S. pombe rakkude sünkroniseerimine
Schizosaccharomyces pombe rakukultuuri sünkroniseerimiseks saab kasutada kahte erinevat meetodit:
- tõkestamise-vabastamise ("block and release") meetod
- selektsiooni meetod
Tõkestamise-vabastamise meetod põhineb rakkude seiskamisel kindlas rakutsükli faasis. Kasutatakse toitainete nälga, mürkidega/ravimitega mõjutamist, temperatuuritundlike cdc ("cell division cycle") rakutsükli mutante, jne. Rakkude vabastamisel mõjutajast nad jagunevad sünkroonselt.
Kõige enam kasutatakse rakkude seiskamiseks G1 faasis cdc10 mutanti, S faasis hüroksüuureat, G2 faasis cdc25 mutanti ja M faasis nuc2 mutanti. Temperatuuritundlike mutantide kasutamisel kasvatatakse rakud üles lubatud ("permissive") temperatuuril (tavaliselt 25 oC). Rakkude peatamiseks kindlas rakutsükli faasis tõstetakse kasvutemperatuuri umbes 4 tunniks 35 oC-ni. Temperatuuri alandamisel lubatud temperatuurile (25 oC) blokeering kaob ning rakud läbivad rakutsükli sünkroonselt. Hüdroksüuurea lisamine rakukultuurile inhibeerib ribonukleotiidi reduktaasi. Selle kemikaali mõjul tekib rakkudes desoksüribonukleotiidide puudus, mis põhjustab DNA kaksikahelalisi katkeid replikatsioonikahvli läheduses ning rakud peatuvad S faasis. Rakke on võimalik sünkroniseerida ka G1 faasis kasutades lämmastikuallika nälga.
Tõkestamise-vabastamise meetodi eelised on:
- saavutatakse rakkude kõrge sünkroniseeritus (70-80%)
- sünkroniseerida saab korraga palju rakke
- võimalik on sünkroniseerida mitu kultuuri samaaegselt
Tõkestamise-vabastamise meetodi puudused on:
- S. pombe rakud jätkavad kasvamist samal ajal kui toimub rakkude seiskamine kindlas rakutsükli faasis. Seepärast on pärast mitootilist jagunemist toimuv G2 faas märgatavalt lühem kui mittesünkroonselt kasvavatel rakkudel.
- Rakkude sünkroniseerimine lämmastikuallika nälga kasutades ei ole väga efektiivne.
Selektsiooni meetodit kasutatakse samas rakutsükli faasis olevate rakkude eraldamiseks rakupopulatsioonist. Kasutatakse tsentrifugaalset elutreerimist või laktoosi gradiendi abil sünkroniseerimist. Mõlemal juhul eraldatakse väikesed, G2 faasis olevad rakud.
Rakkude elutreerimisel eraldatakse rakud suuruse järgi kasutades spetsiifilist rootorit. Rakukultuur pumbatakse keerlevasse tsentrifuugi kambrisse. Rakkudele mõjuvad kaks jõudu: tsentrifugaaljõud ja vastassuunaline pealepumbatava söötme jõud. Rakud liiguvad kambris nii, et mõlemad jõud oleks tasakaalus. Selle tulemusena tekib rakkude gradient nende suuruse järgi. Väikesed rakud (G2 faasi rakud), kes on kõige aeglasemalt sedimenteeruvad rakud, jäävad kambris ülespoole. Need rakud kogutakse ning saadakse sünkroonselt jagunev kultuur. Laktoosi gradiendi abil sünkroniseerimisel kantakse kontsentreeritud rakukultuur laktoosi gradiendile ning tsentrifuugitakse madalal kiirusel (näiteks 500g). Selle tulemusena jäävad väikesed rakud pinnale. Rakud kogutakse, pestakse söötmega ning saadakse rakukultuur, mis jaguneb sünkroonselt.
Selektsiooni meetodi eelised on:
- ei mõjutata kasvavate rakkude rakutsüklit
- on võimalik eraldada terved rakud defektsetest, aeglasemalt jagunevatest või rakutsüklis peatunud rakkudest
Selektsiooni meetodi puudused on:
- rakkude sünkroniseerituse tase on 30-40%
- ei saa kasutada mutantseid tüvesid, kes on heterogeense fenotüübiga või elongeerunud raku morfoloogiaga
- saab töötada vaid ühe rakukultuuriga
- rakkude hulk, mis eraldatakse on limiteeritud