Plasmiidi-vahetamise meetod
Plasmiidi-vahetamise meetodit saab kasutada uurimaks mutantse valgu funktsioone või isoleerida ja iseloomustada erinevaid geeni alleele. Kasutatakse tsentromeerseid süstik-vektoreid.
Meetod koosneb kolmest etapist (Joonis 13):
1. Vastuvõtva tüve konstrueerimine.
Konstrueeritakse haploidne tüvi, mis sisaldab uuritava geeni (GEEN X) kromosomaalset nullalleeli (
geenX). Funktsionaalne geeni koopia asub rakus olevas tsentromeerses plasmiidis, mis sisaldab selekteeritavat markegeeni URA3.
geenX). Funktsionaalne geeni koopia asub rakus olevas tsentromeerses plasmiidis, mis sisaldab selekteeritavat markegeeni URA3.
2. Uuritavat geeni ekspresseeriva plasmiidi kloonimine. Pärmirakkude transformeerimine.
Kloonitav süstik-vektor sisaldab teist selektsioonimarkerit (näit. LEU2). Ekspresseeruv geen võib olla muteeritud, ekspresseeruda liitvalguna jne. Plasmiid transformeeritakse vastuvõtvasse tüvesse. Saadud uus tüvi sisaldab kahte plasmiidi - metsiktüüpi geen (GEEN X) ekpresseerub URA3 markergeeniga plasmiidilt ning mutantne alleel (geenX) ekpresseerub LEU2 markergeeniga plasmiidilt.
3. Metsiktüüpi geeni sisaldava plasmiidi vastuselektsioon.
Selekteeritakse vastu esimese plasmiidi markerit. Näiteks URA3 puhul kasvatatakse rakke 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldaval söötmel. URA3 kodeerib orotidiin-5'-fosfaat dekarboksülaasi, ensüümi, mis osaleb pürimidiinide biosünteesi rajas. Tüved, mis sisaldavad esialgset plasmiidi, ekspresseerivad funktsionaalset Ura3, mis muudab 5-FOA mürgiseks 5-fluorouratsiiliks. Sellised rakud 5-FOA sisaldaval söötmel kasvada ei saa. Seetõttu kaotavad rakud URA3 markergeeniga plasmiidi ning alles jäänud LEU2 markergeeniga plasmiidilt ekspresseerub uuritava geeni mutantne alleel.
Joonis 13. Plasmiidi-vahetamise meetod.
Põhiliseks plasmiidi-vahetamise meetodi puuduseks on tsentromeerse plasmiidi koopiaarvu varieeruvus. Tsentromeerseid süstik-vektoreid võib olla kuni 3-4 koopiat raku kohta. See põhjustab erinevusi uuritava alleeli ekspressioonitasemes. Näiteks võib mõnede alleelide üle-ekpressioon päästa mutantse fenotüübi. Samas, kui seesama alleel on rakus vaid ühe koopiana mutantne fenotüüp avaldub.