1. Doosi supressorite analüüs
Doosi supressoriks nimetatakse geeni, mille üleekspressioon pärsib uuritava mutatsiooni fenotüübi avaldumise. Geeni üleekspressioon saavutatakse kasutades kõrge koopia arvuga plasmiidi või ekspressiooni tugeva promootori kontrolli alt. Selliste supressorite isoleerimiseks transformeeritakse uuritavasse mutantsesse tüvesse plasmiidi raamatukogu (joonis 7). Transformatsioonisegu külvatakse koheselt piiravatele ("restrictive") kasvutingimustele. Kolooniaid moodustavad vaid need rakud, kes sisaldavad plasmiidi, millelt ekspresseerub mutantse geeni metsiktüüpi alleel või supressorgeen.
Joonis 7. Doosi supressorite analüüs. Uuritav tüvi (yfg1ts) on temperatuuritundlik, st. ei ole võimeline kasvama 36 oC juures. Nendesse rakkudesse transformeeritakse kõrge koopia arvuga plasmiidi raamatukogu. Transformatsioonisegu külvatakse söötmele, mis selekteerib plasmiidi olemasolu ning tasse kasvatatakse 36 oC juures. Kolooniaid moodustavad vaid need rakud, kes ekspresseerivad uuritava geeni metsiktüüpi alleeli või supressorgeeni.
2. Mutageneesil tekkinud supressorite analüüs
Supressormutatsioonid on mutatsioonid, mis suruvad osaliselt või täielikult maha uuritava mutatsiooni fenotüübilise toime. Selliste supressorite isoleerimiseks viiakse läbi genoomi mutagenees (joonis 8). Isoleeritakse mutandid, kellel on kadunud uuritava mutatsiooni fenotüüp. Supressormutatsioonide kindlaks tegemiseks kloonitakse vastav geen. Juhul kui supressormutatsioonil on talle omane fenotüüp (sõltumatu uuritava mutatsiooni fenotüübist), siis on võimalik vastav geen kloonida komplementatsiooni teel. Juhul kui on tegemist retsessiivse supressormutatsiooniga, siis on võimalik geen kindlaks teha supressiooni kadumist jälgides.
Joonis 8. Mutageneesil tekkinud supressorite analüüs. Uuritav tüvi (yfg1ts) on temperatuuritundlik, st. ei kasva temperatuuril 36 oC. Viiakse läbi genoomi mutagenees ja isoleeritakse kolooniad, kes on võimelised kasvama kõrgemal temperatuuril. Supressormutatsioonide kindlaks tegemiseks on mitu võimalust. Supressormutatsioon võib põhjustada talle iseloomuliku fenotüübi avaldumise. Üheks selliseks näiteks on külmatundlikus (sup1cs). Iseloomuliku fenotüübi olemasolu võimaldab supressormutatsiooni sisaldavat geeni kloonida komplementatsiooni teel. Juhul kui retsessiivsel supressormutatsioonil ei ole talle iseloomulikku fenotüüpi, siis kloonitakse vastav geen otsides supressiooni kadumist. Supressormutatsiooniga uuritavasse tüvesse (yfg1ts sup1) transformeeritakse plasmiidne raamatukogu. Transformandid selekteeritakse temperatuuril 25oC. Seejärel sõelutakse välja kolooniad, kes ei ole võimelised kasvama 36oC juures. Nendes rakkudes ekspresseerub supressiooni põhjustanud mutantse geeni metsiktüüpi alleel.
