Pagaripärmi deletsioonimutantide kollektsioon
Pagaripärmi deletsioonimutantide kollektsioon sisaldab 5916 heterosügootset
diploidset tüve, kus on deleteeritud üks geeni alleelidest (sealhulgas ka 1159 eluks hädavajalikku geeni) ning 4757
haploidset tüve ja sama palju homosügootset diploidset tüve, kus on deleteeritud eluks mittehädavajalikud geenid. Haploidsed tüved omavad nii MATa kui ka MAT
paardumistüüpe. Iga deletsioonitüvi sisaldab unikaalset 20 nukleotiidi pikkust koodi ("bar code"), mis võimaldab selle tüve kiiret tuvastamist. Kollektsiooni saab osta Euroscarf, ATCC ja Invitrogeni kaudu.
paardumistüüpe. Iga deletsioonitüvi sisaldab unikaalset 20 nukleotiidi pikkust koodi ("bar code"), mis võimaldab selle tüve kiiret tuvastamist. Kollektsiooni saab osta Euroscarf, ATCC ja Invitrogeni kaudu.
Deletsioonimutandid valmistati start-kuni-stop-koodoni deletsioonid kasutades homoloogilist rekombinatsiooni (Joonis 13).
Avatud lugemisraami (ORF) mõlemast otsast paljundati 45 nukleotiidi pikkune lookuse
spetsiifiline järjestus. Selektsioonimarkerina kasutati kanMX4, mis on domonantne markergeen ja tagab genetitsiini resistentsuse. Iga PCR kassett sisaldab
ka unikaalset 20 nukleotiidi pikkust järjestust e. koodi UPTAG ja DNTAG, mida saab
kasutada iga tüve identifitseerimiseks.
Joonis 13. Start-kuni-stop-koodoni deletsioonide valmistamise põhimõte.
Deletsioonimutantide kollekstiooni on kasutatud geenide leidmiseks, mis on olulised erinevatel kasvutingimustel. Näiteks on uuritud kasvu miinimumsöötmel, kõrge soola ja madala soola kontsentratsioonidel, stressitingimustel, mittefermenteeritaval süsiniku allikal, sporulatsioonisöötmel, jne. Kollektsioon on võimaldanud kindlaks teha pagaripärmi eluks hädavajalikud geenid. Kasutades kasvutingimusena rikast söödet 30 oC juures leiti, et 18,7% geenidest on eluks hädavajalikud. Kollektsiooni on kasutatud ka samas bioloogilises protsessis osalevate geenide iseloomustamiseks. Näiteks uuriti diploidide homosügootset deletsioonimutantide kollektsiooni ja tuvastati sporulatsioonil olulised geenid. Üle-genoomsed uuringud on vajalikud uute ravimimärklaudade otsimiseks. Näiteks kasutati diploidset heterosügootset deletsioonimutantide kollektsiooni, et leida mutante, kelle kasv ravimite teatud kontsentratsioonide juures aeglustub. Võimalik on otsida ka erinevates haigustes olulisi geene. Analüüsitakse bioloogilisi protsesse, mis on konserveerunud pärmis ja inimeses. Näiteks pagaripärmi mitokondriaalse hingamisdefektsete tüvede tuvastamine (kokku 466 tüve) võimaldas kindlaks teha inimese mitokondris funktsioneerivad kandidaatgeenid.
Deletsioonimutantide uurimisel kasutatakse:
- koloonia kasvu hindamist 96-auguga plaadil. Rakkude külvamiseks kasutatakse roboteid. Kasvu analüüsimiseks pildistatakse plaate kindlatel ajapunktidel. Kolooniate kasvu hinnatakse spetsiaalsete pildianalüüsi programmide abil.
- kogu kollektsiooni kasvatamine vedelsöötmes, millele järgneb mirkokiip-analüüs. Kasutatakse kiipe, mis sisaldavad iga ORF-i spetsiifilisi 20 nukleotiidi pikkuse koodi komplementaarseid järjestusi. Mida tugevam on signaal, seda suurem on selle tüve esindatus kultuuris e. seda elujõulisem on see tüvi antud kasvutingimustel.