Valguliste antigeenide identifitseerimine
Mikroorganimi
võimalike antigeensete valkude identifitseerimiseks võib kasutada mikroobi
rakkude täislüsaati või rakkude astmelisel ekstraheerimisel (nt Gram positiivsete bakterite töötlus LiCl-ga)
saadud komponentide segu. Samuti võib kasutada ka rakulüsaadi tsentrifuugimisel
saadud tsütoplasma, organellide ja membraanitükkide fraktsioone.
1-D immunoblot
Valguliste komponentide lahutamiseks kasutatakse kõige sagedamini elektoforeesi taandavates ja denatureerivates tingimustes (SDS-PAAGE). Selle meetodi puhul lahutatakse naatrium dodetsüülsulfaadiga (SDS) kaetud valgud polüakrüülamidgeelis (PAAG) vastavalt nende suurusele, kuna väiksemad polüpeptiidid liiguvad elektriväljas kiiremini ja suuremad aeglasemalt. Selleks, et leida antigeensed polüpeptiidid, tuleb valgud pärast lahutusprotsessi lõppu kanda õhukesele membraansele materjalile (nt. nitrotselluloos (NC) või polüvinülideendifluoriid (PVDF)). Membraanist lõigatud ribadele lisatakse patogeeniga (mikroorganismiga) eelnevalt kokkupuutunud (nakatunud) inimese või imeteja (hiir, küülik, kits jne.) seerumit. Seerumis esinevad antihehad seonduvad spetiifiliselt membraanil olevate polüpeptiididega ja kui nüüd membraaniribale lisada liigi- ja antikeha isotüübi spetsiifilisi märgistatud (mädarõika peroksidaas (HRP), aluseline fosfataas (AP)) antikehasid, ilmub märgisele sobiliku substraadi lisamisel membraaniribal nähtavale immunogeensete valkude triibustik.
Joonis 1. Helicobacter pylori rakkude täislüsaadist hepariinile seonduvate valkude 1-D immunoblot. 1, 3-H.pylori’ga nakatunud patsientide seerumis olevate IgG tüüpi antikehade seondumisel bakteri immunogeensetele valkudele tekib triibustik. 2-terve inimese seerumis bakterivalkudele seonduvad spetsiifilised antikehad puuduvad ja triibustikku ei teki.
Kui SDS-PAAG-i hoida värvilahuses (nt. Coomassie sinine), muutub lahutunud valkude triibustik geelis nähtavaks. Võrreldes geelis siniseks värvunud valgutriibustikku membraaniribal olevate triipudega, saame geelis leida triibu, millele membraanil antikeha seondus ning selle geelist välja lõigata. Edasi lisatakse geelitükile ensüümi (nt.trüpsiini), mis polüpeptiidi peptiidideks fragmenteerib. Tekkinud ja geelitükist lahusesse ekstraheeritud peptiidide masse saab määrata MALDI-TOF MS abil. Tulemuseks on valgu peptiidide masside kaart.
|
m/z (av)
825.9245
835.8946
840.8706
1003.1507
1016.2771
1106.2507
1122.2501
1133.2079
1152.3471
1173.3198
1246.5240
1262.5234
1379.6094
2130.4867
2146.4860
2356.6253
3218.7585
3234.7578 3250.7572 3266.7566 |
 |
Otsing valgu järjestuste andmebaasides NCBInr, SwissProt, TREMEL ... http://www.matrixscience.com/search_form_select.html |
|
|
Ülesanne
Tutvu Mascot programmiga Matrixscience’i kodulehel http://www.matrixscience.com/search_form_select.html ja kasutades toodud m/z väärtusi, teosta otsing. Millise valguga on tegemist ?
m/z (av)
825.9245
835.8946
840.8706
1003.1507
1016.2771
1106.2507
1122.2501
1133.2079
1152.3471
1173.3198
1246.5240
1262.5234
1379.6094
2130.4867
2146.4860
2356.6253
3218.7585
3234.7578
3250.7572
3266.7566
Teiseks võimaluseks on teostada peptiidide segule (nano)- LC-ESI-MS/MS analüüs. Selleks lahutatakse trüpsiiniga tekkinud peptiidid esmalt vedelikkromatograafia abil C-18 kandjal üksikuteks peptiidideks, mille massid seejärel määratakse elektropihustus-ionisatsioon-mass-spektromeetriga (ESI-MS). Igat konkreetset peptiidi saab MS instrumendiga lagundada väiksemateks fragmentideks ja tekkinud fragmentide ning aminohapete massid ära määrata. Edasi kasutatakse saadud informatsiooni otsinguteks valkude andmebaasides (Uniprot, Swissprot) ja otsingumootor pakub välja kõige sobilikumad valgud, millest saaksid leitud massidega fragmendid tekkida. Siiski tuleb meeles pidada, et enamasti esineb ühes geelisolevas valgutriibus mitu erinevat polüpeptiidi, mis muudab antigeenide identifitseerimise komplitseerituks. Valkude paremat lahutuvust on võimalik saavutada 2-D elektroforeesiga.
Antigeensete valkude identifitseerimine 2D immunoblottingu teel
Valgusegude lahutamiseks saab kasutada ka 2-dimensionaalsest (2-D) elektroforeesi. Selle meedodi puhul toimub esimene lahutamine lähtuvalt valkude isoelektrilisest punktist pI (s.o. keskkonna pH väärtus, mille puhul valgumolekuli summaarne laeng on null). Selleks kantakse proov geeliga testribale, mille geelis on tekitatud spetsiaalsete ühendite (amfoliinide) immobiliseerimise teel pH gradient. Kui prooviga testribale rakendatakse elektriväli, hakkavad valgumolekulid sõltuvalt nende laengust liikuma kas anoodi või katoodi poole. Jõudes testribas sellisesse pH punkti, mis langeb kokku antud molekuli isoelektrilise punktiga (pI), muutub summaarne laeng nulliks ja liikumine elektriväljas lakkab. Tekivad kitsad valkude triibud, milles enamasti paiknevad väga lähedase pI-ga molekulid. Seejärel paigutatakse riba SDS-PAAG-le ja nüüd toimub lahutamine lähtuvalt molekuli suurusest SDS juuresolekul taandavates tingimustes (sarnaselt 1-D elektroforeesiga). Ja lõpuks viiakse lahutunud valgud elektroblottingu abil NC või PVDF membraanile, kus saab antigeensete valkude olemasolu visualiseerida patsiendi seerumi, mono- või polüklonaalse antikehaga reaktsiooni teostamisel. 2-D geeli saab värvida tavapärasel moel ka Coomassie värvidega. Olles leidnud antigeense valgutäpi membraanil ja sellele vastava Coomassie'ga värvunud täpi, saame viimase geelist välja lõigata, ensüümiga peptiidideks tükeldada ja teostada LC-ESI-MS/MS abil peptiide järjestuse määramise ning võrdlemise andmebaasides leiduvate valkude järjestustega. Tulemuseks on antigeense valgu identifitseerimine.
Täiendavaks lugemiseks
Täpsema juhendi ja protokolli leiab järgmisest artiklist: Utt M, Nilsson I, Ljungh A, Wadström T. "Identification of novel immunogenic proteins of Helicobacter pylori by proteome technology". J Immunol Methods. 2002 Jan 1;259(1-2):1-10. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175901004768