. 44 TÄNUAVALDUSED……………………………………………………………...…....... 46 KASUTATUD KIRJANDUSE LOETELU…………………………....……………….… 47 LISA 1……………………………………………………………………………...……... 55 LISA 2…………………………………………………………………………………….. 56 LISA 3…………………………………………………………………………………….. 58 LIHTLITSENTS……………………………………………………………………….…. 60 3 KASUTATUD LÜHENDID ACMG – American College of Medical Genetics CPT I – karnitiin palmitoüültransferaas puudulikkus tüüp I (carnitine palmitoyltransferase deficency type I) ERNDIM - väline kvaliteedi kontrolli süsteem (European Research Network for Evaluation and Improvement of Screening, Diagnoosis and Treatment of Inherited Disorders of Metabolism) GC – gaasikromatograafia (gas chromatography) CH – kaasasündinud hüpotüreoos (congenital hypothyreoidism) FPR – valepositiivsete tulemuste osakaal (false positive rate) HCU – homotsüsteinuuria (homocystinuria) LC – vedelik-kromatograafia (liquid chromatography) MCAD – keskmise ahelaga atsüül-CoA dehüdrogenaasi puudulikkus (medium chain CoA- dehydrogenase deficiency) MMA – metüülmalonaatatsiduuria (methylmalonic acidemia) MS/MS – tandem mass-spektromeetria (tandem mass spectrometry) MSUD - vahtrasiirupitõbi (maple syrup urine disease) MRM – multiple reaction monitoring NL – neutral loss scan PKU – fenüülketonuuria (phenylketonuria) PPA – propionaatatsiduuria (propionic acidemia) PPV – positiivne ennustav väärtus (positive predictive value) R4S – rahvusvaheline Mayo kliiniku hallatav koostööprojekt (Region 4 Stork) SucA – suktsinüülatsetoon TYR I – I tüüpi türosineemia (tyrosinemia type I) VLCAD – väga pika ahelaga atsüül-CoA dehüdrogenaasi puudulikkus (very long chain acyl- CoA dehydrogenase deficiency) VS – vastsündinute skriining 4 SISSEJUHATUS Kaasasündinud ainevahetushaigused on rühm pärilikke haigusi, mille korral esineb organismis spetsiifiline biokeemiline kõrvalekalle, mis põhjustab raskeid metabolismi häireid. Haigused võivad avalduda juba vastsündinu eas, aga ka täiskasvanutel, ning tekitada arengule pöördumatut kahju. Haiguste kliiniline pilt on väga varieeruv ning mõjutatud võivad olla mitmed organid ja organsüsteemid (Blau et al., 2006). Mitmete haiguste jaoks on kättesaadavad ravimeetodid, mis ennetavad püsivate kahjude teket, kui haigus avastatakse piisavalt varakult. Selliste patsientide avastamiseks on välja töötatud populatsioonipõhine vastsündinute sõeltestimine ehk skriining (VS) – esimestel elupäevadel teostatav testimine mitmesuguste kaasasündinud haiguste suhtes. Skriiningu eesmärk on tagada patsientidele ravi alustamine haiguse asümptomaatilises või varases perioodis. Isegi kui sõeltestitavad ainevahetushaigused on äärmiselt harvaesinevad, siis varase avastamise ning ravi alustamisega suudetakse vähendada koormust patsientidele ja meditsiinisüsteemile tervikuna (Venditti et al., 2003). Alates 1960-ndatest aastatest on arendatud analüütilisi meetodeid, et identifitseerida vastsündinute verest spetsiifiliste metaboliitide või hormoonide kõrvalekaldeid usaldusväärselt ning kulutõhusalt. Kuni 1990-ndate aastateni kehtis juurutatud sõeltestimise programmides põhimõte „üks analüüs – üks metaboliit – üks haigus“, kuid tänu tandem mass-spektromeetria (MS/MS) meetodi jõulisele arengule on täna võimalik testida vastsündinuid ühe analüüsi abil kümnete erinevate haigusseisundite suhtes. See on võimaldanud kliinilises laboris töösse rakendada laiendatud skriiningu programmid (Chace, 2003). Käesolev magistritöö annab ülevaate vastsündinute sõeltestimise ajaloost, MS/MS metoodika rakendamisest vastsündinute sõeltestimisel, meetodite täiustumisest ning juurutatud sõeltestimise programmidest erinevates riikides. Uurimustöö eksperimentaalne eesmärk on hinnata laiendatud VS meetodi töökindlust laborisiseste ja -väliste kvaliteedi kontrolli analüüside alusel, selgitada välja Eesti populatsiooni haiguslikele kõrvalekalletele iseloomulikud metaboliitide otsusepiirid ja anda ülevaade pilootprojekti koondtulemustest. 5 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1. Kaasasündinud ainevahetushaigused Metabolism on terviklik elusorganismis toimuvate reaktsioonide kogum. Kaasasündinud ainevahetushaigused on geneetilised häired, mida põhjustab kindla keemilise reaktsiooni kõrvalekalle ainevahetusrajas (Lanpher et al., 2006). Esimesena formuleeris mõiste „kaasasündinud ainevahetushaigused“ Archibald Garrod kirjeldamaks geneetiliselt determineeritud haigusseisundeid nagu alkaptonuuria, albinism ja tsüstinuuria (Garrod, 1908). Ehkki iga ainevahetushaigus eraldiseisvalt on harvaesinev, on tervikuna haiguste grupi üldine esinemissagedus märgatavalt suurem. Erinevate allikate alusel on haiguste esinemissagedus keskmiselt 1:2907 vastsündinu kohta (Lindner et al., 2011) kuni 1:2500 (Applegarth et al,, 2000). Kaasasündinud ainevahetushaigusi saab klassifitseerida sõltuvalt mõjutatud organist või organsüsteemist; mõjutatud raku organelli järgi (mitokondriaalsed, peroksüsomaalsed, lüsosomaalsed) või patsiendi vanuse järgi sümptomite kujunemisel (neonataalsed, lapseea ja täiskasvanueas avalduvad haigused). Kuna erinevad lähenemised on informatiivsed, siis ühtset ja universaalset klassifikatsiooni ei eksisteeri (Lanpher et al., 2006). Levinud klassifikatsiooni süsteem jagab ainevahetushaigused kaheks grupiks, sõltuvalt sellest, kas haaratud on suured või väikesed molekulid. Antud klassifikatsioon hõlmab nii haiguse patofüsioloogiat, kliinilist pilti kui ka raviplaani (Applegarth et al., 1989). Kaasasündinud ainevahetushaiguste patogeneesi saab kirjeldada kui funktsiooni kadu või lisandumist, mida põhjustavad mutantsed valgud (enamasti ensüümi või transporteri funktsionaalsusega). Haiguste grupi geneetiline taust on heterogeenne ning võib tuleneda nii ühest kui mitmest punktmutatsioonist, deletsioonist, insertsioonist või genoomi ümberkorraldustest, mis võivad esineda nii kodeerivates kui regulatoorsetes järjestustes (Lanpher et al., 2006). Ainevahetushaigusi põhjustavate mutatsioonide bioloogilisi efekte iseloomustavad neli peamist protsessi on kujutatud joonisel 1. 6 Joonis 1. Ainevahetushaiguste patogeneesi mehhanism. Ensümaatilise blokaadi efekti tulemuseks on: a) otsene toksilise üleneva substraadi akumulatsioon (S); b) alaneva produkti (substraadi) defitsiit (P); c) alternatiivsete radade aktivatsioon ja alternatiivse tee metaboliitide (C) produktsioon (Lanpher et al., 2006 järgi). Ainevahetushaigusi põhjustavad kõrvalekalded avalduvad metaboliitide kuhjumise, transporthäire või energiadefitsiidina, mis põhjustavad erinevaid tervisehädasid. Esmaseks kliiniliseks avaldumiseks võib olla näiteks elundite arengu häired, vaimse arengu mahajäämus, psüühikahäired, äkksurm jm. Sageli on esmased sümptomid mittespetsiifilised ning seetõttu on õigeaegne diagnoosimine ja ravi keeruline. Ravi hilinenud alustamisega pole alati võimalik tekkinud kahjustusi olematuks muuta (Blau et al., 2006). Kaasasündinud ainevahetushaigused võivad olla pleiotroopsed ning mõjutada kõiki organeid ja organsüsteeme. Traditsiooniliselt on kaasasündinud ainevahetushaigustega seotud mutatsioone peetud klassikalisteks Mendeli seaduste alusel päranduvateks tunnusteks, kus iga haigusseisundit põhjustab mutatsioon kindlas geenis. Tänu teadmiste avardumisele ainevahetushaiguste patogeneesi protsesside kohta, on järjest enam informatsiooni, et teatud juhtudel on haigusseisundite puhul tegemist komplekssete geenide ja keskkonna vaheliste interaktsioonidega ning geenide ja toitainete vaheliste interaktsioonidega, mis põhjustavad patsiendil komplekshaigusi (Dipple ja McCabe, 2000). Joonis 2. Kaasasündinud ainevahetushaigused ja metaboolsed võrgustikud. Kõrvalekaldega ainevahetusrajad on märgitud punaselt ja mõju ulatust iseloomustab joone tugevus. Klassikaliste kaasasündinud ainevahetushaiguste puhul on tugevalt mõjutatud primaarne ainevahetusrada. Komplekshaiguste korral on mõjutatud mitu ainevahetusrada üheaegselt. (Lanpher et al., 2006 järgi). 7 1.2.Vastsündinute sõeltestimine 1.2.1. Sõeltestimise definitsioon ja kriteeriumid Vastsündinute sõeltestimine ehk skriining on esimestel elupäevadel teostatav testimine mitmesuguste kaasasündinud haiguste suhtes, et tagada patsientidele ravi alustamine haiguse asümptomaatilises või varases perioodis.1 Positiivse testi tulemusega kaasnevad VS programmis kliinilist leidu kinnitavad analüüsid (ensümaatilised ja/või molekulaarsed) ning perekonna geneetiline nõustamine. Populatsioonipõhise sõeltestimise läbiviimise põhimõtted formuleerisid 1968. aastal Wilson ja Junger (Wilson ja Junger, 1968) ning nendest juhindub ka Maailma Tervishoiuorganisatsioon. Kriteeriumide eesmärk on tagada, et sõeluuringu programm oleks efektiivne ja kasulik nii indiviidile kui ka ühiskonnale laiemalt. Tabel 1. Sõeltestimise kriteeriumid Wilsoni ja Jungeri järgi. 1. Testitav haigus peab olema tõsine terviseprobleem ning põhjustama patsiendi tervise olulist halvenemist või enneaegset surma. 2. Diagnoositud patsientidele peab leiduma aktsepteeritav ravimeetod, mis parandab haiguse loomulikku kulgu. 3. Diagnoosimiseks ja ravimiseks on kättesaadavad vajalikud oskused ja vahendid. 4. Haiguse patogeneesi protsessis peab esinema latentne või varane sümptomaatiline periood, mis on äratuntav või testimisel tuvastatav. 5. Välja on töötatud sobiv testimise või uuringu metoodika, mis on tundlik ja ohutu. 6. Testimine on kättesaadav ning seda saab kohandada populatsioonile. 7. Haiguse loomulik kulg ja progressioon on täpselt teada. 8. Peavad olema selged kriteeriumid, mille alusel patsiente diagnoosida ja ravida. 9. Sõeltestimine ja leitud haigusjuhu kinnitamine (sh diagnoosi kinnitavad uuringud ja ravi) on tervishoiusüsteemile tervikuna kulutõhus. 10. Sõeltestimine ei tohiks olla ühekordne projekt, vaid pidev protsess. Kuna neile kriteeriumitele on täielikult vastanud vaid vähesed analüüsid ja haigused, siis kogu populatsiooni hõlmavad programmid, sh VS, on ajalooliselt olnud suunatud vaid väheste haiguste diagnoosimiseks (Rousseau et al., 2012). Riigiti on testitavate haiguste arv erinev ning 1 http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=newbornscreening 8 põhineb peamiselt tervishoiuvaldkonnas kasude ning riskide suhte hinnangutel (Chace et al., 2003). VS on oluline, sest võimaldab identifitseerida pealtnäha terved imikud, kellel esinevad tõsised pärilikud, tihti ainevahetuse kõrvalekalletega seotud haigused. Neid haigusi saab dieetravi ja ravimite manustamisega ravida enne, kui kaasneb tõsine haigestumine või suremus (Abhyankar et al., 2010). On väidetud, et VS programmide näol on tegemist ühe olulisema laste tervist parandava meetmega viimase sajandi jooksul (Carlson, 2004). Laiendatud sõeltestimisel on võimalik ühe testiga identifitseerida erinevaid haigusi ning seeläbi ennetada tõsiseid tagajärgi (Wilcken, 2010; Waisbren, 2008). 1.2.2. VS meetodite ajalooline ülevaade Üleüldine vastsündinute kaasasündinud ainevahetushaiguste sõeltestimine algas 1960-ndatel aastatel, kui Guthrie ja Susi arendasid välja bakteriaalse inhibitsiooni analüüsi meetodi hindamaks fenüülalaniini väärtust filterpaberile kogutud vereproovidest, mida tuntakse ka „Guthrie testi“ nime all (Guthrie ja Susi, 1963). Antud meetod tõi meditsiinipraktikasse testimise fenüülketonuuria (PKU) suhtes ning võimaldas vältida neuroloogilise arengu probleeme, mis esinesid ravita jäänud patsientidel. Meetod oli nii tõhus ja töökindel, et USA-s jt. arenenud riikides hakati kiirelt kõiki vastsündinuid testima esimestel elupäevadel (Paul, 1997). Tänaseks on PKU klassikaline näide hästitöötavast sõeltestimise praktikast, mis on laialt aktsepteeritud ning muutunud standardravi osaks kõikides arenenud riikides (Lehotay et al., 2011). Guthrie töö tulemusel arendati testimise metoodikad ka galaktoseemia, vahtrasiirupi tõve (MSUD) ja homotsüteinuuria (HCU) testimiseks. 1970-ndatel kui arendati immuunanalüüsid türoksiini ja kilpnääret stimuleeriva hormooni (TSH) mõõtmiseks, hakati vastsündinuid testima ka kaasasündinud hüpotüreoosi (CH) suhtes. Et muuta sõeltestimine efektiivsemaks, üritati arendada teste, mis võimaldaks ühe analüüsi põhjal identifitseerida erinevaid haigusi. Selleks prooviti välja töötada kromatograafilisi meetodeid bakteriaalsete analüüside asemel (Efron et al., 1964; Scriver et al., 1964). Kuid paberkromatograafia ei olnud siiski piisavalt tundlik. Tundlikkuse tõstmiseks ja testitavate haiguste spektri laiendamiseks võeti kasutusele õhukese kihi kromatograafia, mille abil analüüsiti vastsündinute uriiniproove (Levy et al., 1980). Kuid uriini kasutamisel esinesid analüütilised piirangud: esiteks vajas analüüs lisa proovimaterjali, sest uriini põhjal ei olnud võimalik identifitseerida PKU-d ja CH-d, mis olid vastsündinute skriiningu programmide 9 olulised komponendid. Teiseks pidi uriiniproovi koguma lapsevanem või arst pärast sünnitusmajast lahkumist, mis tekitas programmi juurutamises logistilisi probleeme. Kolmandaks varieerub uriini kontsentratsioon suurtes piirides ning põhjustab valepositiivseid ja valenegatiivseid tulemusi. Esimesed põhjustavad mittevajalikke lisaanalüüse ja teised jätavad patsiendil haiguse identifitseerimata. Lisaks on mitu uriinist diagnoositavat haigust kliiniliselt kahjutud (Levy et al., 1980). Sõeltestimine jätkus põhimõttel „üks test – üks haigus“ (Levy, 1998). Sõeltestimise algusest lisati VS paneelidesse üksikuid uusi haigusi. Mitmed riigid on sõeltestimise paneelidesse veelgi lisanud kaasasündinud ainevahetushaigusi: galaktoseemia, tsüstiline fibroos, kongenitaalne adrenaalne hüperplaasia ja türosineemia (Pitt, 2010). Laiendatud testimist pidurdas eelkõige asjaolu, et iga konkreetse haiguse diagnoosimine vajas spetsiaalse meetodi väljatöötamist ning analüüsi eraldi teostamist, mis muutis testimise aja- ja töömahukaks (Paul, 2008). Hinnanguliselt testitakse praegu umbes 25% kõikidest vastsündinutest maailmas vähemalt CH suhtes (Wilcken, 2007). Paljudki haigused on olnud skriiningu programmide kandidaadid, kuid kõikide haiguste jaoks ei ole testimine praktiline (Pitt, 2010). 1.2.3. MS/MS sõeltestimises MS/MS võeti kliinilistes laborites kasutusele 1980-ndatel aastatel (Garg ja Dasouki, 2006). 1990-ndatel aastatel kirjeldasid Millington, Roe ja kolleegid MS/MS metoodika potentsiaalset sobivust mitmete analüütide samaaegseks testimiseks vereplekkidest VS programmides. Peatselt näidati uue meetodi praktilist väärtust kaasasündinud ainevahetushaiguste diagnoosimisel (Chace et al., 1993 ja 1995; Rashed et al., 1995; Ziadeh et al., 1995). Algne meetod sisaldas tehnilisi piiranguid, mis puudutasid läbilaskevõimet, sest puudus piisav automatiseeritus (Pollitt, 2006). Laboriprotsessi lihtsustasid biomolekulide elektronpihustusmeetodil ioniseerimine, kommertsiaalselt arendatud robustsed ning kergelt puhastatavad ioonisatsiooni allikad ning andmete analüüsimise automatiseeritud süsteemid (Rashed et al., 1995; Pollitt, 2006). MS/MS tehnoloogia sobib skriiningu programmides kasutamiseks, sest meetod võimaldab erinevate analüütide samaaegset analüüsimist, tagab suure läbilaskevõime (2-3 minutit proovi kohta) ja madalad reagentide kulud laborile. MS/MS meetod on ka äärmiselt tundlik ja spetsiifiline (Chace, 2009). 10 Fundamentaalsed arengud MS/MS metoodikas metaboliitide analüüsiks, mis juurutati 1990- ndate alguses, on kasutusel tänaseni. Enam kui kakskümmend aastat ioniseerimise tehnikate, protsessi automatiseerimise ja andmete analüüsi täiustamist on võimaldanud vastsündinute sõeltestimise mahtusid suurendada käputäiest patsientidest kuni mitme tuhande proovini päevas (Chace et al., 2003). 1.2.3.1. VS MS/MS meetodi tööpõhimõte Enne MS/MS masinasse süstimist analüüdid ekstraheeritakse vereplekkidest ning derivatiseeritakse, et tõsta analüüsi tundlikkust ja spetsiifilisust. VS-s kasutatakse butanooliga derivatiseerimist, kus moodustuvad aminohapete, orgaaniliste hapete ja atsüülkarnitiinide butüülestrid (proovide derivatiseerimist käsitleb täpsemalt kirjanduse ülevaate alalõik 1.3.1.). MS/MS meetod on piisavalt kiire, tundlik ning spetsiifiline, et VS puhul kromatograafilist eraldamist analüütilisel kolonnil ei toimu. Enamasti kasutatakse kapillaari või väiksest kolonni, millega saadakse piisavalt lai proovi piik, et teostada kõik vajalikud mõõtmised. Massispektromeetriliseks analüüsiks peavad analüüsitavad ühendid olema gaasifaasis laetud olekus. Selle saavutamiseks kasutatakse elektropihusutsionisatsiooni (electrospray ionization) meetodit: proov pihustatakse lämmastikuvoos ning pihusti ja MS-i sisendi vahel rakendatakse suur potentsiaalide erinevus. Tulemusena tekivad laetud tilgad, mis suunatakse massispektromeetrisse. Tilgad kuivatatakse ning järgi jäänud laetud analüüdi molekulid suunatakse esimesse kvadrupool tüüpi massifiltrisse. Filtri läbivad vaid kindlad, huvitava massi ja laengu suhtega ioonid nn. eellasioonid. Need suunatakse edasi kollisioonirakku, kus toimub eellasioonide lõhkumine väiksemateks tükkideks – fragmenteerimine. Laetud molekulid põrgatatakse vastu inertgaasi (N2, Ar, He) molekule, mille tulemusel molekulid lagunevad väiksemateks molekulile iseloomulikeks tükkideks - tütarioonideks. Laetud iseloomulikud fragmendid juhitakse edasi teise massifiltrisse, mida läbivate ioonide hulk detekteeritakse. Detektorilt saadav signaali intensiivsus on aluseks ühendi sisalduse määramisel (Garg ja Dasouki, 2006). MS/MS analüüsi põhimõtet illustreerib joonis 3. 11 Joonis 3. MS/MS metoodikal põhineva sõeltestimise protsessi skeem. Proov valmistatakse ette ning süstitakse MS/MS-i. MS-1 eraldab ioonid nende massi ja laengu suhte alusel (m/z). Valitud ioonid viiakse kiirenduskambrisse (MS-2, mis on samuti mass-spektromeeter, kus esineb inertse gaasi vool kokkupõrgete indutseerimiseks), kus toimub kindlate ioonide fragmenteerumine. MS-3 eraldab fragmenteerunud ioonid ning suunab nad detektorisse. Andmeanalüüs hõlmab ioonide identifitseerimist, kvantifitseerimist ja kõrvalekalletega tulemuste märkimist (Garg ja Dasouki, 2011 järgi). 1.2.3.2. Ioonide skaneerimise võtted Sõltuvalt teostatavast analüüsist saab MS/MS kasutada mitmes erinevas skaneerimise režiimis: (1) Precursor ion scan detekteerib kõik eellasioonid, mis tekitavad ühetaolise fragmendi, (2) Neutral loss scan (NL) detekteerib kõik eellasioonid, mis kaotavad fragmentatsioonis ühesuguse molekuliosa. Skaneerimise võtted, mida kasutatakse vastsündinute laiendatud skriiningus MS/MS meetodil, on skemaatiliselt kujutatud joonisel 4 ja atsüülkarnitiinide ning α-aminohapete puhul reaktsioonina joonisel 5 (Garg ja Dasouki, 2006). Joonis 4. Erinevate MS/MS skaneerimise režiimide skemaatiline kujutamine. Precursor ion scan: esimene mass-spektromeeter võimaldab valitud ioonide (A, B, C) ülekandmise, kolmas mass-spektromeeter analüüsib spetsiifilist fragmentiooni (X), mis on moodustunud algselt valitud ioonidest. Skaneerimist kasutatakse ühendite puhul, mis moodustavad ühesuguse fragmenteerunud iooni nagu atsüülkarnitiinid. Neutral loss scan: esimene ja kolmas mass-spektromeeter analüüsivad ioone, mis erinevad konkreetse massi ühiku poolest (võrdne neutraalse fragmendiga, N). Skaneerimist kasutatakse ühendite puhul, mis tekitavad ühesuguse neutraalse molekuli nagu α- aminohapped. Selected Ion Monitoring: kõik mass-spektromeetrid on staatilised ning analüüsivad ainult eelvalitud ioone (A, A1). Režiimi erivariant on Multiple Reaction Monitoring (MRM), mis võimaldab ühe või mitmete erinevate eellasioonidele vastavate tütarioonide detekteerimist (Garg ja Dasouki, 2006 järgi). 12 Joonis 5. Kokkupõrkest indutseeritud atsüülkarnitiinide ja fenüülalaniini (α-aminohappe näide) butüülestri derivaatide dissotsiatsioon. Atsüülkarnitiinidele on iseloomulik ühesuguse fragmentiooni (m/z 85). moodustumine ning α-aminohapped kaotavad ühesuguse neutraalse fragmendi (102 Da) (Chace et al., 2009 järgi). Tervikliku aminohapete profiili määramiseks on vajalik kasutada erinevaid tüüpe skaneerimist. Selected ion monitoring tüüpi skaneerimine võimaldab optimeerida MS analüüsi parameetreid ning skaneerimise funktsioone, mis on vajalikud aminohapete detekteerimiseks, millel on erinev fragmenteerumise muster (näiteks arginiin, ornitiin, tsitrulliin), millel on kergelt fragmenteeruv funktsionaalne rühm (Chace et al., 2005). Ornitiini ja tsitrulliini puhul kasutatakse NL 119 Da, (102 Da formaat + 17 Da ammoniaak), arginiini puhul NL 161 Da (Chace et al., 2003). MS/MS meetod võimaldab kombineerida erinevaid skaneerimise võtteid, ei vaja sekundaarset süstimist masinasse ega proovide ettevalmistamise modifikatsioone. Tulemuseks on täielik atsüülkarnitiinide ja aminohapete profiil (Chace et al., 2005). 1.2.4. MS/MS metoodika eelised ja piirangud MS/MS tehnoloogia võimaldab VS-le uut lähenemist ning võimekust korraga testida enam kui kolmekümmend ainevahetushaigust ühe analüüsi käigus, väikesest vereproovist ning lihtsa protokolli alusel (Chace et al., 2003). Analüütide paralleelne mõõtmine on ka kliiniliselt efektiivne, sest ainevahetushaiguse diagnoosimisel tuleb korraga määrata rohkem kui ühte markerit, mis iseloomustab konkreetset haigust. Lisaks on võimalik määrata patsiendi täielik metaboolne profiil. Sellega kaasneb aga meetodi üks suuremaid puudusi – mõned MS/MS poolt detekteeritud kõrvalekalded võivad olla kliiniliselt kahjutud. See tõstatab eetilise küsimuse, kuidas labor ja arstid peaksid ümber käima informatsiooniga, millele ei ole kinnitatud kliinilist väärtust (Rhead et al., 2002; Lehotay et al., 2011). Avaldatud andmetest selgub kindlalt, et MS/MS meetodil vastsündinute sõeltestimise läbiviimisel kaasneb kõrgem haigusjuhtude leidmise sagedus võrreldes kliiniliselt diagnoositud patsientidega. Mõne haiguse puhul on erinevus isegi kuni kahekordne (Grosse et al., 2006; 13 Rhead, 2006; Wilcken et al., 2007). Samuti varieerub mutatsioonide spekter skriiningul tuvastatud ja kliiniliselt diagnoositud patsientide vahel (Andresen et al., 2001), mis muudab keeruliseks skriiningu tulemuste võrdlemise varem diagnoositud patsientidega (Wilcken, 2007). Tehnoloogia analüütiline võimekus kõigi mõõdetavate analüütide osas ei ole ühtlane. Seega võib esineda osa oluliste haiguste puhul kõrgem valepositiivsete tulemuste osakaal (FPR) võrreldes traditsiooniliste meetoditega (Chace et al., 2003). I tüüpi türosineemia (TYR I) identifitseerimisel viis see probleem mitme sekundaarse testi arendamiseni, mis algselt vajasid eraldi protokolli (Magera et al., 2006; Sander et al., 2006; la Marca et al., 2008), kuid tänaseks on kombineeritud atsüülkarnitiinide ja aminohapete analüüsi protokoll (Metz et al., 2011). MS/MS limiteeriv faktor on ka diagnostilise dilemma tekkimine, kui üks või mitu markerit on seotud erinevate haigusseisunditega. Näiteks C5OH on väga tõsise haiguse, holokarboksülaasi süntaasi defitsiidi marker ning samuti üldiselt kahjutu kõrvalekalde, 3-metüülkrotonüül-CoA karboksülaasi puudulikkuse marker (Dantas et al., 2005; Koeberl et al., 2003). Metaboliitide kindlale haigusseisundile spetsiifilise vastavuse parandamiseks kasutatakse diagnoosimisel metaboliitide suhtarve. Paljud kliiniliselt tähenduslikud suhtarvud on kirjanduses avaldatud (ACMG, 2006; De Jesus et al., 2010; Lehotay et al., 2011). Diagnostilise probleemi lahenduseks kasutatakse haiguse identifitseerimisel primaarseid markereid ja metaboliitide suhete määramist, enamasti andmeanalüüsi meetoditega. Sõeltestimise programmi tulemuslikkuse parameetrid sõltuvad paneeli lisatud testide otsusepiiridest (cut-off väärtused). Kui haiguse diagnoosimise lävi on liiga kõrge, jääb hulk vastsündinute haigusi avastamata. Kui lävi on aga liiga madal, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Testitavate haiguste spekter on järjest laiem ning iga haigus eraldiseisvalt harvaesinev. Seega on järjest juurutatud ka sekundaarseid kinnitavaid teste, mis on komplekssemad, aeganõudvamad ega sobi kõrge läbilaskevõimega skriininguks, kuid on võimsuselt tundlikumad ja spetsiifilisemad. Sekundaarsete testide peamine eesmärk on vähendada FPR-i (Rousseau et al., 2012). USA andmetest lähtub, et peaaegu 100% tundlikkuse ning 99,6% spetsiifilisusega teostatud analüüsist MSUD suhtes leiti, et 1249-st algsest positiivsest tulemusest oli tõeliselt positiivne kõigest 18 vastsündinu tulemus (kokku testiti 3 364 612 vastsündinut) (President’s Council of Bioetchics, 2008) . Seega on vastsündinute sõeltestimise protokollide oluline osa diagnostiliste kinnitavate analüüside läbiviimine enne kliinilist sekkumist, et vältida mittevajalikku ravi. On 14 seatud ka analüütilised ja post-analüütilised eesmärgid laiendatud VS läbiviimisel MS/MS analüüsil: valepositiivsete tulemuste osakaal <0.3% ja positiivne ennustav väärtus (PPV) >20% (Rinaldo et al., 2006). PPV on tõenäosus, et positiivse testi tulemuse korral on tegemist tõeliselt positiivse analüüsi tulemusega (tõeliste positiivsete tulemuste suhe valepositiivsete ja tõeliste positiivsete tulemuste summasse). Piirangutest hoolimata on MS/MS metoodika juurutamine märkimisväärne samm VS programmides, millele tihti viidatakse ka kui paradigma muutusele (Rousseau et al., 2012). Pikalt kehtinud arusaam „üks analüüt – üks analüüs – üks haigus“ asendus võimalusega testida ühel analüüsil enam kui 40 analüüti ning diagnoosida erinevaid harvaesinevaid haigusi samaaegselt. 1.2.5. Tehnoloogia arengu mõju sõeltestimise põhimõtetele Üks põhilisi Wilsoni-Jungeri kriteeriume sätestas, et skriinitav haigus peab olema ravitav. Veel 10-15 aastat tagasi vastasid kõik laborites sõeluuritavad haigused täielikult kokku lepitud tingimustele. MS/MS tehnoloogia muutis võimalikuks testida tunduvalt rohkem haigusi, mis kõik ei vasta 100% formuleeritud kriteeriumidele. Eksisteerib selge lõhe tehnoloogilise võimekuse ning ekspertide, tervishoiu komiteede ja poliitikate kujundajate soovituste vahel. See lõhe on loonud vajaduse uuendada kriteeriume lähtuvalt skriinitava haiguse ravivõimalikkusele (Rousseau et al., 2012). Aktsepteeritud ja efektiivse ravimeetodi olemasolu ei ole enam vajalik eeldus haiguse lisamiseks skriiningu paneeli, kui haigusjuhu identifitseerimine on oluline perekonna geneetilisel nõustamisel. Samuti on erinevaid tõlgendusi kriteeriumide punktide kohta, mis puudutavad tähtsa terviseprobleemi defineerimist ja piisavat haiguse loomuliku kulu mõistmist (Wilcken, 2003; Holtzman, 2003; Waisbren et al., 2003). 2012. aastal sõnastas American College of Medical Genetics (ACMG) uued miinimumkriteeriumid, mille alusel lisada vastsündinute sõeltestimise programmi testitavaid haigusi: - haigust saab identifitseerida 24-48 tunni jooksul pärast sündi ainevahetusuuringul, mitte arstliku läbivaatuse käigus; - haiguse diagnoosimiseks on spetsiifiline ja tundlik metoodika: 15 - varane diagnoosimine, meditsiiniline sekkumine ning efektiivne ravi on tõestatult kasulikud.2 Ehkki riiklikud sõeltestimise programmid toetuvad endiselt Wilsoni ja Jungeri kriteeriumitele, on skriinimise põhimõtteid tehnoloogia täiustumise valguses üle vaadatud. Seni puudub süstemaatiline tulemuste hinnang (President’s Council of Bioethics, 2008). Programmi efektiivsus, kvaliteedi kontroll ja tagamine ning tulemuste hindamine on täiendused, mida tuleb arvestada lisaks algselt püstitatud kriteeriumitele skriiningu programmi juurutamisel ja haiguste lisamisel paneeli (Andermann et al., 2008; Linder et al., 2011). 1.3. MS/MS metoodikal põhineva skriiningu protokolli varieeruvused 1.3.1. Proovide derivatiseerimine Kaasasündinud ainevahetushaiguste suhtes vastsündinute sõeltestimise pre-analüütilises etapis valmistatakse proove ette kahel eri meetodil: kasutades või mitte kasutades proovide derivatiseerimist ehk butüülestrite moodustamist, mis muudab proovide ioniseerimise efektiivsemaks. Suurem osa laboreid kasutab derivatiseerimist, sest meetod on üldiselt tundlikum (Rousseau et al., 2012). Derivatiseerimata proovide vabade hapete analüüs annab rohkem madalama ioonide arvukusega tulemusi, (sõltuvalt ühendist kuni poole võrra). Derivatiseerimisel on kõrgem ioonide arvukus, aga proovide ettevalmistamisel tuleb silmas pidada derivatiseerimise tingimusi: butüülestrite formeerumine toimub üldiselt happelises keskkonnas, mis võib aga põhjustada analüüsitavate atsüülkarnitiinide hüdrolüüsi (Chace, 2003). Tänu tundlikumatele uue põlvkonna MS/MS instrumentidele on proovide ettevalmistuse meetodid ilma derivatiseerimise etapita muutumas järjest populaarsemateks. Derivatiseerimata meetod lihtsustab proovide ettevalmistust, sest eemaldab metaboliitide butüleerimise toksilise ja söövitava reagendiga ja vähendab ettevalmistusaega. Suurema osa atsüülkarnitiinide ja aminohapete kvantitatiivsete tulemuste suhtes erinevad kaks meetodit omavahel vähem kui 15% (De Jesus et al., 2010). Suuremad erinevused tulemustes tekivad dikarboksüülatsüülkarnitiinide ühendite puhul, eriti lühikeste ahelate korral, näiteks glutarüülkarnitiin (C5DC). Loendusandmed on mitte- derivatiseeritud meetodi puhul tunduvalt väiksemad, ehkki kvantitatiivsed tulemused on 2 http://mchb.hrsa.gov/programs/newbornscreening/screeningreport.html 16 sarnased. C5DC on oluline marker I tüüpi glutaaratsiduuria identifitseerimisel ning seega on tähtis tagada antud metaboliidi määramisel meetodi piisav tundlikkus (Rousseau et al., 2012). Uuemad ja tundlikumad MS/MS instrumendid võivad kompenseerida analüütide madalamaid väärtusi. Kuid mittederivatiseeritud proovide meetod võib indutseerida isobaariliste atsüülkarnintiinide puudulikku eristamist ja suurendada FPR-i teatud haiguste diagnoosimisel. Lisaks peab modifitseerima ka vastavaid cut-off väärtusi (De Jesus et al., 2010). 1.3.2. Suktsinüülatsetooni analüüs I tüüpi türosineemia identifitseerimiseks Paljudes riikides kasutati TYR I diagnoosimiseks primaarse markerina türosiini, kuid analüüdi kõrgenenud kontsentratsioon ei ole piisavalt tundlik, et tuvastada kõik haigusjuhtumid (Wilcken et al., 2003). Kõik vastsündinu TYR juhud ei ole seotud märkimisväärselt kõrgenenud türosiini kontsentratsiooniga. Ainult türosiini analüüsil põhinevad meetodid, mille puhul proovid kogutakse teisel elupäeval, raporteerivad suurenenud hulgal valenegatiivseid tulemusi (la Marca et al., 2008). Lisaks potentsiaalsetele valenegatiivsetele tulemustele esineb ka valepositiivseid tulemusi, mida tekitab kõrgenenud mööduva neonataalse TYR levimus vastsündinute seas. Madala sünnikaaluga vastsündinutel võib türosiini tase olla kaks kuni kuus korda kõrgem kui teistel vastsündinutel (Denne et al., 1996; la Marca et al., 2008). Valenegatiivsete tulemuste peamine põhjus seisneb TYR I patsientide türosiini otsuseväärtusest madalamas tasemes, kuna türosiini tõus tekib alles siis, kui vastsündinul on juba välja kujunenud maksapuudulikkus (Frazier et al., 2006; Wilcken et al., 2003, la Marca et al., 2008). Seega on leitud, et türosiin ei ole piisavalt tundlik ega spetsiifiline marker TYR I diagnoosimiseks (Chace et al., 2003). Mitu programmi on kasutusele võtnud suktsinüülatsetooni (SucA) mõõtmise kui usaldusväärse ja valideeritud markeri TYR I diagnoosimiseks (Allard et al., 2004; Sander et al., 2006; la Marca et al., 2008; Turgeon et al., 2008). Kirjanduses on avaldatud erinevaid SucA analüüsimise meetodeid, mis põhinevad metaboliidi kvantifitseerimisel eelnevalt aminohapete ja atsüülkarnitiinide analüüsiks ekstraheeritud vereplekkidest (Allard et al., 2004; la Marca et al., 2009). Need protokollid on üldiselt robustsed ning võrdlemisi lihtsad, kuid vajavad eraldi ekstraheerimise etappi, mis kahekordistab kas proovide ettevalmistamise või MS/MS analüüsi teostamise aega (la Marca et al., 2011). 17 Turgeon ja kolleegid avaldasid meetodi SucA kombineeritud analüüsist koos aminohapete ja atsüülkarnitiindiega, mis põhines kaheastmelisel protokollil ühest vereplekist (Turgeon et al., 2008). Esimesena ekstraheeritakse metanoolis aminohapped ja atsüülkarnitiinid, seejärel ekstraheeritakse SucA atsetonitriili:vee lahuses, mis sisaldab hüdrasiini. Vereplekkide teistkordsel ekstraheerimisel võib derivatiseerimata atsüülkarnitiine ja aminohappeid sisaldav 10-20% metanooli eluendi jääk analüüsi tulemusi mõjutada (Chace et al., 2009). Meetodi parandamiseks ja optimeerimiseks lisati vereplekkide pesemise etapp ning juurutati ühekordse ekstraheerimisega meetod, milles üheaegselt ekstraheeritakse aminohapped ja atsüülkarnitiinid atsetonitriili:vee lahuses (Dhillon et al., 2011). Kolm viimasena kirjeldatud protokolli ei vaja täiendatud MS/MS instrumente, kuid nende rakendamise puhul peab töötama hüdrasiini lahusega, mis on tervist kahjustav (Metz et al., 2011). Metz ja kolleegid avaldasid 2011. aastal valideeritud meetodi aminohapete, atsüülkarnitiinide ja SucA kombineeritud määramiseks. Proovide ettevalmistamine ei vajanud teistkordset analüüsi ega hüdrasiini kasutamist, selle asemel viidi SucA ohutumasse hüdrasooni lahusesesse, mis derivatiseeriti. Antud meetodit iseloomustab tehniline täpsus rutiinsel kasutamisel ja kliinilisel hinnangul, mis võimaldab seda edukalt rakendada VS-l kaasasündinud ainevahetushaiguste suhtes (Metz et al., 2011). Antud meetod on kasutusel ka SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuses vastsündinute laiendatud skriiningu programmis. 1.4. Erinevate riikide kogemus laiendatud VS-l VS kui rutiinne kliiniline tegevus jätkab laienemist kõikjal maailmas. Mitmed riigid testivad kõiki vastsündinuid PKU ja CH suhtes. Paljudes arenenud riikides sisaldavad testimispaneelid enam kui 20 erinevat ainevahetushaigust, mõnes riigis on laiendatud VS alles sissetöötamisel (Pourfarzam ja Zadhoush, 2013). 2007. aasta jaanuariks oli mitu Euroopa riiki juurutanud või läbi viinud pilootuuringud vastsündinute laiendatud sõeltestimiseks MS/MS meetodil (Bodamer et al., 2007). Riiklike programmide algusaeg ning testitavate haiguste arv on toodud tabelis 2. Haiguste paneelid, mida MS/MS meetodil testitakse, on riigiti erinevad ning peegeldavad erisusi potentsiaalsete riskide ja kasude hinnangutes, ehkki kõik programmid väidavad end tuginevat Wilsoni ja Jungeri kriteeriumitele. Riikide vahel on vähe konsensust küsimustes, mis haigusi paneeli lisada või kuidas reageerida kaasuvatele leidudele, mis ei kuulu paneelis määratavate haiguste hulka (Pollitt, 2007). 18 Tabel 2: Euroopa, Ameerika Ühendriikide ja Austraalia laiendatud skriiningprogrammide ülevaade Riik Rahvaarv (2015) Laiendatud skriiningu algus Laborite arv Testitavate haiguste arv Viited ja kommentaarid Austria 8 224 038 2002 1 29 Pollak ja Kasper, 2013; Loeber et al., 2012 3 11 (flaami) Belgia 10 453 761 3 8 (prantsuse) Loeber et al. 2012 Eesti 1 249 312 2015 1 19 Loeber et al., 2012. Regiooniti suured erinevused, Hispaania 48 146134 2001 20 27 riiklikku statistikat keeruline esitada. Holland 16 947 904 2007 5 17 Plass et al., 2010; Loeber et al., 2012 Island 319 395 2008 1 26 Franzson, 2012 (konverentsiettekanne); Loeber et al., 2012 Norra 5 207 689 2011 1 23 Pettersen et al., 2012 Portugal 10 825 309 2004 1 25 Vilarinho et al., 2010; Loeber et al., 2012 Rootsi 9 801 616 2011 1 24 Engvall et al., 2012 Saksamaa 80 854 408 2001 11 12 Lindner et al., 2011; Loeber et al., 2012 Suurbritannia 64 088 222 2004 16 6 http://newbornbloodspot.screening.nhs.uk/imd Šveits 8 121 830 1 7 Loeber et al., 2012 http://www.novorozeneckyscreening.cz/en/for-the-public http://ldmp.upol.cz/newborns.php Tšehhi 10 644 276 6 13 Loeber et al., 2012 Taani 5 581 503 2009 1 12 Lund et al., 2012 Ungari 9897 541 2 25 Loeber et al., 2012 ACMG, 2006. Laiendatud skriiningprogrammide algusaeg 29 (primaarset) varieerub osariikide lõikes. ACMG soovitused testitavate haiguste Ameerika Ühendriigid 321 362 789 25 (sekundaarset) kohta on üleriigiliselt tunnustatud. 1998 Metcalfe, 2009; Laiendatud skriiningprogrammide algusaeg ja haiguste arv Austraalia 22 751 014 (New South Wales) 5 (vähemalt) 25 varieerub osariikide ja territooriumide lõikes. Rahvaarvu allikas: http://www.census.gov/population/international/data/idb/rank.php 19 Austraalias testitakse kõiki MS/MS meetodil määratavaid haigusseisundeid, teatavad erinevused esinevad osariikide lõikes, kuid igal pool on paneelis vähemalt 25 ainevahetushaigust. USA-s testitakse vastsündinuid enam kui 40 haigusseisundi suhtes (25 primaarset ja 29 sekundaarset haigusseisundit), Euroopa Liidu liikmesriikide paneelid ja sõeltestimise kogemus erinevad üksteistest samuti olulisel määral (Lindner et al., 2011; Dietzen et al., 2009; Plass et al., 2010; ACMG, 2006). Kõige piiratumates programmides testitakse lisaks PKU-le ainult keskmise ahelaga atsüül-CoA dehüdrogenaasi puudulikkust (MCAD puudulikkus) ning metaboliite, mis ei ole informatiivsed nende haiguste diagnoosimiseks, ei analüüsita ega raporteerita. Saksamaal alustati 1999. aastal laia programmi, kuid 2005. aastal otsustati jätkata 12 ainevahetushaiguse testimist (Pollitt, 2006; Bodamer, 2007). Saksamaa on skriiningu juurutamises huvitav näide, kuna osa algselt paneelis olnud haigusi eemaldati, sest neid hinnati kahjutuks seisundiks või biokeemiliseks kõrvalekaldeks, millel puudub või on väga väike patoloogiline tähendus (Bodamer et al., 2007). Kaasasündinud ainevahetushaiguste esinemissagedus ja testimise tulemused erinevad riigiti olenevalt etnilisest taustast. Eri regioonide ja populatsioonide pilootprojektide tulemused on väga olulised ainevahetushaiguste infoallikad (Lindner et al., 2007; Gan-Schreier et al., 2010). Madalama esinemissagedusega haiguste puhul on sõeltestimise programmide efektiivsuse hindamisel oluline riigisisene laborite koostöö (mitme keskusega riikides) ning ka rahvusvaheline koostöö (Kölker et al., 2006 ja 2007). Andmete võrdluseks on vajalikud suuremahulised rahvusvahelised andmebaasid ja erinevate regioonide programmide tulemused (Linder et al., 2011). 1.5. Rahvusvaheline koostöö USA Mayo Clinic’u hallatav andmebaas ehk Region 4 Stork (R4S) on vastsündinute skriiningu MS/MS meetodil laboratoorse kvaliteedi parandamise koostööprojekt (McHugh et al., 2011). Projekt algas 2004. aastal ning langes ajaliselt kokku ACMG ühtlustatud skriiningu paneeli tutvustamisega (Watson et al., 2006). Algselt regionaalsest projektist on kasvanud välja laiahaardeline rahvusvaheline koostöövõrgustik, mida kasutavad aktiivselt 48 USA osariiki ning enam kui 80 vastsündinute sõeltestimise programmi rohkem kui 45 riigist (McHugh et al., 2011). 20 Projekti peamiseks elemendiks on post-analüütilised vahendid, mille eesmärk on aidata interpreteerida võimalike haigusjuhtude analüütide profiili (Marquardt et al., 2012). Interpretatsiooni tööriist arvutab skoori, mis iseloomustab konkreetse haigusjuhu tõenäosust, põhinedes haigusspetsiifiliste ning informatiivsete analüütide haigusseoselistel vahemikel. Rakendust on võimalik täpsemaks muuta korrigeerides analüüdi paneelide erinevusi ning proovide ettevalmistamise tehnikat (derivatiseeritud või derivatiseerimata proovid) (Hall et al., 2014). R4S tulemused põhinevad tõestatult efektiivsetel diagnostilistel algoritmidel, on selgelt näidatud väga pika ahelaga atsüül-CoA dehüdrogenaasi puudulikkuse (VLCHAD) diagnoosimisel (Merritt et al., 2014). 2014. aasta lõpu seisuga olid Mayo Clinic’u andmebaasis 33 757 504 vastsündinu tulemused, millest 17 825 on kinnitatud ainevahetushaiguste juhud (2014. aasta jooksul lisandus 1212 uut juhtu). Eesti pilootprojekti esialgsete andmete põhjal kanti süsteemi 2014. aasta seisuga cut-off väärtused 6000 vastsündinu kohta. 1.6. Sõeltestimise efektiivsus ja eetika Formaalset tõenduspõhist analüüsi VS kliinilise efektiivsuse kohta ei ole palju teostatud. PKU ja CH puhul on kliiniline efektiivsus üldtunnustatud, ehkki kliinilisi uuringuid ei ole kunagi läbi viidud (U.S Congress, Office of Technology Assessment, 1988). Üks põhjusi, miks kliinilisi uuringuid ei ole läbi viidud, seisneb selles, et need haigused on väga harvaesinevad; uuringusse tuleks kaasata väga suur arv vastsündinuid, et uuringul oleks sõeltestimise efektiivsuse hindamiseks piisav võimsus (Wilcken et al., 2003). Teine põhjus seisneb selles, et mitme haiguse puhul on kliinilise kogemuse põhjal levinud kindel veendumus, et varasest diagnoosist on kindel kasu patsiendi ravitulemusele ning avalikud kampaaniad on üles kutsunud universaalsele sõeltestimisele (Marshall, 2002; Wilcken et al., 2003). Austraalia MS/MS skriiningu tulemustest, mis hõlmasid 362 000 vastsündinut, leiti, et kaasasündinud ainevahetushaiguste (v.a PKU) esinemissagedus on 15,7 juhtu 100 000 sünni kohta, mis erineb kuni kaks korda varasematest, sümptomitel põhinevate diagnooside andmetest 8,6-9,5 juhtu 100 000 vastsündinu kohta enne MS/MS programmi juurutamist (Wilcken et al., 2003). Haiguslugudest lähtub, et kuuendaks eluaastaks kaasnes MS/MS meetodil diagnoositud patsientidel vähem surmajuhtumeid ja kliiniliselt tõsiseid häireid (Wilcken et al., 2009). Piisava efektiivsuse saavutamine eeldab haiguse diagnoosimist ning ravi alustamist enne sümptomite avaldumist (Schulze et al., 2003). MS/MS meetodil 21 vastsündinute testimine avastab tervikuna rohkem haigusjuhtusid kui kliiniliste sümptomite alusel diagnoosimine, kuid suurem avastusmäär on seotud kindlate haigustega (eelkõige MCAD) (Wilcken et al., 2003). Lisaks identifitseerib tundlik MS/MS kõrvalekalded, mis ei pruugi kliiniliselt avalduda ning võib põhjustada asjatut meditsiinilist sekkumist. Juhtude diagnoosimine, mis ei pruugiks kunagi jõuda kliinilise tähelepanu alla, ei tohiks muutuda argumendiks laiendatud sõeltestimise programmi vastu üleüldiselt. Üksikute eranditega (lühikese ahelaga rasvhapete oksüdatsiooni puudulikkus, 3-metüülkrotonüül-CoA-karboksülaasi puudulikkus) põhjustab suur osa antud haiguste grupist siiski tõsist haigestumist ja suremust (Wilcken et al., 2003). Kliiniliselt kahjutud kõrvalekalded tuleb skriiningu paneeli optimeerimisel testimiselt kõrvale jätta. Majanduslikult on iga skriiningu programmi kulutatud euro säästnud enam kui 25 eurot raviteenuse ja sotsiaalkuludelt (Lindner et al., 2007), mis kindlasti varieerub riigiti sõltudes tervishoiu kuludest. Siiski peegeldavad uuringute tulemused väiksemat koormust tervishoiusüsteemile ja paremat prognoosi patsiendile läbi kaalutletud ning professionaalse vastsündinute sõeltestimise programmi juurutamise (Wilcken et al., 2009; Lee et al., 2011; Harms et al., 2011; Prosser et al., 2010). Skriiningu programmi efektiivseks toimimiseks on sätestatud ka kindlad ajaraamid, mis erinevad riigiti ja laboriti. Eesmärk on kõikjal tagada kiire ja täpne analüüsi vastus, mis võimaldaks ravi alustada haiguse asümptomaatilises faasis. 99,5% proove peaksid jõudma laborisse esimese 16 päeva jooksul pärast sündi, analüüs peaks olema teostatud nelja (ideaalis kahe) tööpäeva jooksul ning 100% skriiningul avastatud positiivsetest juhtumitest peaks teavitatama enne, kui imik on 18 päeva vanune. Esmane ravi peaks algama enne imiku 21. elupäeva (Rousseau et al., 2012). MS/MS tehnoloogia võimaldab ühe analüüsi käigus väikesest vereplekist skriinida enam kui 30 ainevahetushaigust. Aastas skriinitakse maailmas enam kui kolm miljonit vastsündinut ning identifitseeritakse enam kui 500 kinnitatud haigusjuhtu. MS/MS on ennast seega tõestanud kui kliiniliselt oluline sõeltestimise metoodika (Chace et al., 2002; Carpenter ja Wiley 2001 ja 2002; Zytkovicz et al., 2001). 1.7. Sõeltestimine Eestis Enne 1993. aastat puudus üle-Eestiline vastsündinute sõeltestimise programm. Vastsündinuid testiti ainult kolmes maakonnas (Tartumaa, Põlvamaa ja Jõgevamaa) CH suhtes alates 1989. aastast (Mikelsaar, 1998). 22 Alates 1993. aastast on kõiki Eesti vastsündinuid uuritud ühe päriliku ainevahetushaiguse – PKU – suhtes fluoromeetrilisel fenüülalaniini määramisel (Õunap et al., 1998) ja 1996. aastast ühe endokriinhaiguse – CH – suhtes (Mikelsaar et al., 1998). Nende andmete alusel on PKU esinemissagedus Eestis 1:6010 vastsündinu kohta (Õunap et al. 1998). Eestis on koostatud ka PKU ravijuhend, kus on ka määratletud, et esmane ravi peaks algame enne 21. elupäeva (Uudelepp et al., 2012). Viimase kümne aasta jooksul on Eestis sõeltestimisega olnud püsivalt hõlmatud üle 99% vastsündinutest (Eesti Haigekassa, 2012). Alates 01.01.2014 alustati SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuses üle- Eestilise vastsündinute laiendatud sõeltestimise pilootprojekti, mille käigus lisati skriiningu paneeli lisaks PKU-le ja CH-le veel 17 ainevahetushaigust (aminohapete, orgaanilise hapete ja rasvhapete oksüdatsiooni häired) ja omandatud vitamiin B12 puudulikkus. Laiendatud sõeltestimisel diagnoositavad haigused, nende esinemissagedus ja määratavad metaboliidid on toodud töö lisas 1. Skriinitavate haiguste paneeli lisatud haiguste valik põhineb teiste riikide programmide kogemusel (Lindner et al., 2011; ACMG, 2006; Loeber et al., 2011). Alates 01.01.2015 on üle-Eestiline vastsündinute laiendatud sõeltestimine Eesti Haigekassa tervishoiuteenuste loetelus3. 3 https://www.haigekassa.ee/et/partnerile/raviasutusele/tervishoiuteenuste-loetelu 23 2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1. Töö eesmärgid Magistritöö eksperimentaalse osa eesmärkideks on vastsündinute laiendatud skriiningu projekti raames: 1. välise kvaliteedi kontrollskeemi (ERNDIM, www.erndim.org) atsüülkarnitiinide kontrollproovide hindamine SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuses; 2. esimese 15 kuu tulemuste põhjal MS/MS tehnoloogial vereplekist määratavate metaboliitide otsusepiiride ehk protsentiilide väljaselgitamine; 3. pilootprojekti tulemuste hindamine. 2.2. Materjal ja metoodika 2.2.1. Proovid Pilootuuringu käigus kogututi kuivatatud vereplekid Eesti vastsündinutelt vahemikus 01.01.2014 kuni 31.12.2014. Täiendavalt kasutati protsentiilide väljaselgitamiseks rutiinse sõeltestimise käigus vastsündinutelt kogutud proove vahemikus 01.01.2015 – 31.03.2015. Vastsündinu kannast võetud vereproov on kogutud filterpaberile Whatman 903 (GE Healthcare Life Sciences, UK) vastsündinu 2. – 7. elupäeval (valdavalt 72-120 tunni jooksul pärast sündi), kuivatatud (4 h toatemperatuuril) meditsiiniasutustes üle Eesti ning transporditud SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskusesse. Pilootprojekti vältel skriiniti 13 632 vastsündinut. Projektis osalemast keeldusid 49 vastsündinu vanemad (kõikidest sündidest 0,36%). 2015. aastal vahemikus 01.01.2015 – 31.03.2015 skriiniti 3306 vastsündinut. Kokku sõeltestiti esimese 15 kuu jooksul 16 938 vastsündinut. 2.2.2. Tarvikud, kemikaalid ja aparatuur - Tarvikud 1. 96 auguline plaat (order no. 55010, Chromsystems) 2. 50 ml mõõtkolb 3. Automaatpipett: 8 realine (30-350 μl), 4. Automaatpipett 1-10 ml 24 5. Pipetiotsikud (350 μl, 10 ml) 6. Kaitsekile 96 auguga plaadile (order no. 55011, Chromsystems) 7. Kile aukudega 96 auguga plaadile (order no. 55013, Chromsystem) 8. 8 realine verepleki hoidja (Disk Holders plus, Labsystems Diagnostics Oy, Soome) - Kemikaalid Sõeltestimise programmis kasutatakse MassChrom Kit’i4 aminohapete ja atsüülkarnitiinide analüüsiks LC-MS/MS meetodil (Chromsystems, Gräfeling, Saksamaa), mis sisaldab järgmisi reagente: Kontrollproovid Level 1 (order no. 0192), Level 2 (order no. 0193), atsüülkarnitiinide ja aminohapete sisestandard I (order no. 55004), suktsinüülatsetooni sisestandard II (order no. 55044), ekstraheerimispuhver (order no. 55008), derivatiseerimislahus (order no. 55005), üleslahustumispuhver (order no. 55006), loputuslahus (order no. 55007), mobiilne faas (order no. 55001). - Aparatuur 1. UPLC/MS/MS (Waters, Milford, MA, USA) 2. Termoloksuti (Biosan PST -60HL-4, Läti) 3. Genevac EZ-2 kontsentraator (Genevac Ltd., UK) 4. Automaatne vereplekkide välja lööja (Woodpecker, diameeter 3 mm) 2.2.3. Proovide ettevalmistamine - Töölahuste valmistamine (sisestandard I): Sisestandardi I pudel võetakse sügavkülmast sooja toatemperatuurile ca 15 minutiks. Seejärel pudeli sisu lahustatakse 5 ml ekstraheerimispuhvris. Lahusega pudelil lastakse seista 5 minutit, loksutatakse ning seejärel kantakse lahus üle 50 ml mõõtkolbi. Pudelit pestakse kaks 2 korda 5 ml ekstraheerimispuhvriga, mis kantakse samuti 50 ml mõõtkolbi ning täidetakse kolb kuni 50 ml märgistuseni ekstraheerimispuhvriga. - Proovide ettevalmistamine: Kuivatatud vereplekkidest lüüakse välja 3 mm diameetriga kettad 96-augulisele plaadile (kasutades automaatset verepleki välja löömise masinat „Woodpecker“), vere kogus igas 4 http://chromsystems.com 25 proovis umbes 3.1 µl (±10%). Igale plaadile lüüakse proovide ette sisemiste kontrollide vereplekid Level 1 ja Level 2. Seejärel 96-augulise plaadi kõikidesse kannudesse lisatakse vereplekile 200 µl sisestandard I. 96-augulist plaati loksutatakse termoloksutil 20 minutit pööretel 600 rpm (Biosan PST-60HL- 4). Pärast loksutamist võetakse uus plaat, mille peale tõstetakse vereplekid koos hoidjaga. Esimene plaat sisestandard I jäetakse seisma. Oodatakse kuni temperatuur termoloksutil on 60 ºC. Seejärel uue plaadi kõikidesse kannudesse lisatakse 150 µl sisestandard II ning plaati loksutatakse 60ºC juures 30 minutit. Lõpuks kantakse sisestandard II ekstrakt kokku sisestandard I ekstraktiga. Plaat aurutatakse kuivaks Genevac EZ-2 vaakumkontsentraatoril 45ºC juures, kasutades programmi H20 + NH3, mille puhul „Time to finale stage“ on 25 minutit ja „Final stage time“ on 35 minutit. Kuivale plaadile lisatakse kõikidesse kannudesse derivatiseerimislahust 60 µl, plaat kaetakse kaitsekilega ning loksutatakse 60º C juures 15 minutit. Kaitsekile eemaldatakse ning plaat aurutatakse kuivaks Genevac EZ-2 vaakumkontsentraatoril 45º C juures, kasutades programmi „Medium BP“, mille puhul „Time to final stage“ on 10 minutit ja „Final stage time“ on 10 minutit. Kuivale plaadile lisatakse kõikidesse kannudesse 200 µl üleslahustamispuhvrit ning loksutatakse 1 minut pööretel 600 rpm. Saadud lahust analüüsitakse masinas. 2.2.4. UPLC-MS/MS süsteem Töös kasutati UPLC-MS/MS Waters Xevo TQD koos ACQUITY Ultra Performance vedelik- kromatograafia süsteemiga (Waters, Milford, MA, USA). Antud süsteemi eeliseks on see, et proovide analüüsil ei kasutata kromatograafilist kolonni. See võimaldab analüüse läbi viia väiksema ajakuluga. Selleks, et hoida ära masinal kapillaaride ummistamist, kasutatakse kolonni asemel PEEK filtrit. Käesoleva MassChrom kit’i puhul kasutatakse järgmisi masina seadistusi: Süsti suurus 10 µl Analüüsiaeg 1.7 min Gradient 20 – 600 µl/min 26 Meetodi täpsed parameetrid ja massiüleminekud on kättesaadavad: www.chromsystems.com. Töös kasutatakse In vitro Diagnostic (IVD) kit’i. - Gradiendi programm: Aeg 0 0.24 0.25 1.24 1.25 1.5 1.51 Eluendi 200 200 20 20 600 20 20 voolukiirus (µl/min) - Skaneerimise režiimid: Skaneerimise režiim Mõõdetavad metaboliidid Multiple reaction monitoring (MRM) Gly, Pro, Orn, SucA, Cit, Ar Precursor Ion Scan Kõik atsüülkarnitiinid (C0 – C18). Neutral Loss Scan (NL) Ala, Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Asp, Glu Elektronpihustus ionisatsiooni allikat opereeriti positiivses iooni režiimis, kapillaarpinge 4.0 kV ja koonuspinge 30 V. Rakugaasina kasutati argooni. Koonusgaasi kiirus oli 100 L/h ja desolvatatsiooni gaasi kiirus 700 L/h. Ioonallika temperatuur 150º C ja desolvatatsiooni temperatuur 350º C, ekstraktsiooni pinge 3.0 V. - MS/MS andmete analüüs Andmete analüüs teostati Neolynx 4.0 programmiga (Micromass Limited, Manchester, UK), mis kohandati MS/MS tingimustele. Kontsentratsioonide arvutused tehti sisestandardi suhtes põhimõttel: - Ühendi A signaali intensiivsus proovi massispektris ( = Asample) - Sisestandardi signaali intensiivsus proovi massispektris (= ISsample) - Sisestandardi prooviga seotud kontsentratsioon C (= Cstandard) Canalüüt, proovis kontsentratsiooni arvutus: 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 Canalüüt, proovis (µmol/l) = ∗ 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 𝐼𝑆𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 27 2.2.5. Verifitseerimine ja kvaliteedikontroll Igale 96-augulisele plaadile kantakse analüüsiks sisemise kontrolli proovid Level 1 ja Level 2, et hinnata analüüsi täpsust. Verifitseerimise käigus määrati eespool kirjeldatud meetodile järgmised karakteristikud: saagis ja mõõtemääramatus. Saadud tulemusi võrreldi Chromsystems’i tulemustega. Valideeriti metaboliidid, mis ei ole Chromsystems’i metoodikas valideeritud: C3DC; C4OH; C4DC; C5:1; C5OH;C8:1, C10:1; C14:1; C14:2 C14:OH; C16:1; C16:OH; C16:1OH;C18:1; C18:1OH; C18:2OH; C18OH. Analüüsi kvaliteedi tagamiseks hinnati sisestandardi intensiivsust. Analüüsiti sisemise kontrolli proovide (Level 1 ja Level 2) tulemuste jäävust lubatud vahemikku ning tulemused kanti X-kaardil (± 2 stdv). Kontrollmetaboliitidena kasutati C8; Gly ja Phe (iga analüüti analüüsitakse erinevas MS/MS skaneerimise režiimis). Analüüsi korratakse, kui eelnevad tingimused ei ole täidetud. 2.2.6. Võrdluskatsete läbiviimine ja interpretatsioon Võrdluskatsed viidi läbi ERNDIM (European Research Network for Evaluation and Improvement of Screening, Diagnoosis and Treatment of Inherited Disorders of Metabolism) Qualitive Blood Spot Acylcarnitine Scheme raames (Quality Assurance in Laboratory Testing for IEM), mis väliste kontrollproovide kasutamisega hindab objektiivselt labori võimekust ja täpsust identifitseerida kaasasündinud ainevahetushaigusi atsüülkarnitiinide profiili analüüsimisel vereplekkidest. Proovid valmistati ette ja analüüsiti metoodikas välja toodud kirjelduse alusel. Vereplekkide iseloomustus: 22b – 55 aastane naine, mõõdukas lihasnõrkus ja episoodiline valu. 22c – 43 aastane naine, lapsepõlves ketoatsidoos ja heptatomegaalia, hetkel terve. 23a – 20 aastane naine, lapsepõlves kogetud hüpoglükeemilise entsefalopaatia episood, hetkel terve. 23b – 20 aastane mees, anamneesis hüperammoneemia koos maksa düsfunktsiooniga, hetkel terve. 23c – 25 aastane naine, lapsepõlves kogetud hüpoglükeemia ja kardiomüopaatia episood, hetkel terve. 28 Proovide MS/MS tulemusi analüüsiti vastavalt üksikute metaboliitide ning erinevate metaboliitide suhete kontsentratsioonidele. Esialgse tulemuse kinnitamiseks sisestati andmed Mayo Clinic’u andmebaasi, mis võrdles katsetulemusi kõikide sisestatud andmetega ning arvutas metaboliitide väärtuse alusel patsienti iseloomustava skoori, mis kinnitas või lükkas ümber kahtluse kaasasündinud ainevahetushaiguse esinemiseks kontrollproovis. R4S rakendus on välja töötatud arvulistel tulemustel põhinevate laboriandmete analüüsimiseks. Kontrollproovide 22b ja 22c interpretatsiooni võrreldi ametliku tagasiside raporti tulemustega 2014. aastal. Kontrollproovide 23a; 23b; 23c ametlik tagasiside laborile ei ole veel avalikustatud. 2.2.7. Protsentiilide arvutamine Vastsündinute kaasasündinud ainevahetushaiguste skriiningprogrammi 15 esimese kuu andmete põhjal arvutati metaboliitide 1-protsentiil ja 99-protsentiil, et määrata haigusseisunditele iseloomulikud kõrvalekalded võrreldes tervete vastsündinute vastavate metaboliitide tasemega. Andmetöötluseks kasutati programme Excel (Microsoft Corp., Redmond, OR, USA) ja SAS 9.2. (SAS Institute Inc., NC, USA). Arvutuste tegemisel võeti valimist välja kordusanalüüsile suunatud proovid (korratud tulemus jäeti sisse) ning haigusliku kõrvalekaldega proovid. Esimese 6 kuu protsentiilid arvutas välja SA Tartu Ülikooli Kliinikumi statistik Pille Kool. 2.2.8. Eetika Vastsündinute laiendatud sõeluurimise pilootprojekti läbiviimiseks andis loa Tartu Ülikooli eetikakomitee (taotlus nr 231/T-5; koosolek 18.11.2013). 29 2.3. Tulemused 2.3.1. Metoodika verifitseerimine Laborisisese metoodika kvaliteedi kontrolliks hinnati sisemise kontrolli proovide Level 1 ja Level 2 tulemuste põhjal metaboliitide saagise ning mõõtemääramatuse vahemikud ning võrreldi neid Chromsystems’i poolt kinnitatud tulemustega (arvutuste tulemused on toodud töö lisas 2). Aminohapete puhul oli saagis 74-111% ning atsüülkarnitiinide puhul 70-109%. Mõõtemääramatus aminohapete analüüsil oli 5,22-13% ning Chromsystems’i poolt valideeritud atsüülkarnitiinide puhul 5,2-19,6%. Mõõtemääramatuse erinevus metoodikas lubatud väärtuse ning kontrollproovide tulemustes oli aminohapete puhul kuni 7,07% (kontrollproovide kahjuks) ning atsüülkarnitiinide puhul osutus kõikide analüüsitud metaboliitide puhul mõõtemääramatuse väärtus madalamaks meetodis lubatud väärtusest. Meetodis valideerimata atsüülkarnitiinide saagis arvutati lähtuvalt sisemise kontrolli proovide metaboliitide keskmisest kontsentratsioonist, mis võrdsustati 100%-ga; mõõtemääramatuse vahemik 22,6-65,59% (C18:1OH puhul 103,73% ja 70,66%, Level 1 ja 2, vastavalt). 20 juhuslikult valitud analüüsi Level 1 ja Level 2 kontrollmetaboliitide C8; Gly ja Phe X- kaardid, mis iseloomustavad vastava metaboliidi väärtuse kõikumist keskmise väärtuse ning lubatud ±2 standardhälbe vahemikus on toodud töö lisas 3. 2.3.2. Võrdluskatsete interpretatsioon Välised võrdluskatsed teostati ERNDIM kvaliteediprogrammi raames. Välised proovid analüüsiti vastavalt sõeltestimise protokollile ning tulemusi interpreteeriti lähtuvalt laborisisestest cut-off väärtustest. Esmalt teostati üksikute metaboliitide ning metaboliitide suhete kontsentratsioonidel põhinev analüüs, mis arvestab metaboliitide tasemete muutusi, mis on välja toodud töö lisas 1. Analüüsi tulemus loob kahtluse kindla sõeltestitava ainevahetushaiguse esinemiseks, misjärel analüüsi tulemused sisestatakse Mayo Clinic’u projekti R4S andmebaasi. Sisestusi võrreldakse kõikide andmebaasi sisestatud tulemustega ning rakendus annab igale konkreetsele juhule skoori, mis iseloomustab kahtlustatava ainevahetushaiguse esinemise tõenäosust. Interpretatsiooni tulemusi on võrreldud võrdluskatsete tulemuste raportiga. 2014. aasta kontrollkatsete tulemusi ei ole veel avalikustatud. - Analüüsi ID: 22b 30 Atsüülkarnitiinide profiili iseloomustab kõrgenenud C8 väärtus 0,34 µmol/L (referentsvahemik 0-0,18 µmol/L). Diagnostiliselt olulised metaboliitide suhted on samuti kõrgenenud: C8/C10= 4.25 (norm <2.5), C8/C0 = 0.021 (norm <0.01) ja C8/C2=0.09. Esmane metaboliitide analüüs viitab võimalikule MCAD puudulikkuse esinemisele patsiendil. R4S andmebaasi MCAD kahtlusega kontrolliproovi metaboliitide kontsentratsioonide sisestamisel saadi haigusskoor väärtusega 30 (skoor >20 ja <70), mis iseloomustab võimalikku MCAD puudulikkuse esinemist ning kinnitab esialgset interpretatsiooni. Kontrollproovi 22b metaboliitide ja suhtarvude võrdlus normivahemike ning haigusseoseliste kõrvalekalletega on toodud joonisel 6. Joonis 6. Referentsvahemikus protsentiilide ja MCAD puudulikkuse haigusseoseliste kontsentratsioonide vahemiku kattuvuse graafik. Analüüsi tulemusi iseloomustab C8 väärtuse tõus, mis ületab normaalset protsentiilide vahemikku, kuid jääb madalamaks kui konkreetselt haigusseoselised väärtused. Haigusseoselistele kõrvalekalletele viitavad C8/C2 ja C8/C10 kontsentratsioonide suhtarvud. ERNDIM tagasiside raportis välja toodud tulemused osalevate laborite lõikes: C8 mediaan 0,5 µmol/L (vahemik 0,32–1,20 µmol/L); C8/C10= 4,1 (vahemik 3,0– 6,7); C8/C2= 0,07 (vahemik 0,04-3,0); vaba karnitiin C0 mediaan 15,5 µmol/L (vahemik 11,3-22,0 µmol/L). - Analüüsi ID: 22c Analüüsi atsüülkarnitiinide profiili iseloomustab kõrgenenud C0 väärtus, 78,7 µmol/L (referentsvahemik 7,18-51,2 µmol/L) ning langenud C16 väärtus, 0,56 µmol/L (referentsvahemik 0,80-5,78 µmol/L). Esmase hinnanguna võib tegemist olla karnitiin- palmitoüültransferaas I puudulikkusega (CPT I), kuid olulised C18 ja C18:1 kontsentratsioonid on normi piirides, vastavalt 0,47 µmol/L ja 0,72 µmol/L (CPT I puhul peaks antud metaboliitide väärtus langema). Diagnostiliselt olulise suhtarvu C0/(C16+C18) väärtus on 31 märgatavalt tõusnud, olles 76,4 µmol/L (norm <30), seega hinnatakse analüüsi kahtluseks CPT I võimalik esinemine. R4S rakendusse sisestatud väärtuste alusel konstrueeritud graafik on toodud joonisel 7. Joonis 7. Referentsvahemikus protsentiilide ja CPT I haigusvahemiku kattuvuse graafik. C18:2 ning C16 väärtus viitavad haiguslikule kõrvalekaldele, samuti C0/(C16+C18) ja C3/C16 suhtarvud. Ülejäänud CPT I diagnoosimise jaoks olulised metaboliidid jäävad normivahemikesse. R4S rakendus arvutas analüüsi üldskooriks 43, mis tähendab, et võimalik on CPT I esinemine. Kinnitatud haigusjuhtudega võrreldes kuulub analüüsi tulemus 5-protsentiili hulka. Võrdluskatsete tagasiside raportis toodi välja kõrgenenud tasemega vaba karnitiini, mediaan 85,7 µmol/L (vahemik 42,0-155,0 µmol/L), ning kogenenud suhtarvu C0/(C16+C18), mediaan 56,9 µmol/L (vahemik 4,6-70,9 µmol/L). Lisaks raporteeriti C3 kontsentratsiooni tõusu, mediaan 5,0 µmol/L (vahemik 3,6-7,1 µmol/L). Kõige tõenäolisem diagnoos kontrollproovile oleks raporti tagasiside alusel olnud metüülmalonaatatsiduuria (MMA) või propionaatatsiduuria (PPA), mida iseloomustab kõrgenenud C3 väärtus. Kontrollkatses oli C3 väärtus 2,73 µmol/L (referents 0-4,69 µmol/L) ning seega metaboliidi kontsentratsiooni tõusu analüüsis ei tuvastatud. 2013. aastal geneetikakeskuses teostatud sama kontrollproovi analüüsi tulemustes iseloomustas atsüülkarnitiinide profiili samuti C0 väärtuse tõus, 75,1 µmol/L (referentsvahemik 22,4-57,9 µmol/L) ning C16 väärtuse langus, 0,64 µmol/L (referentsvahemik 2,28-5,24 µmol/L). C3 kontsentratsioon oli 4.89 µmol/L (referentsvahemik 2.81-6.91 µmol/L), seega metaboliidi tõusu ei raporteeritud. 32 - Analüüsi ID: 23a Atsüülkarnitiinide profiili iseloomustab kõrgenenud C8 väärtus 0,57 µmol/L (referentsvahemik 0-0,18 µmol/L), lisaks kõrgenenud metaboliitide suhtarvud C8/C10=11,4 (norm <2.5) ja C8/C0=0,088 (norm <0.01). Vaba karnitiini väärtus on langenud, C0=6,51 µmol/L (referentsvahemik 7,18-51,2 µmol/L), samuti on langenud C2 väärtus, C2=2,63 µmol/L (referentsvahemik 8,15-49,0 µmol/L). Esmane tulemus viitab MCAD puudulikkuse kahtlusele. Joonis 8. Rederentsvahemikus protsentiilide ja MCAD puudulikkuse haigusseoseliste kontsentratsioonide vahemike graafik. Analüüsi tulemusi iseloomustavad selged võtmemetaboliidi C8 ja oluliste suhtarvude C8/C10 ning C8/C2 tõusud, mis paikenvad haigusseoselistes vahemikes või on neile lähedaste väärtustega. Lisaks esmasel interpretatsioonil uuritavate metaboliitidele, on analüüsitulemustes haiguse hindamisel informatiivsed ka C4/C8 ja C5OH/C8 suhtarvud. R4S andmebaasi analüüsi tulemused on toodud joonisel 8. Haigusseisundi skoor on 119, mis tähendab, et tegemist on usutavalt MCAD puudulikkusega (vahemik >70 ja <180). Kõikidest andmebaasi sisestatud ja kinnitatud juhtude skooridest paikneb antud analüüs 17-protsentiili seas. - Analüüsi ID: 23b Atsüülkarnitiinide profiili iseloomustab märkimisväärselt kõrgenenud C3 väärtus 40,7 µmol/L (referentsvahemik 0-4,69 µmol/L). Lisaks on kõrgenenud suhtarvud C3/C2= 3,28 (norm <0,2 Mayo Clinic’u andmetel) ja C3/C16=116,28 (norm <2,0 Mayo Clinic’u andmetel). Kõrvalekalded viitavad nii MMA, PPA kui vitamiin B12 puudulikkuse võimalikule esinemisele. Seega sisestati tulemused R4S andmebaasi haigusskooride arvutamiseks kõikide kahtlustavate haiguste suhtes, tulemused on toodud joonisel 9. 33 Joonis 9. A) illustreerib MMA referentsvahemikke ja haigusspetsiifilisi metaboliitide kontsentratsioone; B) PPA referentsvahemikke ja haigusspetsiifilisi metaboliitide kontsentratsioone; C) vitamiin B12 puudulikkuse referentsvahemikke ja haigusspetsiifilisi metaboliitide kontsentratsioone. Kõikide kahtlustavate haigusseisundite puhul on märgata C3 taseme ning C3/C2 ja C3/Met suhtarvude kõrgenemist, mis on iseloomulik patoloogilisele seisundile, ehkki C2 ja Met väärtus eraldiseisvana on normvahemikus. Konkreetse ainevahetushaiguse kindlaks tegemiseks kasutati haigusspetsiifilistest metaboliitidest tuletatud summaarset skoori, mis MMA puhul oli väärtusega 0, vitamiin B12 puudulikkuse puhul väärtusega 0 ja PPA puhul väärtusega 472 ( >165 väärtus kirjeldab väga suure tõenäosusega PPA diagnoosi), antud tulemus on andmebaasi siestatud kinnitatud PPA tulemuste seas 99-protsentiili seas. Seega lähtuvalt kontrollproovi metaboliitide kontsentratsioonidest raporteeriti kontrollproovi tulemuseks PPA esinemine. 34 - Analüüsi ID: 23c Atsüülkarnitiinide profiili iseloomustavad metaboliitide C14:1 ja C14:2 tõusud, vastavalt 0,69 µmol/L (referentsvahemik 0-0,33 µmol/L) ja 0,12 µmol/L (referentsvahemik 0-0,07 µmol/L). Langenud on C0 ja C2 kontsentratsioonid, vastavalt 6,41 µmol/L (referentsvahemik 7,18-51,2 µmol/L) ja 3,05 µmol/L (referentsvahemik 8,15-49,0 µmol/L). Märkimisväärselt on seega kõrgenenud suhted C14:1/C0=0,11 ja C14:1/C2=0,23. Esmane metaboliitide analüüs viitab VLCAD puudulikkuse kahtlusele. Joonis 10. Referentsvahemiku ja VLCAD puudulikkuse haigusspetsiifiliste protsentiilide vahemike graafik koos analüüsi tulemustega. Analüüsitud proovi iseloomustavad selged haigusele iseloomulikud C14:1; C14:2 ja suhtarvu C14:1/C2 väärtused. C12:1 väärtust antud skriiningu programmis ei määrata, vastava metaboliidi väärtust hinnatakse võtmemetaboliit C14:1 väärtuse alusel. Kontrollproovi tulemus R4S rakenduses on toodud joonisel 10. Kuna C12 väärtust VS paneelis ei määrata, siis kasutatakse antud metaboliidi kontsentratsiooni hindamiseks C14:1 väärtust. Üldskooriks arvutati 187 (tulemus >110), mis viitab, et tegemist on suure tõenäosusega VLCAD-iga. Tulemuse alusel paikneb kontrollproov andmebaasis kinnitatud VLCAD puudulikkuse tulemuste seas 44-protsentiili seas. 2.3.3. Metaboliitide otsusepiiride määramine Vastsündinute laiendatud sõeltestimise programmi 15 kuu jooksul testitud vastsündinute proovide põhjal arvutatud metaboliitide otsusepiirid 1. ja 99. protsentiili alusel on kokkuvõtvalt toodud tabelis 3. 35 Tabel 3. Analüüsitavate metaboliitide protsentiilid. 36 2.3.4. Pilootprojekti koondtulemused Vastsündinute laiendatud sõeltestimise pilootprojekti käigus testiti vahemikus 01.01.2014 – 31.12.2014 kokku 13 632 vastsündinut. Analüüsist leitud kõrvalekalde tõttu kutsuti välja 33 vastsündinut. Projektis osalemast keeldusid 49 vastsündinu vanemad (kõikidest sündidest 0.36%) ning seega kaeti laiendatud sõeltestimisega pilootuuringu jooksul 99.64% Eesti vastsündinutest. 01.01.14 – 30.06.14 kutsuti välja 22 last (kokku sõeltestitud 6339), 01.07.14. – 31.12.14 kutsuti välja 11 last (kokku sõeltestitud 7293). Pilootprojekti raames esines 25 valepositiivset tulemust, mis tähendab osakaalu 0.18% esimese 12 kuu lõikes, kusjuures projekti esimese 6 kuu tulemustes oli FPR 0.28% ning teise 6 kuu tulemustes langes see 0.09%-ni. PPV oli esimese 6 kuu lõikes 18%; teisel poolaastal 36% ning esimese aasta lõikes tervikuna 24%. 2015. aasta esimese kolme kuuga (01.01.15-31.03.15) skriiniti 3306 vastsündinut, täiendavale kontrollile kutsuti 3 last, neist kinnitati diagnoos 1 vastsündinul. FPR oli kolme kuu lõikes 0.06% ja PPV 33%. Esimese 15 kuu jooksul skriiniti kokku 16 938 last, kinnitatud diagnoosi sai 9 last (1:1882 vastsündinu kohta). Programmi FPR tervikuna oli 0.16%, PPV 25%, teadaolevalt valenegatiivseid tulemusi hetkeseisuga ei ole. Projekti koondtulemused on toodud tabelis 4. Tabel 4. Skriiningu koondtulemused. 01.01.- 01.07- Pilootprojekt 01.01- 15 kuud 30.06.14 31.12.14 2014 31.03.15 koondtulemused Sõeltestitud kokku 6339 7293 13632 3306 16938 Tagasi kutsutud 22 11 33 3 36 Valepositiivsed 18 7 25 2 27 Tõelised positiivsed 4 4 8 1 9 Tõelised negatiivsed 6335 7289 13624 3305 16929 Valepositiivsete osakaal (FPR) 0.28% 0.10% 0.18% 0.06% 0.16% Positiivne ennustav väärtus (PPV) 18% 36% 24% 33% 25% 37 2.4. Arutelu Vastsündinute laiendatud sõeltestimisel MS/MS meetodil saab identifitseerida enam kui 30 ainevahetushaigust üheainsa analüüsi käigus ning tuvastada patsiente enne sümptomite avaldumist või haiguse varases faasis. See võimaldab parandada haiguse kaugprognoosi ning tagada patsiendile eakohane areng. Tänu metoodika tundlikkusele, suurele läbilaskevõimele ning efektiivsusele on laiendatud VS programmid juba rakendatud paljudes Euroopa Liidu riikides, USA-s, Austraalias ning mujal. Testitavate haiguste paneel erineb riigiti, arvestades haiguse esinemissagedust, aga ka tervishoiuökonoomika parameetreid ning prognoose. 2014. aastal alustati SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuses Eesti vastsündinute laiendatud skriiningu pilootprojektiga, mille jooksul skriiniti 13 632 vastsündinut. Lisaks hinnati laborisiseste parameetrite ning väliste kontrollproovide abil meetodi töökindlust, määrati Eesti populatsioonile iseloomulikud metaboliitide referentsvahemikud, kasutades 1. ja 99. protsentiili ning haiguslikule kõrvalekaldele viitavad otsusepiirid (cut-off väärtused). 2015. aastal alustati Eestis riiklikku vastsündinute laiendatud skriiningprogrammi. 15 esimese kuu jooksul skriiniti 16 938 vastsündinut, kellest on kinnitatud kaasasündinud ainevahetushaiguse diagnoosi saanud 9 patsienti (1:1882 vastsündinu kohta). Kliinilises kasutuses laboratoorsete analüüside kvaliteedi kontroll jaguneb kaheks. Esiteks sisemine kvaliteedi kontroll, millega labor iseseisvalt rakendab tööprotsessis meetodeid, et hinnata juurutatud analüüsi töökindlust ning täpsust Ja teiseks, väliste kvaliteedi kontrolli meetodite rakendamine ja koostööprogrammides osalemine, mille eesmärk on objektiivne analüüside tulemuste võrdlus teiste laboritega. Laborisisesel kvaliteedi tagamisel jälgiti kontrollproovide Level 1 ja Level 2 metaboliitide kontsentratsioone ning võrreldi neid meetodis lubatud saagise ja mõõtemääramatuse vahemike väärtustega. Meetodis lubatud saagise vahemik oli aminohapete puhul 51-94% ja atsüülkarnitiinde puhul 62-89%. Analüüsitud kontrollproovide puhul oli tegelik saagis laboris aminohapete puhul 74-111% ja meetodis valideeritud atsüülkarnitiinide puhul 70-109%. Seega on labori tulemused keskmiselt suurema saagisega kui meetodi tingimustes. Mõõtemääramatuse puhul hindasime piisavalt täpseks analüüsi tulemusi, mille korral erinevus kontrollproovide ja meetodis lubatud väärtuste vahel oli kuni 10% metoodikas kinnitatud väärtuse kasuks. Need tulemused õnnestus ka saavutada. Suurema osa metaboliitide puhul 38 õnnestus meil tagada väiksem mõõtemääramatuse väärtus, kui Chromsystems’i metoodikas välja toodud, välja arvatud aminohapete SucA; Arg; Ala; Met ja Orn puhul, kus meie labori keskmine standardhälve osutus suuremaks. Atsüülkarnitiinide puhul jäi laboripoolne mõõtemääramatus protsentuaalselt väiksemaks kui Chromsystems’i metoodikas kõikide metaboliitide puhul. Mõõtemääramatus oli kõrgem meetodis valideerimata atsüülkarnitiinide puhul, tulemust selgitab antud metaboliitide väike kontsentratsioon, mis tähendab juba väikese kõrvalekalde puhul protsentuaalselt suurt standardhälvet. Kontrollproovide metaboliitide C8; Gly; Phe väärtuste kandmine X-kaardile viitab, et sisemise kontrolli proovide väärtus jääb lubatud vahemikku. Seega võib analüüside tulemused tõlgendada üldiselt usaldusväärseteks, üksikud suuremad kõrvalekalded võivad olla põhjustatud analüüsi tehnilisest läbiviimisest.. Väliste kvaliteedi hindamise programmide (nt ERNDIM) juurutamine aidanud kaasa biokeemilise testimise tulemuslikkuse parandamisele. Eelkõige on eesmärgiks analüüside täpsuse, tõesuse, korratavuse kinnitamine ja laboratoorsete analüüside harmoniseerimine. Lisaks on olulised meetodite valiidsus ja võrreldavus, mis puudutatavad laiendatud VS-t MS/MS meetodil, cut-off väärtuste kliinilisel valideerimisel ning mitme keskuse uuringutulemuste võrdlust (Fowler et al., 2008). ERNDIM programmis hinnati kokku kuut kontrollproovi ning võrreldi tulemuste tagasiside raportiga 2014. aastal. Raportis kajastatud kolmel proovil (selles töös on kasutatud kahe proovi tulemusi, sest ühe proovi haiguslik kõrvalekalle skriiningu paneelis ei esine) tuvastati diagnostilised kõrvalekalded. Tulemust interpreteeriti esialgselt metaboliitide arvulise väärtuse alusel võrreldes labori referentsväärtustega ning seejärel genereeriti ka kahtlust kinnitav või ümberlükkav vastus Mayo Clinic’u interpretatsiooni tööriista abil. Analüüsi 22b laboritulemustes selgunud kahtlust MCAD puudulikkusele kinnitas ka R4S rakendus ja ERNDIM tagasiside raport (vereplekk kuulus diagnoositud MCAD puudulikkusega patsiendile). Analüüsi 22c puhul jäi meie tulemustes tähelepanuta C3 kontsentratsiooni tõus, sest väärtus jäi referentsväärtuse alusel normivahemikku, C3 väärtus 2,73 µmol/L (referentsvahemik 0-4,69 µmol/L). Seega diagnoositi ekslikult võimalik CPT I esinemine PPA asemel kontrollproovis. Võib arvata, et C3 väärtuse tõus jäi tuvastamata proovi ettevalmistamisel tehtud vea tõttu. 2013. aastal sama proovi analüüsil raporteeriti samuti võimalik CPT I esinemine. C3 väärtus antud analüüsis oli 4,89 µmol/L (referentsvahemik 2.81- 6.91 µmol/L), mille alusel metaboliidi tõusu ei tuvastatud. Antud analüüsil põhines metaboliitide referentsvahemik Chromsystems’i soovitustel, mitte labori tulemustel. Kui seda 39 tulemust hinnata kuue kuu Eesti vastsündinute andmetel põhinevate protsentiilide alusel, siis on C3 referentsvahemik 0.34-4.63 µmol/L. Kasutades laboris määratud referentsväärtust, on C3 metaboliidi kontsentratsiooni tõus tuvastatav. Arvestades ka 15 kuu protsentiilide arvutusi, selgub, et C3 99-protsentiili väärtus langeb veelgi, olles 4.31 µmol/L, ning iseloomustab metaboliidi kontsentratsiooni selgemat tõusu kontrollproovis. See näitab, et pikemat perioodi arvestavad cut-off väärtused on laiema põhjaga, arvestades ka faktoreid nagu ema toidulaud erinevatel aastaaegadel (oluline lapse ainevahetuse mõjutaja, mis põhjustab ka metaboliitide sisalduse varieeruvust vastsündinu veres) ja sekundaarsed terviserikked. Tänu sellele on cut- off väärtused objektiivsemad (Chapman et al., 2008; Pitt, 2010). Lisaks tulevad selgemalt esile ka tehnoloogia eripärad (sisestandardite puudumine teatud metaboliitidel). Skriiningu spetsiifilisust võib parandada mitmeti. Cut-off väärtuste väljatöötamine ja modifitseerimine on laborites levinud meetod (Lott et al., 2004; Lindner et al., 2006). Laiendatud VS pilootprojekti eesmärgiks oli ka Eesti populatsiooni põhjal ainevahetushaiguste indikaatormetaboliitide diagnostiliste väärtuste määramine. Sobivad metaboliitide kontsentratsioonide ning nende suhtarvude cut-off väärtused töötavad sõeltestimist teostavad laborid välja iseseisvalt. Metoodika sissetöötamisel on vaja vähemalt 2500-4000 proovi tulemusi, et määrata metaboliitide tasemed, millest alates loetakse analüüsi tulemused positiivseks. Cut-off väärtusi võrreldakse ka teiste keskustega. Neid on mõistlik aja jooksul modifitseerida, kui analüüsitud on rohkem vastsündinuid ning laboril on enam kogemusi positiivsete tulemuste identifitseerimisega (Rousseau et al., 2012). Diagnostiliselt olulisi otsusepiire arvutasime etapiviisiliselt. Algselt kasutasime Chromsystem’si meetodiga seotud väärtuseid (nende põhjal analüüsiti ka esimesed ERNDIM kontrollproovid), esimesed geneetikakeskuse cut-off väärtused arvutasime 1000 vastsündinu pealt, järgmised tulemused pilootprojektis osalenud ligi 6000 vastsündinu pealt ning aprillis 2015, pärast pilootprojekti lõppemist, enam kui 16 000 vastsündinu tulemusi arvesse võttes. Metaboliitide diagnostiliselt informatiivsete protsentiilide määramisel võtsime Eesti andmete koondtulemuste arvutustest välja oluliste metaboliitide kõrvalekalletega proovid, mis suunasime kordustestimisse, et välistada üldpopulatsiooni referentsvahemike määramisel patoloogilise kõrvalekaldega proovid. Samas jätsime sisse sekundaarsed kõrvalekalded, mis võivad potentsiaalselt viidata patoloogiale, kuid hetkel testimispaneeli ei kuulu. Eesmärk on diagnostiliselt informatiivset otsusepiiri mitte langetada liiga madalale, mis tooks kaasa suuremal arvul tagasikutsutud patsiente, FPR tõusu ning suurenenud koormuse sõeltestimise 40 programmile tervikuna. Vajadusel on tulemustest teavitatud vastsündinute vanemaid, erandjuhul raviarste ning kutsutud vastuvõtule või soovitatud teostada sekundaarsed uuringud. 15 kuu põhiste cut-off väärtuste võrdluses kuue kuu andmetega on kõige silmatorkavam erinevus Chromsystems’i poolt valideerimata ühendite puhul. 99-protsentiilide tõusud: C16:1; C16:1OH; C16OH. Kõige enam on tõusnud C18:1OH ja C18:2OH vastavad väärtused. Kuue kuu tulemustes olid need mõlemad 0,09 µmol/L. 15 kuu arvutustes on väärtused vastavalt 0,17 µmol/L ja 0,15 µmol/L. Valideerimata metaboliitide tulemused muutuvad selgelt aja jooksul. Arvatavasti on piirväärtuste tõus tingitud MS/MS masina ioonoptiliste parameetrite muutusest. Seega on aja möödudes vajalik üle vaadata valideerimata metaboliitide cut-off väärtused ja uuesti optimeerida parameetrid hüdroksürühma sisaldavatele atsüülkarnitiinidele (C3DC; C4OH; C4DC; C5:1; C5OH;C8:1, C10:1; C14:2; C14:1; C14:OH; C16:1; C16:OH; C16:1OH;C18:1; C18:1OH; C18:2OH; C18OH). Laiendatud sõeltestimise laboratoorse efektiivsuse hindamiseks on olulised parameetrid analüüsi FPR ning PPV. Teatav valepositiivsete tulemuste hulk on laiendatud VS programmides paratamatu. Fenomeni põhjustab suur arv haruldasi haigusi, mis on skriiningu paneelidesse lisatud (Rousseau et al., 2012). Ehkki erinevate riikide programmide tulemused varieeruvad, on seatud tunnustatud analüütilised ja post-analüütilised eesmärgid: FPR <0,3% ja PPV >20% (Rinaldo et al., 2006). Erinevad riigid on avaldanud koondtulemusi, kus FPR on 0,02-0,38% (Wiley et al., 1999; Wilcken et al., 2003 ja 2009; Schulze et al., 2003; Zytkovicz et al., 2001; Frazier et al., 2006; Vilarinho et al., 2010). Eestis läbi viidud pilootprojekti puhul oli FPR 0,18%. FPR varieerus periooditi: esimese kuue kuu lõikes oli FPR 0,28% ning teisel poolaastal 0,1%. 2015. aasta esimese kolme kuuga langes FPR 0,06%-ni. FPR vähenemine kogemuse kasvades iseloomustab ka teiste riikide praktikat. Taanis 2002-2011 läbiviidud pilootuuringu ja riikliku programmi tulemustest lähtub, et skriiningu esimesel aastal saavutati FPR 0.06% ja seda suudeti langetada 0,03%-ni viimase aasta jooksul (kogu programmi lõikes FPR 0,038%) (Lund et al., 2012). Novembrist 2010 kuni juunini 2012 pilootprojekti läbi viinud Rootsi andmetest lähtub, et kui tervikuna perioodi FPR oli 0.067% ja PPV 45%, siis projekti viimase kuue kuu jooksul langes FPR 0.047%-ni ja PPV tõusis 49%-ni (Engvall et al., 2012). Seega on ootuspärane tulemus, et cut-off väärtuste korrigeerimine projekti vältel aitab protsessi muuta efektiivsemaks ning täpsemaks. Tulemustes näeme trendi FPR vähenemiseks ja PPV tõusuks. FPR väärtus ja PPV iseloomustavad nii skriiningu programmi tervikuna kui ka selles sisalduvaid haigusi 41 eraldiseisvalt. Nii on erinevate haiguste vastavad väärtused erinevad (Wilcken et al., 2003). Geneetikakeskuse pilootprojekti koondtulemustes me ei ole eraldi välja toodud leitud haiguste vastavaid väärtusi ega hinnanud esinemissagedust Eesti vastsündinute seas – seda põhjusel, et 16 000 vastsündinu pealt ei ole võimalik leida avastatud kõrvalekallete täpset esinemissagedust ja programmi efektiivsuse parameetreid usaldusväärselt. Madalama esinemissagedusega haiguste puhul on kompetentsi tagamiseks oluline riiklik (juhul, kui skriiningut viivad läbi mitmed laborid) ja rahvusvaheline koostöö (Kölker et al., 2006 ja 2007). Interpretatsiooni tööriist koostööprojekti R4S raames võimaldab suurendada PPV-d ning langetada FPR-i, säilitades samal ajal piisavalt kõrge tundlikkuse (Marguardt, et al., 2012), sest ainevahetushaiguse kahtlusega tulemusi saab võrrelda enam kui 33 miljoni sisestusega laboritest üle maailma. Üldpopulatsiooni normivahemike põhjal cut-off väärtusi määrates tõstatub probleem, et suurem osa sõeltestimise programme ei puutu praktikas kokku 30-80% haigustega, mis on nende skriiningu paneelis (McHugh et al., 2011). Eriti oluline on see faktor väiksemates programmides, kus testitakse vähem vastsündinuid. Arvestades Eesti aastast vastsündinute arvu (ca 13 000), on selge, et võimekus kinnitada väga madala esinemissagedusega haiguste puhul populatsioonipõhiseid normivahemikke ei ole niivõrd lühikese aja jooksul piisav. Samuti on keeruline tagada äärmiselt harvaesinevate haigusjuhtude piisavalt efektiivne identifitseerimine. Töö tulemuste põhjal saab teha kolm peamist järeldust: 1. Väliste kvaliteedi hindamise ERNDIM programmi tulemustes on SA TÜK ühendlabori geneetikakeskuses esinenud 2014.a. üks mittevastavus. Välise kvaliteedi kontrolli tulemuste kriitiline hindamine on parandanud VS biokeemilise testimise kvaliteeti. 2. VS skriiningus kasutatavate otsusepiiride puhul vajab kasutatav MS/MS metoodika pidevat jälgimist ja optimeerimist, eelkõige valideerimata (hüdroksü)metaboliitide osas. 3. Esimese 15 kuu jooksul kinnitus päriliku või kaasasündinud ainevahetushaiguse diagnoos 9 patsiendil (1:1882 vastsündinu kohta). FPR oli 0.18% ja PPV 25%. FPR vähenes ja PPV hulk tõusis 2015.a esimese 3 kuu jooksul 2014. aasta esimese 6 kuu ning pilootprojekti koondtulemustega võrreldes. 42 KOKKUVÕTE Kaasasündinud ainevahetushaigused on geneetilised häired, mida põhjustab kindla keemilise reaktsiooni kõrvalekalle ainevahetusrajas, haiguste grupi üldine esinemissagedus on kuni 1:2500 vastsündinu kohta. Haiguste kliiniline pilt on väga varieeruv, haigused võivad avalduda juba vastsündinu eas, aga ka täiskasvanutel, ning tekitada arengule pöördumatut kahju. VS on mitmesuguste kaasasündinud haiguste testimine, et tagada patsientidele ravi alustamine haiguse asümptomaatilises või varases perioodis. VS töötati välja 1960. aastatel, algselt PKU tuvastamiseks. Hiljem on lisatud VS paneelidesse uusi haigusi, kuid kuna iga analüüs vajas eraldi metoodikat, arenes valdkond aeglaselt. Tormiline areng toimus tänu MS/MS metoodika rakendamisele, mis võimaldab testida vastsündinuid ühe analüüsi käigus kümnete erinevate ainevahetushaiguste suhtes. Paljud riigid on juurutanud laiendatud sõeltestimise programmid. 2014. aastal viidi SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuses läbi laiendatud skriiningu pilootprojekt, mille raames hakati Eesti vastsündinuid testima lisaks PKU-le ja CH- le veel 18 ainevahetushaiguse suhtes. Esimese 15 kuu jooksul skriiniti 16 938 vastsündinut, kinnitatud positiivse diagnoosi sai 9 vastsündinut (FPR 0,18%, PPV 24%). Antud magistritöös hinnati VS meetodi usaldusväärsust ja tulemuslikkust laborisiseste kvaliteedi hindamise ning rahvusvahelise ERNDIM kontrollproovide analüüsil. Pilootprojekti koondtulemuste põhjal hinnati programmi laiemaid tulemuslikkuse parameetreid. Lisaks määrati pilootprojekti ning 2015. aasta esimese kolme kuu vastsündinute tulemuste põhjal metaboliitide normivahemikke ja haiguslikke kõrvalekaldeid iseloomustavad protsentiilide väärtused. Laborisisese kontrolli tulemustest võib järeldada, et analüüsi teostamine kasutatud meetodi tingimustel on efektiivne ja usaldusväärne. Võrdluskatsete tulemused kinnitavad meetodi suutlikkust proovidest kõrvalekaldeid tuvastada. Kuid tähelepanu tuleb pöörata proovide ettevalmistamise täpsusele ning tulemuste interpreteerimisel kasutada laboris sisse töötatud cut-off väärtusi. Välise kvaliteedi kontrolli tulemuste kriitiline hindamine on parandanud VS biokeemilise testimise kvaliteeti. VS skriiningus kasutatavate otsusepiiride puhul vajab kasutatav MS/MS metoodika pidevat jälgimist ja optimeerimist. Projekti koondtulemustes on märgata selget FPR osakaalu vähenemist ning PPV kasvu. Üldistused haiguste täpsete esinemissageduste ja programmi tulemuslikkuse kohta vajavad pikemat kogemust ning ajaraami. Leiame, et projekti tuleb kindlasti jätkata. 43 Expanded newborn screening for inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry Ursula Ilo SUMMARY Inborn Errors of Metabolism (IEM) are genetic disorders caused by alterations of a specific biochemical reaction in metabolism. Although individually rare, they collectively account for a significant proportion of illnesses, particularly in children. The overall prevalence varies between regions, but is estimated that about 1:2500 newborns is affected. IEM can be pleiotropic and can involve virtually any organ or system. Initial clinical presentation can occur any time from prenatal development through adulthood. The primary aim of early detection and treatment of clinically important disorders is to minimize morbidity and mortality in early childhood as well as long-term consequences of the condition. The foundations population based newborn screening (NBS) programs stem from the work of Robert Guthrie in the 1960s when systematic screening identified, within the first days of life, babies with phenylketonuria. The introduction of the analysis of acylcarnitines and amino acids by tandem mass spectrometry (MS/MS) to population based NBS has tremendously increased the number of detectable IEM-s amenable to intervention. Several countries have already implemented expanded screening programs, testing more than 20 metabolic conditions. In the beginning of 2014 Estonia introduced screening for 19 IEM by MS/MS as a pilot study. In the first 15 months of screening, a total of 16 938 newborns were screened and 9 confirmed cases detected (1:1882 newborns affected; FPR 0.18%; PPV 24%). The aims of the present study were to verify the MS/MS method in the clinical laboratory carrying out the NBS program by performing both internal and external quality assurance studies in order to ensure the robustness and performance of the analytical method and the overall analytical process in the specific context of a physical laboratory facility. In addition, we established cut-off values for detection of metabolites of interest based on the results of the first 15 months of screening. 44 Internal quality assurance studies suggest that performing newborn screening at given analytical conditions is sufficiently robust and reliable. Results from external quality assurance program ERNDIM suggest that the method detects alterations in metabolite concentration from test samples, but sample preparation conditions need to be precisely monitored and the interpretation of the results has to be based on cut-off values established in the laboratory facility to ensure precision. Establishing cut-off values based on a larger cohort (6000 newborns vs 16000 newborns) helps to increase objectivity in the interpretation of the results. The notable changes in some cut-off values (e.g. analysing metabolites without validated internal standards) indicate the need to consider the technological specifications as well as optimize the analytical conditions and cut-off values over time. The results of the pilot of study and first 15 months of expanded newborn screening for IEM in Estonia indicate notable decline in false positive rate (0.28% in the first 6 months; 0.1% in the second 6 months and 0.16% overall) and increase in positive predictive value (18% in the first 6 months; 36% in the second 6 months and 25% overall) Results regarding IEM prevalence and overall efficacy of the program need more substantial experience in longer time frame. 45 TÄNUAVALDUSED Soovin tänada oma juhendajaid Katrin Õunapit, Kadi Künnapast, Karit Reinsoni ja Neeme Tõnissoni, kes andsid mulle võimaluse teha magistritöö väga huvitaval teemal ning olid töö kirjutamisel alati abivalmid, toetavad ning vajadusel ka kriitilised. Lisaks tänan SA Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabori geneetikakeskuse ainevahetushaiguste labori kollektiivi abi ja kannatlikkuse eest töö praktilise osa läbiviimisel. Antud projekti on toetatud Eesti Teadusagentuuri PUT0355 personaalsest uuringutoetusest ja SA TÜK ühendlabori poolt. 46 KASUTATUD KIRJANDUSE LOETELU Abhyankar, S., Lloyd-Puryear, M.A., Goodwin, R., Copeland, S., Eichwald, J., Therrell, B.L., Zuckerman, A,, Downing, G., McDonald, C.J., (2010), „Standardizing newborn screening results for health information exchange,“ AMIA Annual Symposium Proceedings, 2010: 1–5 Allard, P., Grenier, A., Korson, M.S., Zytkovicz, T.H., (2004), „Newborn screening for hepatorenal tyrosinemia by tandem mass spectrometry: analysis of succinylacetone extracted from dried blood spots,“ Clinical Biochemistry, 37:1010–5 American College of Medical Genetics Newborn Screening Expert Group, (2006), „Newborn screening: Toward a Uniform Screening Panel and System – Executive Summary“, Pediatrics, 117:296–307 Andermann, A., Blancquaert, I., Beauchamp, S., Dery, V., (2008), „Revisiting Wilson and Jungner in the genomic age: a review of screening criteria over the past 40 years, Bull World Health Organisation, 86(4):317-9 Andresen, B.S., Dobrowolski, S.F., O'Reilly, L., Muenzer, J., McCandless, S.E., Frazier, D.M., Udvari, S., Bross, P., Knudsen, I., Banas, R., Chace, D.H., Engel, P., Naylor, E.W., Gregersen, N., (2001), „Medium-chain acyl- CoA dehydrogenase (MCAD) mutations identified by MS/MS-based prospective screening of newborns differ from those observed in patients with clinical symptoms: identification and characterization of a new, prevalent mutation that results in mild MCAD deficiency,“ American Journal of Medical Genetics, 68(6):1408-18 Applegarth, D.A., Dimmick, J.E., Toone, J.R., (1989), „Laboratory detection of metabolic disease,“ Pediatric Clinics of North America, 36(1):49-65 Applegarth, D.A., Toone, J.R., Lowry, R.B., (2000), „Incidence of inborn errors of metabolism in British Columbia, 1969–1996,“ Pediatrics, 105:10 Blau, N., Leonard, J., Hoffmann, G.F., Clarke, J.T.R., (2006), „Physician’s guide to the treatment and follow-up of metabolic diseases, 2nd ed. Berlin: Springer-Verlag Bodamer, O.A., Hoffmann, G.F., Lindner, M., (2007), “Expanded newborn screening in Europe 2007,” Journal of Inherited Metabolic Disease, 30:439-444 Carlson, M.D., (2004), “Recent advances in newborn screening for neurometabolic disorders,” Current Opinions in Neurology, 17:133–138 Carpenter, K., Wiley, V., Sim, K.G., Heath, D., Wilcken, B., (2001), “Evaluation of newborn screening for medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency in 275 000 babies,” Archives of Disease in Childhood. Fetan and Neonatal, 85(2):F105-9 Chace, D.H., Millington, D.S., Terada, N., Kahler, S.G., Roe, C.R., Hofman, L.F., (1993), „Rapid diagnosis of phenylketonuria by quantitative analysis for phenylalanine and tyrosine in neonatal blood spots by tandem mass spectrometry,“ Clinical Chemistry, 39:66-71 Chace, D.H., Hillman, S.L., Millington, D.S., Kahler, S.G., Roe, C.R., Naylor, E.W., (1995), „Rapid diagnosis of maple syrup urine disease in blood spots from newborns by tandem mass spectrometry,“ Clinical Chemistry, 41:62-68 Chace, D.H., Kalas, T.A., Naylor, E.W., (2002), „The application of tandem mass spectrometry to neonatal screening for inherited disorders of intermediary metabolism,“ Annual Review of Genomics and Human Genetics, 3:17-45 Chace, D.H., Kalas, T.A., Naylor, E.W., (2003), „Use of tandem mass spectrometry for multianalyte screening of dried blood specimens from newborns,“ Clinical Chemistry, 49(11):1797-817 Chace, D.H., Kalas, T.A., (2005), A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing,“ Clinical Biochemistry, 38(4):296-309 Chace, D.H., (2009), „Mass spectrometry in newborn and metabolic screening: historical perspective and future directions,“ Journal of Mass Spectrometry, 44, 163–170 Chapman, K.A., Ganesh, J., Ficicioglu, C., (2008), „A false-positive newborn screening result: goat's milk acidopathy,“ Pediatrics, 122(1):210-1 47 Dantas, M.F., Suormala, T., Randolph, A., Coelho, D., Fowler, B., Valle, D., Baumgartner, M.R., (2005), „3- Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency: mutation analysis in 28 probands, 9 symptomatic and 19 detected by newborn screening,“ Human Mutation, 26(2):164 De Jesus, V.R., Chace, D.H., Lim, T.H., Mei, J.V., Hannon, W.H., (2010)., „Comparison of amino acids and acylcarnitines assay methods used in newborn screening assays by tandem mass spectrometry,“ Clinical Chimica Acta, 411,(9-10);684-9 Denne, S.C., Karn, C.A., Ahlrichs, J.A., Dorotheo, A.R., Wang, J., Liechty, E.A., (1996), „Proteolysis and phenylalanine hydroxylation in response to parenteral nutrition in extremely premature and normal newborns,“ Journal of Clinical Investigation, 1;97(3):746-54 Dhillon, K.S., Bhandal, A.S., Aznar, C.P., Lorey, F.W., Neogi, P., (2011), „Improved tandem mass spectrometry (MS/MS) derivatized method for the detection of tyrosinemia type I, amino acids and acylcarnitine disorders using a single extraction process,“ Clinical Chimica Acta, 12;412(11-12 Dietzen, D.J., Rinaldo, P., Whitley, R.J., Rhead, W.J., Hannon, W.H., Garg, U.C., et al. (2009), “National academy of clinical biochemistry laboratory medicine practice guidelines: Follow-up testing for metabolic disease identified by expanded newborn screening using tandem mass spectrometry; executive summary,” Clinical Chemistry, 55:1615–1626 Dipple, K.M., McCabe, E.R., (2000), “Modifier genes convert “simple” Mendelian disorders to complex traits,” Molecular Genetics in Metabolism, 71:43-50 Eesti Haigekassa, (2012), „Haiguste ennetamise tegevuskava aastaks 2012“ Efron, M.L, Young, D., Moser, H.W., Maccready, R.A., (1964), „A simple chromatographic screening test for the detection of disorders of amino acides metabolism. A technic using whole blos or urine collected on filter paper,“ New England Journal of Medicine, 270:1378-83 Engvall, M.L., Zetterstrom, R.H., Ahlman, H., Ohlsson, A., Guthenberg, C., Rinaldo, P., von Döbeln, U., (2012). „Experiences from implementation of national expanded newborn screening in Sweden,“ (avaldamata andmed) Fowler, B., Burlina, A., Kozich, V., Vianey-Saban, C., (2008), Quality of analytical performance in inherited metabolic disorders: the role of ERNDIM,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 31(6):680-9lot Franzson, L., (2012), „Newborn screening of rare diseases in Iceland and ohter Nordic countries,“ Nordic Conference on Rare Diseases (konverentsi ettekanne) Frazier, D.M., Millington, D.S., McCandless, S.E., Koeberl, D.D., Weavil, S.D., Chaing, S.H., Muenzer, J, (2006), „The tandem mass spectrometry newborn screening experience in North Carolina: 1997–2005,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 29:76–85 Gan-Schreier, H., Kebbewar, M., Fang-Hoffmann, J., Wilrich, J., Abdoh, G., Ben-Omran, T., Shahbek, N., Bener, A., Al Rifai, H., Al Khal, A.L., Lindner, M., Zschocke, J., (2010), „Newborn population screening for classic homocystinuria by determination of total homocysteine from Guthrie cards,“ Journal of Pediatrics, 156:427-432 Garg, U. ja Dasouki, M., (2006), „Expanded newborn screening of inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry: clinical and laboratory aspects,“ Clinical Biochemistry, 39(4):315-32 Garrod, A., (1908), „The coonian lectures on inborn errors of metabolism, lecture II: alkaptonuria,“ Lancet, 2:73- 79 Grosse, S.D., Boyle, C.A., Kenneson, A., Khoury, M.J., Wilfond, B.S., (2006), „From public health emergency to public health service: the implications of evolving criteria for newborn screening panels,“ Pediatrics, 117(3):923-9 Guthrie, R., Susi, A., (1963), „A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants,“ Pediatrics, 32:338–343 48 Hall., P.L., Marquardt, G., McHugh, D.M.S., Currier, R.J., Tang, H., Stoway, S., Rindaldo, P., (2014), „Postanalytical tools improve performance of newborn screening by tandem mass spectrometry,“ Genetics in Medicine, 16:889-895 Holtzman, N.A., (2003), Expanding newborn screening: how good is the evidence?, JAMA, 290(19):2606–8 Joost, K., Õunap, K., Žordania, R., et al., (2012), Prevalence of Long-Chain 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase Deficiency in Estonia,“ Journal of Inherited Metabolic Disease Rep, 2:79–85 Koeberl, D.D., Millington. D.S., Smith, W.E., Weavil, S.D., Muenzer, J.M, McCandless, S.E., Kishnani, P.S., McDonald, M.T., Chaing, S., Boney, A., Moore, E., Frazier, D.M., (2003), Evaluation of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency detected by tandem mass spectrometry newborn screening,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 26(1):25-35 Kölker, S., Garbade, S.F., Greenberg, C.R., Leonard, J.V., Saudubray, J.M., Ribes, A., Kalkanoglu, H.S., Lund, A.M., Merinero, B., Wajner, M., Troncoso, M., Williams, M., Walter, J.H., Campistol, J., Martí-Herrero, M., Caswill, M., Burlina, A.B., Lagler, F., Maier, E.M., Schwahn, B., Tokatli, A., Dursun, A., Coskun, T., Chalmers, R.A., Koeller, D.M., Zschocke, J., Christensen, E., Burgard, P., Hoffmann, G.F., (2006), „Natural history, outcome, and treatment efficacy in children and adults with glutaryl-CoA dehydrogenase deficiency,“ Pediatric Research, 59:840-847 Kölker, S., Garbade, S.F., Boy, N., Maier, E.M., Meissner, T., Mühlhausen, C., Hennermann, J.B., Lücke, T., Häberle, J., Baumkötter, J., Haller, W., Muller, E., Zschocke, J., Burgard, P., Hoffmann, G.F., (2007), „ Decline of acute encephalopathic crises in children with glutaryl-CoA dehydrogenase deficiency identified by newborn screening in Germany,“ Pediatric Research, 62:357-363 la Marca, G., Malvagia, S., Pasquini, E., et al., (2008), „The inclusion of succinylacetone as marker for tyrosinemia type I in expanded newborn screening programs. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 22:812–8 Lanpher, B., Brunetti-Pierri, N., Lee, B., (2006), „Inborn errors of metabolism: the flux from Mendelian to complex diseases,“ Nature Reviews Genetics, 7(6):449-60 Lee, H.C., Mak, C.M., Lam, C.W., Yuen, Y.P., Chan, A.O., Shek, C.C., et al., (2011), „Analysis of inborn errors of metabolism: Disease spectrum for expanded newborn screening in Hong Kong, „Chinese Medical Journal (Engl), 124:983–9 Lehotay, D.C., Hall, P., Lepage, J., Eichhorst, J.C., Etter, M.L., Greenberg, C.R., (2011),“LC-MS/MSprogress in newborn screening,“ Clinical Biochemistry, 44:21-31 Levy, H.L., Coulombe, J.T., Shih, V.E., (1980), „Newborn urine screening,“ Bickel H Guthrie R Hammersen G eds. Neonatal screening for inborn errors of metabolism: 89-103 Springer-Verlag Berlin Levy, H.L., (1998), „Newborn screening by tandem mass spectrometry: a new era,“ Clinical Chemistry, 44(12):2401-2 Lindner, M., Ho, S., Fang-Hoffmann, J., Hoffmann, G.F., Kölker, S., „Neonatal screening for glutaric aciduria type I: strategies to proceed,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 29(2-3):378–82 Lindner, M., Abdoh, G., Fang-Hoffmann, J., Shabeck, N., Al-Sayrafi, M., Al-Janahi, M., et al., (2007), „Implementation of extended neonatal screening and a metabolic unit in the State of Qatar: Developing and optimizing strategies in cooperation with the Neonatal Screening Center in Heidelberg,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 30:522–529 Lindner, M., Ho, S., Kolker, S., Abdoh, G., Hoffmann, G.F., Burgard, P, (2008), „Newborn screening for methylmalonic acidurias--optimization by statistical parameter combination,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 31:379–85 Lindner, M., Gramer, G., Haege, G., Fang-Hoffmann, J., Schwab, K.O., Tacke, U., Trefz, F.K., Mengel, E., Wendel, U., Leichsenring, M., Burgard, P., Hoffmann, G.F., (2011), “Efficacy and outcome of expanded newborn screening for metabolic diseases — report of 10 years from South-West Germany,” Orphanet Journal of Rare Diseases, 6:44 49 Loeber, J.G., Burgard, P., Cornel, M.C., et al., (2012), “Newborn screening programmes in Europe; arguments and efforts regarding harmonization. Part 1. From blood spot to screening result,” Journal of Inherited Metabolic Disease, 35:603–11 Lott. J.A., Sardovia-Iyer, M., Speakman, K.S., Lee, K.K., (2004), “Age-dependent cutoff values in screening newborns for hypothyroidism,” Clinical Biochemistry,37(9):791–7 Lund, A.M., Hougaard, D.M., Simonsen, H., Andresen, B.S., Christensen, M., Dunø, M., Skogstrand, K., Olsen, R.K., Jensen, U.G., Cohen, A., Larsen, N., Saugmann-Jensen, P., Gregersen, N., Brandt, N.J., Christensen, E., Skovby, F., Nørgaard-Pedersen, B.. (2012), “Biochemical screening of 504,049 newborns in Denmark, the Faroe Islands and Greenland--experience and development of a routine program for expanded newborn screening,” Molecular Genetics in Metabolism, 107(3):281-93 Magera, M.J., Gunawardena, N.D., Hahn, S.H., Tortorelli,S., Mitchell, G.A., Goodman, S.I., et al., (2006), “Quantitative determination of succinylacetone in dried blood spots for newborn screening of tyrosinemia type I,” Molecular Genetics in Metabolism, 88:16 –21 Marquardt, G., Currier, R., McHugh, D.M., et al. (2012), “Enhanced interpretation of newborn screening results without analyte cutoff values,” Genetics in Medicine, 14:648–655 Marquardt, G., Currier, R., McHugh, D.M., Gavrilov, D., Magera, M.J., Matern, D., Oglesbee, D., Raymond K, Rinaldo P, Smith EH, Tortorelli S, Turgeon CT, Lorey F, Wilcken B, Wiley V, Greed LC, Lewis B, Boemer F, Schoos R, Marie S, Vincent MF, Sica YC, Domingos MT, Al-Thihli K, Sinclair G, Al-Dirbashi OY, Chakraborty P, Dymerski M, Porter C, Manning A, Seashore MR, Quesada J, Reuben A, Chrastina P, Hornik P, Atef Mandour I, Atty Sharaf SA, Bodamer O, Dy B, Torres J, Zori R, Cheillan D, Vianey-Saban C, Ludvigson D, Stembridge A, Bonham J, Downing M, Dotsikas Y, Loukas YL, Papakonstantinou V, Zacharioudakis GS, Baráth Á, Karg E, Franzson L, Jonsson JJ, Breen NN, Lesko BG, Berberich SL, Turner K, Ruoppolo M, Scolamiero E, Antonozzi I, Carducci C, Caruso U, Cassanello M, la Marca G, Pasquini E, Di Gangi IM, Giordano G, Camilot M, Teofoli F, Manos SM, Peterson CK, Mayfield Gibson SK, Sevier DW, Lee SY, Park HD, Khneisser I, Browning P, Gulamali-Majid F, Watson MS, Eaton RB, Sahai I, Ruiz C, Torres R, Seeterlin MA, Stanley EL, Hietala A, McCann M, Campbell C, Hopkins PV, de Sain-Van der Velden MG, Elvers B, Morrissey MA, Sunny S, Knoll D, Webster D, Frazier DM, McClure JD, Sesser DE, Willis SA, Rocha H, Vilarinho L, John C, Lim J, Caldwell SG, Tomashitis K, Castiñeiras Ramos DE, Cocho de Juan JA, Rueda Fernández I, Yahyaoui Macías R, Egea-Mellado JM, González-Gallego I, Delgado Pecellin C, García-Valdecasas Bermejo MS, Chien YH, Hwu WL, Childs T, McKeever CD, Tanyalcin T, Abdulrahman M, Queijo C, Lemes A, Davis T, Hoffman W, Baker M, Hoffman, G.L., (2012), “Enhanced interpretation of newborn screening results without analyte cutoff values, Genetics in Medicine, 14(7):648–55 Marshall, E., (2002), “Fast technology drives new world of newborn screening,” Science, 294:2272-2274 McHugh, D., Cameron, C.A., Abdenur, J.E., Abdulrahman, M., Adair, O., Al Nuaimi, S.A., Åhlman, H., Allen JJ, Antonozzi I, Archer S, Au S, Auray-Blais C, Baker M, Bamforth F, Beckmann K, Pino GB, Berberich SL, Binard R, Boemer F, Bonham J, Breen NN, Bryant SC, Caggana M, Caldwell SG, Camilot M, Campbell C, Carducci C, Bryant SC, Caggana M, Caldwell SG, Camilot M, Campbell C, Carducci C, Cariappa R, Carlisle C, Caruso U, Cassanello M, Castilla AM, Ramos DE, Chakraborty P, Chandrasekar R, Ramos AC, Cheillan D, Chien YH, Childs TA, Chrastina P, Sica YC, de Juan JA, Colandre ME, Espinoza VC, Corso G, Currier R, Cyr D, Czuczy N, D'Apolito O, Davis T, de Sain-Van der Velden MG, Delgado Pecellin C, Di Gangi IM, Di Stefano CM, Dotsikas Y, Downing M, Downs SM, Dy B, Dymerski M, Rueda I, Elvers B, Eaton R, Eckerd BM, El Mougy F, Eroh S, Espada M, Evans C, Fawbush S, Fijolek KF, Fisher L, Franzson L, Frazier DM, Garcia LR, Bermejo MS, Gavrilov D, Gerace R, Giordano G, Irazabal YG, Greed LC, Grier R, Grycki E, Gu X, Gulamali-Majid F, Hagar AF, Han L, Hannon WH, Haslip C, Hassan FA, He M, Hietala A, Himstedt L, Hoffman GL, Hoffman W, Hoggatt P, Hopkins PV, Hougaard DM, Hughes K, Hunt PR, Hwu WL, Hynes J, Ibarra-González I, Ingham CA, Ivanova M, Jacox WB, John C, Johnson JP, Jónsson JJ, Karg E, Kasper D, Klopper B, Katakouzinos D, Khneisser 50 I, Knoll D, Kobayashi H, Koneski R, Kozich V, Kouapei R, Kohlmueller D, Kremensky I, la Marca G, Lavochkin M, Lee SY, Lehotay DC, Lemes A, Lepage J, Lesko B, Lewis B, Lim C, Linard S, Lindner M, Lloyd-Puryear MA, Lorey F, Loukas YL, Luedtke J, Maffitt N, Magee JF, Manning A, Manos S, Marie S, Hadachi SM, Marquardt G, Martin SJ, Matern D, Mayfield Gibson SK, Mayne P, McCallister TD, McCann M, McClure J, McGill JJ, McKeever CD, McNeilly B, Morrissey MA, Moutsatsou P, Mulcahy EA, Nikoloudis D, Norgaard- Pedersen B, Oglesbee D, Oltarzewski M, Ombrone D, Ojodu J, Papakonstantinou V, Reoyo SP, Park HD, Pasquali M, Pasquini E, Patel P, Pass KA, Peterson C, Pettersen RD, Pitt JJ, Poh S, Pollak A, Porter C, Poston PA, Price RW, Queijo C, Quesada J, Randell E, Ranieri E, Raymond K, Reddic JE, Reuben A, Ricciardi C, Rinaldo P, Rivera JD, Roberts A, Rocha H, Roche G, Greenberg CR, Mellado JM, Juan-Fita MJ, Ruiz C, Ruoppolo M, Rutledge SL, Ryu E, Saban C, Sahai I, García-Blanco MI, Santiago-Borrero P, Schenone A, Schoos R, Schweitzer B, Scott P, Seashore MR, Seeterlin MA, Sesser DE, Sevier DW, Shone SM, Sinclair G, Skrinska VA, Stanley EL, Strovel ET, Jones AL, Sunny S, Takats Z, Tanyalcin T, Teofoli F, Thompson JR, Tomashitis K, Domingos MT, Torres J, Torres R, Tortorelli S, Turi S, Turner K, Tzanakos N, Valiente AG, Vallance H, Vela-Amieva M, Vilarinho L, von Döbeln U, Vincent MF, Vorster BC, Watson MS, Webster D, Weiss S, Wilcken B, Wiley V, Williams SK, Willis SA, Woontner M, Wright K, Yahyaoui R, Yamaguchi S, Yssel M, Zakowicz W.M., (2011), “Clinical validation of cutoff target ranges in newborn screening of metabolic disorders by tandem mass spectrometry: a worldwide collaborative project,” Genetics in Medicine, 13(3):230–54 Matern, D., Tortorelli, S., Oglesbee, D., Gavrilov, D., Rinaldo, P., (2007), “Reduction of the false-positive rate in newborn screening by implementation of MS/MS-based second-tier tests: the Mayo Clinic experience (2004- 2007)” Journal of Inherited Metabolic Disease, 30(4):585–92 Merritt, J.L., Vedal, S., Abdenur, J.E., et al., “Infants suspected to have very-long chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency from newborn screening,” Molecular Genetics and Metabolism, 111:484–492 Metcalfe, S.A., Bittles, A.H., O’Leary, P., Emery, J., (2009), “Australia: Public Health Genomics,” Public Health Genomics, 12:121-128 Metz, T.F., Mechtler, T.P., Merk, M., Gottschalk, A,, Lukačin, R., Herkner, K.R., Kasper, D.C., (2011), „Evaluation of a novel, commercially available mass spectrometry kit for newborn screening including succinylacetone without hydrazine,“ Clinical Chimica Acta, 413(15-16):1259-64 Mikelsaar, R.V., Zordania, R., Viikmaa, M., Kudrjavtseva, G., (1998), „Neonatal screening for congenital hypothyroidism in Estonia, Journal of Medical Screening, 5:20–21 Paul, D.B., (1997), „The history of phenylketonuria screening in the US,“ Watson MS, editor. Promoting safe and effective genetic testing in the United States: final report on the task force on genetic testing. Bethesda: National Institutes of Health Paul, D.B., (2008), „Patient advocacy in newborn screening: Continuities and discontinuities,“ American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics, 148:8-14 Pettersen, R.D., (2012), „Expanded newborn screening in Norway,“ 8th ISNS European Neonatal Screening Regional Meeting in Budapest (konverentsiettekanne) Pitt, J.J., (2010), “Newborn screening,” Clinical Biochemistry Reviews, 31:57–68 Plass, A.M., van El, C. G., Pieters, T., Cornel, M.C., (2010), “Neonatal screening for treatable and untreatable disorders: Prospective parents’ opinions,” Pediatrics, 125:99–106 Pollak, A, Kasper, D.C., (2013), “Austrian Newborn Screening Program: a perspective of five decades,” Journal of Perinatal Medicine, 42(2):151–158 Pollitt, R.J., (2006), “International perspectives on newborn screening,” Journal of Inherited Metabolic Disease 29:390-396 Pollitt, R.J., (2007), “Introducing new screens: Why are we all doing different things?” Journal of Inherited Metabolic Diseas, 30:423-429 51 Pourfarzam, M., Zadhoush, F., (2013), „Newborn Screening for inherited metabolic disorders; news and views,“ Journal of Research in Medical Science, 18(9):801-808 President’s Council on Bioethics, (2008), „The Changing Moral Focus of Newborn Screening, President’s Council on Bioethics,“ Washington, DC Prosser, L.A., Kong, C.Y., Rusinak, D., Waisbren, S.L., (2010), „Projected costs, risks, and benefits of expanded newborn screening for MCADD,“ Pediatrics, 125:e286–94 Rashed, M.S., Ozand, P.T., Bucknall, M.P., Little, D., (1995), „Diagnosis of inborn errors of metabolism from blood spots by acylcarnitines and amino acids profiling using automated electrospray tandem mass spectrometry,“ Pediatric Research, 38(3):324-31 Rhead, W.J., Allain, D., Van Calcar, S., et al. (2002), „Short chain acyl-CoA dehydrogenase (SCAD) and 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCC) deficiencies: tandem mass spectrometry newborn screening detects many clinically benign cases,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 25:1-4 Rhead, W.J., (2006), „Newborn screening for medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency: a global perspective,“ Journal of Inherited Metabolic Disease, 29(2-3):370-7 Rinaldo, P., Zafari, S., Tortorelli, S., Matern, D., (2006), “Making the case for objective performance metrics in newborn screening by tandem mass spectrometry,” Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Review, 12:255–61 Rousseau, F., Giguère, Y., Berthier, M.T., Guérette, D., Girard, J.G., Déry, M., (2012), „Newborn Screening By Tandem Mass Spectrometry: Impacts, Implications and Perspectives,“ Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles, Dr Jeevan Prasain (Ed.) Sander, J., Janzen, N., Peter, M., Sander, S., Steuerwald,U., Holtkamp, U., et al., (2006), “Newborn screening for hepatorenal tyrosinemia: tandem mass spectrometric quantification of succinylacetone,” Clinical Chemistry, 52:482–7. Schulze, A., Lindner, M., Kohlmuller, D., Olgemoller, K., Mayatepek, E., Hoffmann, G.F., (2003), “Expanded newborn screening for inborn errors of metabolism by electrospray ionization-tandem mass spectrometry: Results, outcome, and implications,” Pediatrics, 111:1399–1406 Scriver, C.R., Davies, E., Cullen, A.M., (1964), “Application of a simple micromethod to the screening of plasma for a variety of aminoacidopathies,” Lancet, 2(7353):230-2 Turgeon, C., Magera, M.J., Allard, P., et al., (2008), “Combined newborn screening for succinylacetone, amino acids, and acylcarnitines in dried blood spots,” Clinical Chemistry, 54:657–64 U.S. Congress, Office of Technology Assessment, (1988), “Healthy children: investing in the future, Washington, D.C.: Government Printing Office Uudelepp, M.-L., Joost, K., Žordania. R,, Õunap. K., (2012), “Fenüülketonuuria Eesti ravijuhend,” Eesti Arst, 91:46–51 Venditti, L.N., Venditti, C.P., Berry, G.T., Kaplan, P.B., Kave, E.M, Glick, H, Stanley, C.A., (2003), “Newborn screening by tandem mass spectrometry for medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase deficiency: a cost- effectiveness analysis,” Pediatrics, 112(5):1005-15 52 Vilarinho, L., Rocha, H., Sousa, C., Marcao, A., Fonseca, H., Bogas, M., Osorio, R.V., (2010), “Four years of expanded newborn screening in Portugal with tandem mass spectrometry”, Journal of Inherited Metabolic Disease, 33:133-138 Waisbren, S.E., Albers, S., Amato, S., Ampola, M., Brewster, T.G., Demmer, L., Eaton, R.B., Greenstein, R., Korson, M., Larson, C., Marsden, D., Msall, M., Naylor, E. W., Pueschel, S., Seashore, M., Shih, V.E., Levy, H. L., (2003), Effect of expanded newborn screening for biochemical genetic disorders on child outcomes and parental stress, JAMA, 290(19):2564–72 Waisbren, S.E., (2008), “Expanded newborn screening: Information and resources for the family physician,” American Family Physician; 77:987–994 Wilcken B., (2003), „Ethical issues in newborn screening and the impact of new Technologies,“ European Journal of Pediatrics, 162:62–66. Wilcken, B., Wiley, V., Hammond, J., Carpenter, K., (2003), “Screening newborns for inborn errors of metabolism by tandem mass spectrometry,” New England Journal of Medicine, 3(348):2304–2312 Wilcken, B., Wiley, V., (2008), “Newborn screening,” Pathology, 40:104–15. Wilcken, B., Haas, M., Joy, P., Wiley, V., Bowling, F., Carpenter, K., et al. (2009), “Expanded newborn screening: Outcome in screened and unscreened patients at age 6 years,” Pediatrics, 124:241–248 Wilcken, B., (2010), “Expanded newborn screening: Reducing harm, assessing benefit,” Journal of Inherited Metabolic Disease, 33:205–210 Wiley, V., Carpenter, K., Wilcken, B., (1999), Newborn screening with tandem mass spectrometry: 12 months' experience in NSW Australia,“ Acta Paediatrica Supplement, 88(432):48-51 Wilson, J.M.G., Jungner, Y.G., (1968), „Principles and practice of mass screening for disease.“ Boletín de la Oficina Sanitaria Panamericana, 65:281–393 Wilson, J.M.G., Jungner, Y.G., (1968), „Principles of screening for disease,“ Geneva: World Health Organization Õunap, K., Lilleväli, H., Metspalu, A., Lipping-Sitska, M., (1998), „Development of the phenylketonuria screening programme in Estonia,“ Journal of Medical Screening, 5:22–23 Ziadeh, R., Hoffman, E.P., Finegold, D.N., Hoop, R.C., Brackett, J.C., Strauss, A.W., Naylor, E.W., (1995), Medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency in Pennsylvania: neonatal screening shows high incidence and unexpected mutation frequencies,“ Pediatric Research, 37(5):675-8 Zytkovicz, T.H., Fitzgerald, E.F., Marsden, D., Larson, C.A., Shih, V.E., Johnson, D.M., Strauss, A.W., Comeau, A.M., Eaton, R.B., Grady, G.F., (2001), „Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two-year summary from the New England Newborn Screening Program,“ Clinical Chmistry, 47(11):1945-55 53 Kasutatud veebiaadressid: http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=newbornscreening (külastatud 13.04.15) http://whqlibdoc.who.int/php/WHO_PHP_34.pdf (külastatud 13.04.15) http://mchb.hrsa.gov/programs/newbornscreening/screeningreport.html (külastatud 19.04.15) http://newbornbloodspot.screening.nhs.uk/imd (külastatud 21.04.15) http://www.novorozeneckyscreening.cz/en/for-the-public (külastatud 25.04.15) http://ldmp.upol.cz/newborns.php (külastatud 25.04.15) http://www.census.gov/population/international/data/idb/rank.php (külastatud 20.04.15) https://www.haigekassa.ee/et/partnerile/raviasutusele/tervishoiuteenuste-loetelu http://www.chromsystems.com http://www.clir-r4s.org/Default.aspx www.omim.org 54 55 56 57 58 59 Lihtlitsents lõputöö reprodutseerimiseks ja lõputöö üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Mina, Ursula Ilo, (sünnikuupäev: 30.09.1989) 1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) enda loodud teose „Vastsündinute laiendatud skriining kaasasündinud ainevahetushaiguste suhtes tandem mass- spektromeetria meetodil“ mille juhendajad on Katrin Õunap, Kadi Künnapas, Karit Reinson, Neeme Tõnisson, 1.1. reprodutseerimiseks säilitamise ja üldsusele kättesaadavaks tegemise eesmärgil, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace-is lisamise eesmärgil kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni; 1.2. üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Tartu Ülikooli veebikeskkonna kaudu, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace´i kaudu kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni. 2. olen teadlik, et punktis 1 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile. 3. kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei rikuta teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse seadusest tulenevaid õigusi. Tartus, 26.05.2015 60