Eluks hädavajalikud / mittehädavajalikud geenid
Eluks hädavajalikuks geeniks nimetatakse geeni, mille puudumisel rakk sureb. Selliste geenide leidmiseks asendati kõik pagaripärmi avatud lugemisraamid markergeeniga kanMX6 ning analüüsiti saadud mutantide kasvu rikkal söötmel 30 oC juures. Tehti kindlaks, et 18,2% pagaripärmi genoomis olevatest avatud lugemisraamidest on eluks hädavajalikud.
Diploidses rakus asendati uuritava geeni üks alleel markergeeniga (Joonis 6). Kasutati antibiootikumi resistentsusgeeni kanMX6. Pärmitüvi, kes omab seda geeni on võimeline kasvama genetitsiini sisaldaval söötmel. Saadud heterosügootsed diploidsed rakud sporuleeriti ning ühest rakust pärit spoore uuriti tetraadide analüüsi abil.
Kui deleteeritud geen ei ole pärmile eluks hädavajalik, siis eoskotis olevad kõik neli spoori moodustavad kolooniad (Joonis 7). Kahe koloonia rakud sisaldavad genoomis markergeeni kanMX6 ning suudavad kasvada genetitsiini sisaldaval söötmel. Teise kahe koloonia rakud on metsiktüüpi genoomiga ning antibiootikumi sisaldaval söötmel ei kasva.
Kui deleteeritud geen on pagaripärmi eluks hädavajalik geen, siis ainult kaks spoori moodustavad kolooniad (Joonis 8). Rakud nendes kolooniates on metsiktüüpi genoomiga ning genetitsiini sisaldaval söötmel ei kasva.
Diploidses rakus asendati uuritava geeni üks alleel markergeeniga (Joonis 6). Kasutati antibiootikumi resistentsusgeeni kanMX6. Pärmitüvi, kes omab seda geeni on võimeline kasvama genetitsiini sisaldaval söötmel. Saadud heterosügootsed diploidsed rakud sporuleeriti ning ühest rakust pärit spoore uuriti tetraadide analüüsi abil.
Joonis 6. Diploidse raku transformatsioon markergeeniga kanMX6.
Kui deleteeritud geen ei ole pärmile eluks hädavajalik, siis eoskotis olevad kõik neli spoori moodustavad kolooniad (Joonis 7). Kahe koloonia rakud sisaldavad genoomis markergeeni kanMX6 ning suudavad kasvada genetitsiini sisaldaval söötmel. Teise kahe koloonia rakud on metsiktüüpi genoomiga ning antibiootikumi sisaldaval söötmel ei kasva.
Joonis 7. Tetraadide analüüs, et kindlaks teha kas deleteeritud geen on pagaripärmile eluks hädavajalik või mitte. Geen on mittehädavajalik geen, sest kõik neli spoori moodustavad kolooniad. Kaks kolooniat sisaldavad markergeeni kanMX6 ja kasvavad genetitsiini sisaldaval söötmel.
Kui deleteeritud geen on pagaripärmi eluks hädavajalik geen, siis ainult kaks spoori moodustavad kolooniad (Joonis 8). Rakud nendes kolooniates on metsiktüüpi genoomiga ning genetitsiini sisaldaval söötmel ei kasva.
Joonis 8. Tetraadide analüüs, et kindlaks teha kas deleteeritud geen on pagaripärmile eluks hädavajalik või mitte. Geen on pärmile eluks hädavajalik geen. Koloonia moodustavad vaid need kaks spoori, kellel on metsiktüüpi genoom. Spoorid, kus geen on asendatud kanMX6 markergeeniga, ei ole elujõulised.