Pärmi kaksikhübriidi meetod
Pärmi kaksikhübriidi meetod võimaldab kindlaks teha valk-valk interaktsioone kasutades kahte hübriidvalku, mis interakteerudes taastavad aktiivse transkriptsioonifaktori. Oletatakse, et ligi 50% teadaolevatest valk-valk interaktsioonidest on leitud just pärmi kaksikhübriidi meetodit kasutades.
Pärmi kaksikhübriidi meetodi kirjeldasid Fields ja Song 1989. aastal. Meetod põhuneb fenomenil, et transkriptsioonifaktorid koosnevad kahest eraldi seisvast domeenist - DNA-ga seondumise domeenist (BD) ja transkriptsiooni aktivatsioonidomeenist (AD). Klassikaline pärmi kaksikhübriidi põhimõte on toodud joonisel 12.
Joonis 12. Klassikaline pärmi kaksikhübriidi meetod. Uuritavad valgud ekspresseeritakse liitvalkudena (koos Gal4 BD või AD-ga). Interaktsiooni määramiseks kasutatakse reportergeeni, mille promootoris paikneb UASG element. Kui valgud (siin A ja B) ei interakteeru omavahel, siis reportergeen ei ekpresseeru. Kui valgud (siin A ja C) interkateeruvad, siis moodustuv aktiivne transkriptsioonifaktor aktiveerib reportergeeni transkriptsiooni.
Valkude interaktsiooni kindlaks tegemiseks saab kasutada ka pärmide ristamist. Valk A ekspresseeritakse pärmis, mille paardumistüüp on MATa, kui hübriidvalk koos DNA-seostumise domeeniga (A-BD). Valk C ekspresseeritakse pärmis, mille paardumistüüp on MAT
, hübriidvalguna koos transkriptsiooni aktiveeriva domeeniga (C-AD). Kaks pärmi ristatakse ning eraldatakse diploid, mis sisaldab mõlemaid valke ekspresseerivaid plasmiide. Juhul kui valk A-BD ja C-AD interakteeruvad omavahel, moodustub aktiivne transkriptsioonifaktor, mis aktiveerib reportergeeni ekspressiooni (näit. HIS3) ning võimaldab sellistel rakkudel kasvada selektiivsöötmel (näit. histidiini mittesisaldaval söötmel). Valk-valk interaktsioon peab seega aset leidma rakutuumas. Juhul kui uuritavad valgud ei paikne tuumas, siis ekspresseeritakse nad koos tuumalokalisatsioonisignaaliga. Pärmi kaksikhübriidi meetod võimaldab uurida kõiki valk-valk interaktsioone sõltumata nende valkude funktsioonist.
, hübriidvalguna koos transkriptsiooni aktiveeriva domeeniga (C-AD). Kaks pärmi ristatakse ning eraldatakse diploid, mis sisaldab mõlemaid valke ekspresseerivaid plasmiide. Juhul kui valk A-BD ja C-AD interakteeruvad omavahel, moodustub aktiivne transkriptsioonifaktor, mis aktiveerib reportergeeni ekspressiooni (näit. HIS3) ning võimaldab sellistel rakkudel kasvada selektiivsöötmel (näit. histidiini mittesisaldaval söötmel). Valk-valk interaktsioon peab seega aset leidma rakutuumas. Juhul kui uuritavad valgud ei paikne tuumas, siis ekspresseeritakse nad koos tuumalokalisatsioonisignaaliga. Pärmi kaksikhübriidi meetod võimaldab uurida kõiki valk-valk interaktsioone sõltumata nende valkude funktsioonist.
Pärmi kaksikhübriidi meetodit kasutatakse:
- valk-valk vaheliste interaktsioonide uurimiseks
- kahe valgu vahelises interaktsioonis vajalike domeenide või vajalike aminohapete kindlaks tegemisel
- uuritava valguga interakteeruvate valkude kindlaks tegemisel (raamatukogude sõelumised e."screening")