ISSN 0494-7304 0207-4508 TARTU ÜLIKOOLI TDTMFTTSFD УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ACTA ET COMMENTATIONES UNI VERSITATIS TARTUENSIS 870 ИЗУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕКТИНОВ Том 2 ЛЕКТИНЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ Труды по химии TARTU Illil 1989 T A R T U Ü L I K O O L I T O I M E T I S E D УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ACTA ET COMMENTATIONES UNIVERSITATIS TARTUENSIS Alustatud 1893.a. VIHIK 870 ВЫПУСК Основаны в 1893 г. ИЗУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕКТИНОВ Том 2 ЛЕКТИНЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ Труды по химии TARTU ÜUKOOL ТАРТУ 19 8 9 Редакционная коллегия: Т.Илометс, К.Кизанд, Т.Пюсса, Р.Уйбо /отв.редактор/ В выпуске опубликуются материалы I республиканской конференции посвещенной 100-летию открытия первых лектинов / г.Тарту и г.Таллинн, 31 мая - 2 июня 1988 г./ Библиография: Уч. зал. Тарт. ун-та. - 1989. - Вып.870 - С. Tartu Ülikeo'i Raamatukogu То£ьь~~ Ученые записки Тартуского университета. Выпуск 870. ИЗУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕКТИНОВ. Том 2. Лектины в биологии и медицине. На русском языке. Тартуский университет. ЭССР, 202400, г.Тарту, ул.Юликооли, 18. Ответственные редакторы К. Кизанд, Р. Уйбо. Корректор И. Кинге. Подписано к печати 19.09.1989. MB 0I6I3. Формат 60x90/16, Бумага писчая. Машинопись. Ротапринт. Учетно-издательских листов 13,62. Печатных листов 1Ь,0+1 вк. Тира* 700. Заказ # 676. Цена 2 руб. 70 коп. Типо^афия ТУ, ЭССР, 202400, г.Тарту, ул.ТиИги, 78. b - 4 Тартуский университет 1969 П.Г. Стильмарк около 1900 г. Фотография сделана в Пярну (Зстония), где он работал врачом в 1895-1923 гг. П.Г. Стильмарк (22.07.1860-23.06.1923) МО ЛЕНИНЫ ВО ВЗАИЮОТНЭШЕНИЯХ РАСТЕНИЙ И ПАТОГЕННЫХ ШКР00РГАНИЗЮВ Н.В. Любимова, Е.Г. Салькова Институт биохимии им. А.Н. Баха АН СССР, г. Москва Проблема межклеточного узнавания растениями патогенных микроорганизмов на уровне рецептор-лигандного взаимодейст­ вия и включения генетического механизма устойчивости расте­ ний к инфекционным болезням является центральной проблемой фитоиммунитета. Однако до настоящего времени не ясна приро­ да рецепторов и лигандов, обеспечивапцих процесс межклеточ­ ного узнавания партнеров, пути образования и транспорта че­ рез цитоплазматическую мембрану растительной клетки сигна­ льных молекул, экспрессирующих гены хозяина, ответственные за защитные реакции. Способность лектинов "распознавать" тонкие различия в структуре углеводов клеточной стенки микроорганизмов послу­ жила отправной точкой для предположения относительно их участия в межклеточном узнавании при инфицировании растений патогенными микроорганизмами /6/. Удобной моделью для изучения механизмов межклеточного узнавания и индуцирования защитных реакций хозяина является система клубни картофеля Solanum tuberosum L. - возбудитель фитофтороза, гриб Phytophthora Inf es tans (Mont.) de By. Для этого гриба характерно наличие специализированных рас, спо­ собных поражать одни сорта картофеля (совместимость) и не поражать другие (несовместимость) /3/. Из клубней картофеля выделен водорастворимый лектин (ЛКЮ, состав и структура которого хорошо изучены /II, 13/. Он представляет собой гидроксипролинбогатый высокогликози- лированный (на 50 %) гликопротеин, представленный в расте­ нии мономер-димерной системой с мол. массой мономера 50 кД. Углеводный компонент молекулы содержит арабинозу (9If), га­ 3 лактозу (5 %), глюкозу (3 %), глюкозамин (I %) и другие са­ хара в меньшем количестве. Аминокислотный состав представ­ лен гидроксипролином (42 %), лизином (16 %), серином (9 %), пролином (9 и другими аминокислотами в меньшем количест­ ве. Гликозилированная часть молекулы лектина представляет собой пептидную цепь, связанную через остатки гидроксипро- лина с у?-арабанофуранозидами и через остатки серина с Л- галактопиранозидами. Лектиновая активность молекулы опреде­ ляется ее негликозилированной частью, осуществляется через остатки триптофана и тирозина, имеет два центра связывания углеводов. Лектиновая активность соединения специфически блокируется олигомерами N-ацетил-Д-глюкозамина,с длиной це­ пи 2-5 остатков, соединенных по J-1,4 связям. Однако трудно себе представить, как водорастворимое со­ единение может обеспечить рецептор-лигандное взаимодействие, осуществляющее прочный межклеточный контакт. Более логично предположить, что подобную функцию выполняет какой-то стру- ктурносвязанный, а точнее - мембраносвязанный компонент рас­ тительной клетки. И действительно, в последнее время во фракции клеточных стенок и препарате плазмалеммы, выделен­ ных из клубней картофеля, обнаружено присутствие экстензи- на, во многом сходного с ЛКК /8, 19/. Экстензин также пред­ ставляет собой гидроксипролинбогатый высокогликозилирован- ный гликопротеин, обладающий гемагглютинирупцей способнос­ тью, специфичной по N-ацетил-Д-глюкозамину. Возможно экс­ тензин "сшивает" плазмалемму с клеточной стенкой /4/. 20 % лектинов картофеля составляет ЛКК и 80 % - экстензин. Пред­ полагается, что водорастворимый ЛКК является предшественни­ ком структурносвязанного экстензина /9/. Установлено, что в растениях в ответ на инфицирование патогенными микроорганиз­ мами увеличивается содержание гидроксипролинбогатого глико- протеина /12/. Вышеизложенное дает основание полагать, что экстензин (или его изоформы) может участвовать в создании межклеточ­ ного контакта при инфицировании картофеля возбудителем фи- тофтороза, который, в свою очередь, необходим для включения защитных реакций хозяина. Однако прямых доказательств тако­ го предположения пока не имеется. 4 На участие фитолектинов в формировании взаимоотношений картофеля и возбудителя фитофтороза указывают результаты модельных опытов с использованием ЛКК /I/. Лектин агглюти­ нировал проросшие цистоспоры как совместимой, так и несов­ местимой рас патогена. Флуоресцеинмеченый лектин связывался с поверхностью гиф обеих рас гриба. Гаптен лектина подавлял как реакцию агглютинации, так и связывание меченого лектина с микроорганизмом. Кинофотомикрографическое наблюдение за инфицированием клубней картофеля возбудителем фитофтороза свидетельствует о том, что in vivo инфекционные гифы гри­ ба как совместимой, так и несовместимой рас с одинаковой скоростью разрушали стенку растительной клетки и прочно свя­ зывались с ее плазмалеммой. Анализ инфицированной ткани, а также суспензии проросших цистоспор гриба с грубой микросо- мальной фракцией гомогената тканей клубней показал, что га­ птен лектина резко снижал степень связывания плазмалеммы картофеля с поверхностью патогена. Из целого ряда соедине­ ний (пентозы, гексозы, дисахариды, метилсахариды, аминоса- хара, ламинаран^ только специфический гаптен картофельного лектина ингибировал развитие защитной реакции сверхчувстви­ тельности картофеля в ответ на инфицирование несовместимой расой возбудителя фитофтороза. Можно предположить, что при­ чиной такого действия гаптена является предотвращение меж­ клеточного узнавания партнеров на уровне лектин-углеводного взаимодействия при контакте растительной плазмалеммы с по­ верхностью инфекционной гифы гриба. Наши исследования сконцентрированы на изучении взаимо­ действия препаратов изолированной плазмалеммы клубней кар­ тофеля с компонентами клеточной поверхности мицелия возбу­ дителя фитофтороза; роли фитолектина в межклеточном распоз­ навании партнеров и игщуцировании устойчивости хозяина к па­ тогену; структурно-функциональной перестройки растительной плазмалеммы как фактора,определяющего переход клетки из да­ тивного состояния восприимчивости (неактивная клетка) в со­ стояние потенциальной устойчивости, сверхчувствительности в распознавании метаболитов патогена (активированная клетка) /2/. Установлено, что плазмалемма картофеля обладает лекти- 5 новой активностью, специфически подавляемой гаптеном карто­ фельного лектина. В составе компонентов клеточной поверх­ ности мицелия возбудителя фитофтороза выявлено наличие гли- копептида, содержащего остатки глюкозамина и глюкана, пред­ положительно аналогичного по структуре и функциям известным супрессорам этого патогена, подавляющим защитные реакции растения. йлазмалемма картофеля связывала как гликопептиды, так и глюканы гриба; при этом гликопептиды подавляли лекти- новую активность плазмалеммы, а глюканы на таковую не влия­ ли. Согласно литературным данным /10/,интактные клетки клу­ бней картофеля не способны к быстрой защитной реакции (ре­ акции сверхчувствительности) в ответ на инфицирование воз­ будителем фитофтороза. Контакт с несовместимой расой пато­ гена или раневой стресс (нарезание клубней на диски и вы­ держивание последних при комнатной температуре в течение нескольких часов) индуцировали в ткани состояние потенциа­ льной устойчивости. Как показали наши исследования, метабо­ литы патогена или раневой стресс вызывали значительное из­ менение структурных и функциональных свойств плазмалеммы картофеля: повышение проницаемости мембран, активацию син­ теза плазмалемных белков,увеличение активности мембраносвя- занных катион-зависимых АТФаз, повышение "текучести" липид- ного компонента мембраны и ненасыщенности жирных кислот, многократную активацию гемагглютинирующей способности плаз­ малемных везикул /2/. Такая "активированная" раневым стрес­ сом плазмалемма связывала большое количество гликоконьюга- тов клеточной поверхности патогена и была более чувстви­ тельна в распознавании метаболитов разных рас гриба, чем нативная /2/. На основании полученных данных и анализа литературы, предполагается следущая гипотетическая схема взаимоотноше­ ний картофеля и возбудителя фитофтороза /I/. Очевидно, что межклеточное распознавание растения и патогена осуществля­ ется на уровне контакта мембраносвязанных компонентов рас­ тительной клетки с клеточно-поверхностными метаболитами ин­ фекционной гифы патогена. Такой контакт осуществляется по­ средством лектин-углеводного взаимодействия. Следует отме­ 6 тить, что мембраносвязанный фитолектин может выполнять ре- цепторную функцию при распознавании растением широкого на­ бора патогенов, поскольку способен взаимодействовать со спе­ цифической углеводной группой, включенной в состав различ­ ных макромолекул, локализованных на клеточной поверхности различных патогенов. Имеются сведения об участии лектина картофеля в узнавании хозяином грибов /I/, бактерий /18/, вирусов /5/. Тесный межклеточный контакт партнеров инициирует вклю­ чение неспецифического внутриклеточного механизма устойчи­ вости растения к инфекционным заболеваниям.По-видимому,кон­ такт необходим для ферментативного образования сигнальных молекул - олигосахаринов, из клеточных стенок хозяина или патогена. Под олигосахаринами подразумеваются фрагменты ß - глюканов, хитина и хитозана, олигогалактурониды, состоящие из 2-10 углеводных единиц со строгой пространственной кон­ фигурацией, способные экспрессировать гены растительной кле­ тки, ответственные за защитные реакции хозяина /15, 7/. Не исключено, что лектины, обладая хитиназной активностью /17/, могут непосредственно участвовать в образовании сигнальных молекул. В литературе обсуждается также возможность участия лектин-углеводного взаимодействия в образовании трансмемб­ ранных каналов, обеспечивающих транспорт углеводов внутрь клетки /16/. Это, в свою очередь, указывает на возможность медиирования лектинами трансмембранного переноса сигнальных молекул. Такая полифункциональность характерна для лектинов, однако механизм ее мало изучен. Экспрессия генов растительной клетки олигосахаринами проявляется в активации многочисленных защитных реакций рас­ тения: накоплении гидроксипролинбогатого гликопротеина и этилена, активации хитиназ и ^-глюконаз, синтезе ингибито­ ра протеиназ, образовании некроза и накоплении в нем фито- алексинов, лигнификации ткани /15/. Важное место в реакции растительной клетки на контакт с метаболитами патогена за­ нимает структурная и функциональная перестройка ее плазма­ леммы. Направленная активация мембранных процессов, по-ви­ димому, определяет повышение чувствительности растительной клетки к действию метаболитов патогена и быструю "сверхчув­ 7 ствительную" ее гибель под влиянием токсических для хозяина CgQ полиеновых жирных кислот гриба: арахидоновой и эйкозо- пентаеновой /14/. В некротизированной ткани через несколько часов погибает патоген, очевидно, под действием накапливаю­ щихся фитоалексинов. Так блокируется распространение инфек­ ции в растении; растение проявляет устойчивость к инфекци­ онному заболеванию. В восприимчивой комбинации при поражении картофеля фи- тофторозом также имеет место лектин-yrлеводное взаимодейст­ вие при межклеточном контакте партнеров. Однако это не при­ водит к "активации" клетки хозяина. По-видимому, супрессоры совместимой расы гриба, комплементарные данному сорту рас­ тения, подавляют "активацию" клетки, возможно, вследствие ингибирования синтеза белка de novo ."Неактивированная" рас­ тительная клетка остается малочувствительной к токсическим метаболитам гриба, медленно погибает при инфицировании па­ тогеном, в ней медленно и в меньших количествах накаплива­ ются фитоалексины. Гибель гриба в ткани замедлена,и его ги­ фы успевают проникнуть в соседние клетки, распространяются все дальше и дальше. Так проявляется восприимчивость расте­ ния к патогену. Л и т е р а т у р а 1. Любимова Н.В., Салькова E.V.// Приклад, биохимия и микробиол., 1988. - Т. 24. 2. Любимова Н.В., Шувалова Е.П., Лахтин В.М., и др. // Материалы конференции "Изучение и применение лектинов". - Таллинн, 31 иая-2 июня, 1988. 3. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Фитоалексины. - М.: Наука, 1973. - 175 с. 4. Семенов И.Л., Выскребенцева Э.И., Алексидзе Г.Я. // Структура и функции биологических мембран растений. - Но­ восибирск: Наука, 1985. - С. 47-54. 5. Adam G., Heegard Р., Bog-Hansen Т.О. // J. Virologi- cal Methods. - 198?. - Vol. 17. - Р- 263-275. 6. Alberahe Lm P., Anderson—Proufcy A.J. // Ann.Rev.Plant Physiol. - 1975• — Vol. 26. — P. 31—52. 8 7. AIbersheim P., Darvtll A.G. // Scientific American, 1985. - Vol. 253. - IT 3. - P. 58-64. 8. Casalongue C., Lezica R.P. // Plant Cell Physiol. - 1985. - Vol. 26. - N 8. - P. 1533-1539. 9. Driesache E., Beeckmans S., Dejaegere R. et al. // Lectins IV (Ed. T.C. Bog-Hansen). - Berlin: Walter de Gruy- ter, 1985. - P. 567-582. 10. Furuichi N., Tomiyama K., Doke N. // Phytopathol. - 1979. - Vol. 69. - N 7. - P. 734-736. 11. Hobst G.-J., Martin S.B., Allen A.K. et al. // Bio- chem. J. - 1986. - Vol. 233. - N 4. - P. 731-736. 12. Mazau D., Eaquerre-Tugaye M.T. // Physiol. Molecul. Plant Pathology. - 1986. - Vol. 29. - N 2. - P. 147-157. 13. Matsumoto I., Jimbo A., Mizuno Y. et al. // J. Biol. Chem. - 197З. - Vol. 258. - N 5. - P. 2886-2892. 14. Preisig C.L., Kuc G. // Archives of Biochem. and Bio­ physics. - 1985. - N 1. - P. 379-389. 15. Вуan O.A. // Ann. Bev. Cell Biol. - 1987. - Vol. 3.- P. 295-317. 16. Sandhu B.S., Been R.S. // Lectins (Ed. T.C. Bog-Han­ sen). - Berlin: Walter de Gruyter, 1982. - P. 113-136. 17. Schlumbaum A., Mauch F., Vogell U. et al. // Nature. - 1986. - Vol. 324. - N 6095. - P. 365-367. 18. Sequeira L. // The cell surface in plant growth and development (Ed. K. Boberts) J. Cell Sei. Suppi. - 1985. Vol. 2. - P. 301-316. 19. Wilson L.G., Fry J.C. // Plant Cell Environment. - 1986. - Vol. 9. - N 4. - P. 239-260. 9 2 ЛЕКТИНЫ В ИССЛЕДОВАНИИ СТРУКТУРЫ УГЛЕВОДНЫХ ЦЕПЕЙ ГЛИЮПРОТЕИНЭВ М.Д. Луцик, С.И. Кусень Институт биохимии им. A.B. Палладина АН УССР, Львовское отделение Одним из наиболее перспективных направлений использова­ ния лектинов является применение их в исследовании структуры углеводных цепей гликололимеров. Методология основана на из­ бирательном связывании лектина с соответствующей углеводной детерминантов олигосахаридной цепи полимера и практически не отличается от иммунохимического подхода. Отсюда одно из важ­ ных достоинств метода - высокая чувствительность, характер­ ная для иммунологических методов и недостижимая или трудно­ достижимая для существующих физико-химических методов иссле­ дования структуры гдикополимепов. Ниже рассмотрены вопросы структуры гликопротеинов. на которые могут быть получены от­ веты при использовании лектинов в качестве структурных зон­ дов. Идентификация гликопротеиновых фракций после разделения белковых смесей методом электрофореза в гелях - задача, чае­ те встречающаяся в биологических исследованиях. Обычно для выявления углеводов применяется метод окраски Шифф-Яодной кислотой (ШИК) либо альциановым голубым /6, 7/. Предложен также метод дифференциального маркирования сиаловых кислот или галактозы гликопротеинов тритием с последующей радиоау- тографией /3/. Применение лектинов позволяет эффективно решить эту за­ дачу, при этом чувствительность метода намного превосходит ШИК-реакцию, а по сравнению с радионуклидным методом он ме­ нее трудоемок и занимает меньше времени. Применяемый нами способ состоит в получении реплики фореграммы на нитропеллю- лозном листке с последующей обработкой различными лектинами, маркированными флуоресцентной или яероксидазной меткой. Ми­ нимальный набор лектинов для выявления гликопротеинов состо­ ит из хоиканавалина А, лектина фасоли и арахиса. При возмож­ ности его можно расширить за счет лектинов чечевицы,клещеви­ ны, пшеницы, сои, улитки, бобовника, софоры. Полное описание 10 метода приведено в опубликованной работе /2/. Важным достоинством способа идентификации гликопротеи­ нов по связыванию лектинов является значительное расшире­ ние информации о количестве гликопротеиновых фракций. Ок­ раска с помощью ШИК-реакции позволяет выявить только те фракции, которые содержат много углеводов, - либо за счет высокого относительного содержания Сахаров, либо вследст­ вие высокого содержания этой фракции в анализируемой про­ бе. С помощью лектинов можно выявить значительно большее число гликопротеиновых фракций, так как благодаря высокой чувствительности ферментативной метки они позволяют обна­ руживать минимальные количества гликопротеина. Например, в оритроцитарных мембранах человека фракции ШИК-1, 1а, 2, 3 представлены гликопротеинами муцинового типа, содержащими О-гликозильные цепи. Они же выявляются и с помощью связы­ вания лектина арахиса после десиалирования. С помощью лек­ тинов фасоли и чечевицы выявляются фракции гликопротеинов, содержащие N-гликозильные цепи (белок зоны 3 и в области зон 4.1-4.5), которые при окраске ШИК не видны. Особенно ценен метод при анализе гликопротеинов кле­ точной мембраны, где он позволяет наблюдать весьма слож­ ный спектр гликопротеинов; при окраске ШИК спектр намного проще вследствие низкой чувствительности реакции. По связыванию набора лектинов с гликопротеином можно определить, какого типа углеводные цепи (0- или N-глико- зильные) входят в их состав, а при наличии обоих типов це­ пей примерно оценить их соотношение. Анализу поддаются как чистые гликопротеины, так и отдельные фракции гликопротеи­ нов сложной смеси после разделения ее методом электрофоре­ за и получения нитроцеллюлозной реплики. Нами установлено, что селективным реагентом на 0-гли- козильные цепи является лектин арахиса, который связывает­ ся с О-гликанами после предварительного десиалирования их мягким кислотным гидролизом. Избирательностью к 0-глико- зильным цепям обладает также лектин хлебного дерева, одна­ ко, она несколько ниже, чем у арахиса. В отличие от лекти­ на арахиса, наличие сиаловой кислоты в олигосахариде не блокирует взаимодействия с лектином хлебного дерева, поэ­ II 2* тому последний перспективен для разделения 0- и и-гликанов методом аффинной хроматографии. Для окончательных выводов относительно избирательности лектина хлебного дерева требу­ ется больше данных о взаимодействии его с различными моде­ льными гликопротеинами и сахарами. Связывание соевого агглютинина с гликопротеинами напо­ минает таковое для лектина арахиса, однако агглютинин сои более избирателен к углеводам и выявляет только некоторые РггА^фракции мембран эритроцитов человека. N-гликаны могут быть выявлены по связыванию конканава- лина А, лектина чечевицы, клещевины и фасоли. Судить о на­ личии Ы-гликанов по связыванию одного из указанных лекти­ нов, в частности Кон А, рискованно, так как связывание лек­ тинов этого типа зависит от степени ветвления н-гликозиль- ной цепи. Известно, что Кон А взаимодействует с двухантен- ными цепями, в то время как 3- и 4-антенные цепи практичес­ ки с Кон А и лектином чечевицы не взаимодействуют. Лектин клещевины недостаточно селективен к N-гликанам, так как он специфичен к дисахаридной детерминанте N-ацетилла ктозамина, которая может быть и в составе 0-гликанов. Лектин фасоли (эритроагглютинин) избирателен к н-гликозильным цепям, од­ нако сродство и селективность его к 2-, 3- и 4-антенным це­ пям изучена недостаточно. Вместе с тем, анализ взаимодейст­ вия перечисленных, а также других лектинов,с гликопротеина­ ми содержит возможность более подробной структурной харак­ теристики Ы-гликозильных цепей, однако для реализации этой возможности необходимо уточнить взаимодействие препаратов с углеводными детерминантами. С помощью лектинов можно оценить количество углеводных цепей 0- или н-типа в молекуле гликопротеина.Для этого на­ ми разрабатывается метод анализа кинетики связывания лекти­ на с известным количеством гликопротеина, иммобилизован­ ного на нитроцеллюлозной мембране. Способ оценки количества связанного лектина зависит от характера метки и может быть флуорометрическим, радиометрическим или каким-либо другим. По анализу кинетической кривой связывания можно определить количество мест связывания (т.е. количество углеводных це­ пей) на I моль гликопротеина. В качестве иллюстрации приво­ 12 дим данные о количестве углеводных цепей тиреоглобулина,оп­ ределенных по связыванию флуоресцирующих лектинов (таблица I). Достоинством метода является его недеструктивный харак­ тер, а также высокая чувствительность. На наш взгляд, он представляет интерес и заслуживает дальнейшей разработки и усовершенствования. Т а б л и ц а I Характеристики связывания лектинов с тиреоглобулином человека Сокращенное обозначе- Количество связыва- К связывания ние лектина емого лектина, А/„ Тл7 uу моль/моль ' ^ Con А 10,1 0,9 LCL 5,2 2,6 RCA 12,2 1,1 НА 9,5 4,5 WGA 9,3 21,0 Мол. масса тиреоглобулина 670 кДа,количество углеводных це­ пей типа А равно 9,количество цепей Б - 14 на молекулу /9/. Наличие характерных или специфичных для изучаемого гли­ копротеина углеводных детерминант может быть выявлено с по­ мощью набора лектинов. Ниже приведен список известных в на­ стоящее время специфичных лектинов и узнаваемых ими угле­ водных детерминант (таблица 2). Т а б л и ц а 2 Лектины, специфичные к характерным углеводным детерминантам Лектин Структура углеводной детерминанты I 2 Агглютинин виноградной GalMAc^I—R, антиген Форсмана, улитки антиген А Агглютинин тетрагоно- L-FUCAI—2Galßl—4GlcNA с- лобуса пурпурного антиген Н типа П Агглютинин утесника Антиген Н типа I европейского, тип I 13 Продолжение таблицы 2 I 2 Агглютинин гриффонии Антиген Leb обыкновеннолистноЙ, тип 1У Лектин бобовника ана- L-Fuc/VL—R гиролистного Агглютинин алеуры L-FuCj^I—6GlcNAc оранжевой Лектин икры вьюна Антиген В Лектин мечехвоста NeuItAc 2—В Анализ структуры гликопептидов и олигосахаридов с по­ мощью лектинов разработан слабо и находится практически в зачаточном состоянии, однако открывающиеся возможности пред­ ставляют несомненный интерес. Они обсуждаются ниже, вопросы же отщепления олигосахаридов, их разделения и получения ин­ дивидуальных цепей здесь не обсуждаются. Анализ взаимодействия олигосахарида с лектинами можно проводить либо аффинной техникой путем определения адсорб­ ции сахара на иммобилизованном лектине, либо определяя ин- гибиторную активность углевода в реакциях гемагглютинации, преципитации или коагуляции гликополимера, вызываемых лек- тином. Анализ структуры углеводных цепей зависит от типа связи с белком. В О-гликозильных цепях возможно оценить сте­ пень их разветвления, для чего необходимо определить соот­ ношение минимальных угнетающих концентраций (ИК) десиалиро- ваиного углевода относительно лектинов клещевины и арахиса. В случае неразветвленной цепи, представляющей собой дисаха- рид Galji—JGaLNAc, соотношение ИК RCA/tot PNA будет намно­ го выше, чем у разветвленной цепи. В последней содержится дополнительно один или большее число остатков н-ацетиллак- тозамина, который будет способствовать взаимодействию с RCA и угнетать связывание с РпА. При расщеплении по Смиту /5/ неразветвленная цепь рас­ падается после предварительного десиалирования до продук­ тов, не взаимодействующих с FttA и другими лектинами.Продук­ 14 ты деградации десиалированной разветвленной цепи содержат нередуцирующие остатки ü-ацетилглюкоэамина,поэтому они бу­ дут взаимодействовать с агглютинином пшеницы и, возможно, с конканавалином А и его аналогами. Следует заметить, что из­ вестные О-гликозильные цепи мембранных гликопротеинов имеют небольшую степень разветвленности, тогда как углеводные ком­ поненты секретируемых муцинов имеют в своем составе очень сложные высокомолекулярные структуры /I, 5/. Исследование N-гликанов в первую очередь включает оп­ ределение степени ветвления цепи (2-, 3-, 4-антенные цепи). Взаимодействие олигосахарида с высоким сродством с Кон А, лектинами чечевицы, гороха указывает на 2-антенную структу­ ру. При расщеплении по Смиту 3 4-антенные цепи дают про­ дукты, азаимодействуюцие с агглютинином пшеницы из-за нали­ чия нередуцирущих остатков N-ацетилглюкозамина /5/. Диф­ ференцирование 3- и 4-антенных цепей с помощью лектинов в настоящее время невозможно вследствие отсутствия препаратов с необходимой специфичностью. Вполне возможно, однако, что такие лектины существуют, и целенаправленный поиск их важен и необходим. Исследование групповых детерминант, особенно в составе 0-гликанов, проводится с помощью лектинов, приведенных в таблице 2. Особый интерес представляют остатки фукозы, ко­ торые обуславливают целый ряд специфичностей - Н, Lea, Leb, Lex, LeJ'. К сожалению, лектины не перекрывают всех назван­ ных специфичностей, поэтому наряду с ними желательно испо­ льзовать специфические анти-Н и анти-Le сыворотки. В заключение считаем необходимым обратить внимание на то, что для правильной интерпретации результатов, получен­ ных с помощью лектинов, необходимо хорошо знать их тонкую углеводную специфичность. К сожалению, на сегодня только небольшое количество лектинов охарактеризовано достаточно подробно /4, 8/. Трудность подобных исследований состоит в недоступности сложных олигосахаридов известной структуры, используемых в качестве гаптенов. Как альтернативу мы пред­ лагаем изучать взаимодействие лектинов со стандартными гли­ копротеинами, для которых структура углеводных цепей уста­ новлена (тиреоглобулин, фетуин, трансферрин, орозомукоид, 15 овомукоид, гликофорин А, муцины с известной серологической специфичностью и т.п.). Это не заменяет информации, полу­ чаемой с помощью олигосахаридных гаптенов, однако позволя­ ет сориентироваться в специфичности того или иного лектина и определить его избирательность к типу углеводных цепей. На основании изложенных данных можно сделать вывод,что лектины представляют собой весьма ценные реагенты в иссле­ довании структуры углеводных цепей гликопротеинов. Л и т е р а т у р а 1. Деревицкая В.А. Некоторые проблемы химии гликопроте­ инов// Прогресс химии углеводов. - М.: Наука, 1985. - С. 97 -126. 2. Луцик М.Д., Кусень С. И. // Укр. биохим. журн. -1987. - 59. - W 6. - С. 3-9. 3. F akud а М., Б1a kud а М. Cell surface glycoproteins and carbohydrate antigens in development and differentiation of human erythroid cells // The Biology of Glyсоргоteins.-New- York-London: Plenum Press, 1984. - P. 183-234. 4. Goldstein I., Hayes С. // Adv. Carbohydr. Chem. В Lo­ chern. , 1978. - Vol. 35. - P. 127-340. 5. Irimara Т., Nicolson G. // Carbohydr. Res. - 1983. - Vol. 115. - N 1. - P. 209-220. 6. Keyser J. // Anal. Biochem. - 1964. - Vol. 9. - M 2, - P. 249-252. 7. Krueger R., Schwartz N. // Acalyt. В Lochern. - 1987.- Vol. 167. - N 2. - P. 295-300. 8. Osawa Т., Tsuji T. // Ann. Rev. Biochem. - 1987.-Vol. 56. - P. 21-42. 9. Spiro R. // J. Biol. Chem. - 1965• - Vol. 240. -N 4. - P. 1603-1610. 10. Tsuji Т., Tsunehisa S., Watanabe Y., Yamamoto K.,To- hyama H., Osawa T. // J. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 258. - N 10. - P. 6335-6339. 16 ЗНАЧЕНИЕ ЛЕШН-УГЛЕВОДНЫХ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ В ФОРШРОВАНИИ БАКТЕРИАЛЬНО- РАСТИТЕЛЬНЫХ СИМШОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Л.В. Косенко, Т.М. Ковалевская Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР Физиологическая роль лектинов в биотропных взаимодейст­ виях на всех уровнях живого до настоящего времени окончате­ льно не выяснена. Несмотря на то, что тезис об участии уг- леводсодержащих веществ и комплементарно специализированных к ним белков - лектинов в распознавании биотических партне­ ров не оспаривается, намечаются лишь контуры наших представ­ лений о функционировании обоих типов этих биополимеров при коммуникации - и макроорганизмов. Полисахариды, также как и лектины, являются высокоспециализированными молекула­ ми и обладают широким спектром биологической активности.По­ верхностное расположение полисахаридов в микробной клетке определяет их функциональную роль во взаимоотношениях с дру­ гими -, а также макроорганизмами. Известно,какое боль­ шое влияние оказывают бактериальные полисахариды на функци­ онирование системы иммунитета (СИ) человека и животных. По­ казано, что они являются иммуномодуляторами,индукторами це­ лого ряда биологических стратегий СИ. Изучение регуляторных механизмов растений только начи­ нается. Некоторые успехи достигнуты в исследовании разви­ тия взаимоотношений между растениями и патогенными микроор­ ганизмами. Установлены первые реакции ответа растения-хозя­ ина на контакт или внедрение фитопатогена. Выявлены вещест­ ва (олигосахарины), обладапцие регуляторными функциями /5/. Молекулярно-химические основы формирования симбиотических структур изучены совсем мало. Результаты исследований ряда авторов за последние 15 лет позволяют предположить, что ко­ оперирование партнеров на ранних этапах формирования симби­ оза происходит с участием лектинов растений и поверхностно локализованных полисахаридов микроорганизмов. Однако вопрос о значении углевод-белковой рекогниции симбионтов в уста­ новлении их контактов является крайне дискуссионным.Способ­ ность бактериальных полисахаридов взаимодействовать с лек- 17 тинами растений-хозяев не оспаривается. Сомнению подлежит селективность лектин-углеводных взаимосвязей. Целью нашей работы было установить селективность взаи­ модействия растительных лектинов и бактериальных полисаха­ ридов в зависимости от симбиотических свойств обоих парт­ неров. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования служили симбиотические пары, об­ разованные в результате сочетания одного из 10 штаммов Rhizobium leguminogarum И ОДНОГО ИЗ четырех растений-хозя- ев: кормовых бобов (Vicia faba L.)), гороха (Pisum sativum L.). ВИКИ (Vioia sativa L. ) И чечевицы (Lens culinaris ). Экзополисахаркды (ЭПС) получали из освобожденной от клеток бактерий культуральной жидкости высаливанием серно­ кислым аммонием (50 % насыщения). Липополисахариды экстра­ гировали из сухих клеток бактерий аодно-фенольной смесью при 65°С в течение 15 мин по методу Вестфаля, очищали с помощью 2 %-кого цетавлсна в 0,5 М NaCl /I/. Лектины получали экстракцией из муки семян бобовых рас­ тений физиологическим раствором в течение I ч, высаливали сернокислым аммонием (60-80 % насыщения). Очищали аффинной хроматографией с использованием в качестве аффинного сор­ бента сефадекса Г-100 /3/. Степень лектин-углеводного сродства симбионтов опреде­ ляли по степени угнетения активности лектинов экзо- и ли- пополисахаридами, определяемой реакцией подавления гемаг- глютинации (РИГА). Результаты выражены в процентах /V- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимоотношения симбиотических партнеров, за некоторы­ ми исключениями, строго специфичны. Это означает, что клу­ беньковые бактерии одного вида способны заражать только свойственное им растенке-хозяин. Однако бактерии вида R- leguffiinosarum способны вступать в симбиоз с целой группой бобовых растений, представители которой принадлежат к раз­ личным видам. Это кормовые бобы, горох, вика и чечевица. Основным моментом при изучении селективности взаимо­ 10 связей близкородственных бобово-ризобиальных пар мы считали количественный критерий оценки их лектин-углеводного срод­ ства. Дело в том, что при анализе различного рода проявле­ ний взаимодействия клубеньковых бактерий (кл.б.) с бобовыми растениями методологическим подходом в подавляющем числе случаев является принцип: "да-нет" и значительно реже:"боль- ше-меныпе". Вместе с тем сравнительный количественный ана­ лиз исследуемых явлений позволяет ввделить специфические акты на фоне неспецифических событий. В связи с тем, что сам процесс прикрепления ризобий к корневым волоскам расте­ ния-хозяина изучен достаточно полно /6/, мы изучали совме­ стимость симбионтов на уровне молекулярного взаимодействия компетентных структур системы рекогниции, что должно было выявить лектин-углеводные взаимосвязи симбиотических парт­ неров как бы в чистом виде, беэ тех дополнительных влияний, которые всегда сказываются, когда исследуется функциониру­ ющая биотическая структура или ее компоненты. Для этого из бактерий, выращенных ex plan ta,вццеляли поверхностно лока­ лизованные полисахариды - ЛПС и ЭПС, из семян растений-хо- зяев получали лектины, а затем определяли активность их вза­ имодействия. Известно, что лектины семян и корней изучаемых растений сходны между собой по углеводной специфичности и другим свойствам /7, 8, 9/. Нами было установлено, что и ЛПС, и ЭПС всех десяти изу­ чаемых штаммов бактерий взаимодействовали с лектинами всех четырех растений-хозяев и не подавляли гемагглютинирующей активности лектинов несвойственных им партнеров -сои и пше­ ницы (эти лектины были любезно предоставлены нам М.Д. Луцм- ком). При этом было обнаружено, что бактериальные полисаха­ риды наибольшую степень сродства проявляют по отношению к лектину своего доминирующего растения-хозяина (из клубень­ ков которого они были вццелены): полисахариды кл.б. кормо­ вых бобов - к лектинам кормовых бобов, полисахариды кл.б. гороха - к лектинам гороха, полисахариды кл.б. вики и чече­ вицы - к лектинам вики и чечевицы /2/. Приведенные данные свидетельствуют о том, что присоеди­ нение растительных лектинов к бактериальным рецепторам но­ сит выраженный селективный характер. Селективность углевод- 19 3* белковых взаимосвязей симбионтов определяется прежде всего таким важным свойством^как специфичность. Для несвойствен­ ного подбора пар к. leguminosarum - пшеница или соя мы по­ лучили ответ "нет", а для всех естественных симбионтов - "да", причем во втором случае было также установлено, что более узкая приуроченность ряда бактерий этого вида к одно­ му какому-то бобовому растению в пределах заражаемого круга хозяев определяется большей или меньшей степенью лектин-по- лисахаридного сродства: чем оно выше, тем специфичней сим­ биоз. Это легко объясняется тем, что близкородственные сим- биотические структуры не должны принципиально различаться между собой, но могут варьировать по степени молекулярно- химического соответствия симбионтов. Полученные данные представляют собой, с одной стороны, химическое обоснование феномена перекрестной заражаемости целой группы бобовых растений одним видом клубеньковых бак­ терий, а с другой, являются химическим истолкованием суще­ ствования внутри вида в. leguminosarum отдельных узкогомо­ логических групп бактерий. Оба явления можно объяснить сов­ местимостью симбионтов, одним из факторов которой является комплементарность углевод-белковых детерминант системы ре- когниции. Исходя из обнаруженного факта существования от­ дельных групп симбионтов внутри рассматриваемых симбиотичес­ ких структур далее исследования проводили с уэкогомологич- ными парами: кл.б. кормовых бобов - доминирующее растение- хозяин. Для установления, могут ли полисахариды ризобий опреде­ лять их симбиотический потенциал, нами были выбраны пять штаммов клубеньковых бактерий кормовых бобов, отличающихся между собой такими важными для микросимбионтов свойствами, как эффективность (азотфиксирупцая активность)и конкуренто­ способность (рисунок I). Сравнительная оценка аффинного связывания бактериальных полисахаридов с лектином кормовых бобов позволила установить, что степень ЛПС-лектинового сродства бобово-ризобиальных партнеров коррелирует с эффек­ тивностью симбиоза (азотфиксирущей способностью) штаммов, а ЭПС-лектинового сродства - с их конкурентоспособностью. Это позволяет сделать предположение, что бактериальные по- 20 Эффективность симбиоза, % 200 100 РПГА, % 160 ВО 120 60 PO. 40 40 20 [Т Эффективность Взаимодействие Взаимодействие симбиоза ЛПС с лектином ЭПС с лектином Рис. I. Степень сродства лектина одного сорта кормовых бо­ бов (Полесские) к ЛПС и ЭПС пяти штаммов R. legumi­ nosarum (Vicia faba): I-шт. А"К/(неэффективный, вы­ сококонкурентоспособный), 2-шт. А (малоэффективный, среднеконкурентоспособный), 3-шт. 86 (среднеэффек- тивный, неконкурентоспособный), 4-шт.Ан (высокоэф­ фективный, неконкурентоспособный), 5-шт. АК (высо­ коэффективный, высококонкурентоспособный). лисахариды играют неравнозначную роль при установлении сим­ биотических контактов: ЭПС, будучи расположенным на крайних периферических участках микробной клетки, первым вступает во взаимодействие с растением-хозяином и выступает посред­ ником бактерий на самых ранних этапах кооперирования, а ЛПС как составная часть клеточной стенки бактерий участвует на стадии закрепления их на корневом волоске. Известно, что потенциально способные к активной азот- фиксации клубеньковые бактерии оказываются неэффективными на некоторых сортах растения-симбионта. Если это явление связано с физиолого-биохимическим несоответствием партнеров, то проявляется ли это уже на самых ранних стадиях формиро­ 21 вания симбиоза - в процессе распознавания их друг другом? Для выяснения этого вопроса была использована другая модель эксперимента. Мы изучали степень сродства ЛПС и ЭПС одного штамма кл.б. кормовых бобов к лектинам трех сортов расте­ ния-хозяина, различающихся между собой по отзывчивости к микросимбионту: на двух из них ("Аушра" и "Дайва") изучае­ мый штамм проявлял высокую эффективность симбиоза, а на третьем ("Йыгева") был практически неэффективен (рисунок 2). Эффективность симбиоза, % 90J 60 РПГА, % 60 40 30 20 0 0 1 I 2 J 4 |2 3 4 1 2 3 4 Эффективность Взаимодействие Взаимодействие симбиоза ЛПС с лектином ЭПС с лектином Рис. 2. Степень сродства ЛПС и ЭПС одного штамма R. legumi­ nosarum (vicia faba) 86 к лектинам трех сортов кор­ мовых бобов: I, 2-лектины сорта йыгева,3-сорта Дай­ ва, 4-сорта Аушра. Из семян двух отзывчивых сортов нами было получено по одно­ му характерному для этого вида растений и хорошо описанному в литературе лектину. Из третьего, неотзывчивого сорта, был выделен не один, а два маннозо(глюкозо)специфичных лектина, суммарное количество которых в семенах было в 4-5 раз мень­ ше, чем в других сортах. Однако они отличались друг от дру­ га минимальными ингибирупцими дозами Сахаров и некоторыми другими свойствами. Активность взаимодействия обоих лекти­ нов неотзывчивого сорта с ЛПС и ЭПС была ниже, чем у лекти­ нов двух других сортов, т.е. при эффективном симбиозе сте­ пень лектин-рецепторного сродства симбионтов оказалась вы­ 22 ше, чем при неэффективном. Это означает, что в зависимости от качественной и количественной соотнесенности белковых де­ терминант лектинов растений к полисахаридам бактерий пред­ ставители различных сортов растения-хозяина могут опреде­ лять реализацию симбиотического потенциала клубеньковых ба­ ктерий, исходно способных к активной аэотфиксацни. Кроме того, мы еще раз подтвердили, что более высокой эффектив­ ности симбиоза соответствует и более высокая лектинсвязыва- пцая активность ЛПС. Коррелятивная зависимость между ЛПС-лектиновым сродст­ вом и эффективностью симбиоза - конечным результатом дея­ тельности обоих симбионтов - указывает на исключительно важ­ ную тркггерную роль ЛПС в симбиотическом процессе. По ана­ логии с действием бактериальных ЛПС в системе человека и животных, ЛПС в. leguminosarum может служить индуктором программ симбиотического кооперирования, которая запускает­ ся при взаимодействии ЛПС с лектином корневого волоска. Ес­ ли это так, то направление и сила ответа растения-хозяина будет зависеть от свойств лектина (или фонда лектинов),уров­ ня его содержания в растении, свойств и уровня содержания бактериальных рецепторов, стереохимических особенностей ком­ петентных структур макромолекул, а также конкретных условий их взаимодействия. Полученные результаты частично иллюстри­ руют ото положение. Наиболее эффективные симбиотические па­ ры удовлетворяют всем требованиям: высокий уровень содержа­ ния лектина в растении-хозяине, высокий уровень содержания бактериальных рецепторов, высокая степень полисахарид-лек- тинового сродства (77-90 %). Среднеэффективные симбиотичес­ кие пары характеризовались высоким уровнем содержания лек­ тинов и полисахаридов, но меньшей их комплементарностью (44 -63 %). У неэффективных пар при высоком уровне рецепторов наблюдалась либо низкая степень полисахарид-лектинового сродства (33-44 %) при высоком содержании лектинов, либо средняя степень сродства,но при меньшем по -сравнению с дру­ гими растениями-хозяевами содержании лектина. Таким образом, полученные результаты позволяют считать, что микробные полисахариды содержат специализированную ин­ формацию о симбиотической потенции клубеньковых бактерий: 23 их специфичности, эффективности, азотфиксирущей активности, конкурентоспособности и др., которая опосредуется через си­ стему углевод-белковой рекогниции - и макросимбионтов, а степень лектин-полисахаридного сродства содержит информа­ цию о потенциальных возможностях конкретной бобово-ризобиа- льной пары. Несмотря на то что мы, к сожалению,не знаем пол­ ного сценария основных событий специфических межмолекулярных взаимодействий, мы считаем, что у нас есть основания рас­ сматривать бактериальные полисахариды и растительные лектины как компоненты системы, ответственной не только за формиро­ вание симбиоза, но и за его функционирование. Л и т е р а т у р а 1. Захарова И.Р., Косенко JI.B. // Методы изучения мик­ робных полисахаридов. - Киев: Наукова думка, 1982. - 192 с. 2. Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., Захарова И.Я.// Мик­ робиология. - 1987. - Т. 56. - Вып. 4. - С. 698. 3. Луцик М.Д. // Биохимия. - 1974. - Т. 39. - Вып. 4. - С. 811. 4. Луцик М.Д., Панасюк Е.М., Антонюк В.А. и др. // Ме­ тоды исследования углеводной специфичности лектинов: Мето- дич. рекомендации. - Львов, 1985. - 22 с. 5. Albersheim P., Darvill A.G., McNeil М. et ai. // Proc. NATO Adv. Study Inst., Porto Portese, Aug 23-Sept. 2, 1982". - New York, London, 1983- - P. 293. 6. Dazzo F.B., Truchet G.L. // Current developments in biological nitrogen fixation / Ed. by N.S. Subra Eao.London. E.Arnold, 1984. 7. Hosaelet M., Van Driessche E., Van Poucke M., Kanarek L. // Lectins: biology, biochemistry, clinical biochemistry. - Berlin, New York, Walter de Gruyter. - 1983. - Vol. 3. - P. 549. 8. Kabo G., Maruyama Y., Nakamura M. // Plant and Cell Physiol. - 1981. - Vol. 22. - P. 759. 9. Kijne J.W., Schaal van der I.A.M., Diaz C.L. et al.// ibid. - P. 521. 24 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ ГШГГЛГО1НИШВ (ЛЕКТИЮВ) ПОЧВЕННЫХ А30ТВ1КСИРУЩИХ БАКТЕРИЙ В.Е. Никитина, D.B. Итальянская, Л.В. Карпунина, С.К. Ку- раксина, Е. Г. Пономарева, Л.С. Федорова, Л.И. Позднякова Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР, г. Саратов В последние годы значительно возрос интерес к лектинам и агглютининам бактерий, играющим существенную роль в био­ логии микроорганизмов. Одной из главных причин повыпенного внимания являются данные о ведущей роли бактериальных лек­ тинов и агглютининов во взаимодействии "патоген-хозяин". Наиболее полно охарактеризованы среди бактериальных лекти­ нов гемагглютинины энтеропатогенных бактерий. Показано, что эти белки (включая экзотоксины) участвуют в специфической адгезии бактерий к животнда клеткам, которая предшеству­ ет развитию инфекционного процесса /2/. Мало изучены лектины почвенных азотфиксирупцих бакте­ рий, находящихся в симбиотических и ассоциативных взаимоот­ ношениях с высшими растениями. При изучении специфических взаимоотношений ризобий и растительных клеток в симбиоти- ческой аэотфиксирупцей системе до недавнего времени основ­ ная роль в обеспечении адгезии бактерий к корням бобовых растений отводилась растительным лектинам. Однако в послед­ нее время появились сведения об обнаружении гемагглютининов у ризобий /6/. Предположительно им отводится та же роль, что и лектинам патогенов - роль адгезинов, обеспечивающих специфическое прикрепление бактериальных клеток к корням растения-хозяина. Изучение лектинов почвенных азотфиксиру­ пцих бактерий может способствовать как наиболее полному по­ ниманию молекулярных основ взаимодействия "бактерия-расте­ ние", "бактерия-бактерия",так и определенному вкладу в фун­ даментальные исследования физиологической роли лектинов в самой бактериальной клетке. Пелью настоящего исследования было обнаружение и изуче­ ние лектинов некоторых представителей рода азоспирилл, ба­ цилл и ризобий. Начальным этапом наших исследований явилось изучение 25 4 лектинов аэоспирилл. Гемагглютинирупцая активность (ГА) бы­ ла обнаружена у двух типовых штаммов и 28 штаммов, выделен­ ных из-под диких и культурных злаков Саратовской области. Для большинства "диких" культур отмечена специфичность к сложным углеводсодержащим соединениям, таким, как нейрами- новая кислота, глюкуроновая кислота, фруктозо-1,6~дифосфат. С клеточной поверхности типовых штаммов Azospirillum brasi- lense Sp 7 и Azospirillum lipoferum 59b были вьщелены лек­ тины, специфичные к L-фукозе, L-арабинозе и глюкуроновой кислоте соответственно. Из "диких" штаммов были выбраны две культуры A.brasitert- ае 75 и A.lipoferum 43, относящиеся к тем же видам, что и типовые, но выделенные из-под пшеницы Саратовская-29, райо­ нированной в Саратовской области. Лектин, выделенный с клеточной поверхности A.brasilense 75, обладал специфичностью к L-арабинозе, L-рамнозе и L- маннозе, а лектин А.l ipoferum43 - к глюкозо-I,6-дифосфату. Были изучены зависимость адгезивных свойств указанных выше штаммов от лектиновой активности, взаимодействие лек­ тинов с компонентами растительных корней и влияние фукозо- специфичного лектина на прорастание семян. Адгезивные свойства микроорганизмов изучают, используя в качестве тест-объектов эпителиальные клетки, эритроциты, кусочки органов, тканевые и органные культуры /8, 7/. Наи­ более простой и универсальной моделью для изучения адгезии микроорганизмов являются эритроциты. Ранее нами было установлено, что все изучаемые штаммы аэоспирилл агглютинируют человеческие эритроциты 0(1) груп­ пы крови, причем ГА-активность клеток A.brasilense Sp 7 из­ бирательна по отношению к этим эритроцитам. Для оценки вза­ имосвязи лектиновой активности бактерий с их адгезивными свойствами проводилось сравнительное вычисление индекса ад­ гезивно сти бактерий по методу Брилиса с соавт. /I/. Сравни­ вали культуры с лектиновой активностью, выращенные на без­ азотистой среде, и бактерии, лишенные этой активности, вы­ ращенные на среде, богатой азотом. Результаты проведенного исследования представлены на рисунке I. Полученные данные свидетельствуют о том,что бак- 26 НАМ 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 A.br.Sp? A.br.75 A.lip.43 Рис. I. Зависимость адгезивных свойств аэоспирилл от лекти­ новой активности. j I - лектиновая активность отсутствует; fxvi - титр гемагглютинации 1:16 термальные клетки с выраженной лектиновой активностью обла­ дают и более высокой адгеэивностью. Самый высокий индекс адгезивности отмечен у клеток A.brasilense Sp 7,что объяс­ няется, по-видимому, повышенным сродством этих клеток к эритроцитам 0(1) группы крови. Следует отметить также, что у бактерий типовых штаммов аэоспирилл индекс адгезивности ниже, чем у "диких" культур. Интересен тот факт, что бактериальные клетки с элимини­ рованной ГА-активностыо сохраняют, хотя и на более низком уровне, свои адгезивные свойства. При этом сохраняется по­ лярное прикрепление клеток к эритроцитам, характерное для гемагглютинирупцих бактерий. Возможно, эти данные объясняются существованием двойно­ го механизма адгезии. По мнению ряда исследователей /5/, на участке, где происходит специфическая адгезия,к которой от­ 27 4* носится и адгезия за счет углевод-белкового взаимодействия, существует и другой тип адгезии, возможно, неспецифической, которая играет определенную роль в укреплении и поддержании специфического взаимодействия; с другой стороны, выращива­ ние бактерий в присутствии значительных количеств азота мо­ жет и не приводить к полному ингибированию синтеза лектина, а вызывать какие-либо конформационные перестройки в его мо­ лекуле, либо частичное блокирование углевод-связывающих уча­ стков, что приводит к потере поливалентности, а, следова­ тельно, агглютинирующей способности белка,но сохраняет спо­ собность, хотя и ослабленную, к адгезии. Вопросы участия лектинов в специфической адгезии требуют дальнейшего изу­ чения. Одним из проявлений специфического взаимодействия лек­ тинов с гликоконъюгатами является образование преципитатов. При изучении симбиотических взаимоотношений ризобиальных клеток с бобовыми растениями метод преципитации раститель­ ных лектинов с полисахаридными компонентами клеточной по­ верхности ризобий наряду с другими методами использовался для доказательства специфического узнавания на уровне "штамм бактерий - вид растения" /4/. Для изучения реакции преципитации лектинов с экстракта­ ми корней использовали один из вариантов иммунодиффузии в геле - метод интерфазных колец преципитации по Kato et ai. /4/. Из корней 7-дневных проростков пшеницы получали фрак­ ции экзоконпонентов - мембранную и цитозольнуто /3/. Т а б л и ц а Реакция преципитации лектинов аэоспирилл с экстрактами корней пшеницы Саратовская-29 Фракции Титр преципитации лектинов (0,01 %) А .Ьг. Sp7 А.l ip. 59b A.br. 75 A.lip. 4-3 Экзокомпоненты 2-4 2-4 32 16 Нитозольная 16 16 4 2-4 Мембранная 4 8 64 8 28 Как показано в таблице, лектины всех изучаемых штаммов аэоспирилл в той или иной степени преципитировали компонен­ ты экстрактов корней пшеницы, однако характер взаимодейст­ вия и титры преципитации были различными.Самый высокий титр в реакции преципитации с экзокомпонентами и мембранной фрак­ цией наблццался у лектина A.brasilense 75. Титр преципита­ ции лектина A.lipoferum 43 был несколько ниже. Лектины ти­ повых штаммов A.brasilense Sp 7 и А.lipoferum59в преципити­ ровали поверхностные компоненты корневых экстрактов доволь­ но слабо. При взаимодействии с цитозольной фракцией титр преципитации этих лектинов был выше. Результаты цроведенных исследований показывают,что лек­ тины бактериальных штаммов, выделенных из-под пшеницы, про­ являют большее сродство к поверхностным компонентам корней, чем лектины типовых штаммов. Однако для полного суждения о роли бактериальных лектинов в межклеточном узнавании необ­ ходимы дальнейшие исследования специфических и неспецифи­ ческих взаимодействий лектинов с растительными компонентами, в том числе и тех взаимодействий, которые не сопровождаются образованием преципитатов. В последние годы появляется все больше сведений о том, что бактериальные лектины могут не только выступать в роли адгезинов, но и, являясь полифункциональными биополимерами, проявлять различные биологические свойства /9/. Нами было обнаружено (рисунок 2), что фукоэоспецифичный лектин A.brasilense Sp 7 оказывает, в зависимости от кон­ центраций, регулирующее влияние на скорость прорастания се­ мян пшеницы сорта Саратовская-29. Семена проращивали в ра­ створе лектина разной концентрации в течение четъфех суток. Среднее длину корней полученных проростков сравнивали с дли­ ной корней контрольных растений, выращенных в физиологичес­ ком растворе. Установлено, что раствор лектина с концентра­ цией белка 500 мкг/мл полностью подавляет способность семян пшеницы к прорастанию. Ингибирупцее действие лектина оказа­ лось обратимым: семена, удаленные из раствора лектина, про­ пет* и помещенные в физиологический раствор, восстанавли­ вали способность к прорастание. При снижении концентрации лектина в 50 раз наблвдался обратный эффект - стимуляция 29 Средняя длина корней пшени- мм 45 - лектин аэоспирилл; 35 - РНА; - контроль. 25 15 5 I 10 50 500 Рис. 2. Влияние лектина A.brasilense Sp 7 на способность семян пшеницы к прорастанию. прорастания зерновок. С дальнейшим снижением концентрации стимулирующей эффект лектина ослаблялся, и при разведении исходного раствора в 500 раз скорость прорастания семян не отличалась от контрольной. Лектины растительного происхож­ дения - лектин зародышей пшеницы и фитогемагглютинин фасо­ ли, взятые в тех же концентрациях, не оказывали влияния на прорастание семян. Наблюдаемый эффект под действием фукозо- специфичного лектина, видимо, связан с его влиянием на ми- тотическую активность растительных клеток. Начаты исследования лектинов бактерий родов Bacillus и Rhizobium. Выделены препараты лектинов из Bacillus polymy- ха 1460, специфичные к глюкуроновой кислоте, фруктозо-1,6- дифосфату, D-галактозамину HCl, D-глюкозамину HCl, как с поверхности клеток, так и из культуральной среды. Обнаруже­ ны и вццелены гемагглютинины из ризобиальных клеток Bhizo- biu» leguminoaarum 1003. Необходимо дальнейшее изучение физико-химических и био­ 30 логических свойств бактериальных лектинов с целью выяснения их роли в функционировании аэотфиксирупцих симбиотических систем. Л и т е р а т у р а 1. Брилис В.И., Брилис Т.А., Ленцпер Х.П.Ленцпер A.A.// Лабораторное дело. - 1986. - » 4. - С. 210-212. 2. Еэепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. - М.: Медицина, 1985. 3. Методы биохимического анализа растений / Под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова. - Л.: Иэд-во ЛГУ, 1978. - 192 с. 4. Kafco G., Maruyama Y., Nakamura M. // Argic.Biol.Chem. - 1980. - Vol. 44. - P. 2843-2855. 5. Kafco G., Maruyama Y., Nakamura M. // Plant and Cell Physiol. - 1981. - Vol. 22. - N 5. - P. 759-771• 6. Kijne J.W., van der Schaal C.A.U., Diaz C. L., van Iren P. // Lectins /Eds Bog-Hansen T.C. and Splenger G.A. - Berlin; New York: W. de Gruyter and Co. - 1983. - Vol. J>. - 521 p. 7. Kallenius G., Korhonen T. // Enterobacterial surface antigens, 1985. - P. 321-332. 8. Microbial adhesion and aggregation / Ed. Marschall К. - Berlin; Heidelberg; New York; Tokyo, 1984. 9. Roth J. The lectins molecular probes in cell biology and membi-ane research. - Jena: Gustav Fisher Verlag, VEB, 1978. - 185 p. ДЕЙСТВИЕ ЮНКАНАВАЛИНА А НА СЕКРЕЩЮ ФЕРМЕНТОВ У КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ SACCHABOMYCES СE R EVIS IAE B.B. Лупашин, А.Б. Циоменко, И.С. Кулаев Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, г. Пущино В последнее время лектины нашли широчайшее применение в исследовании структуры и функции клеточной поверхности. По­ мимо основного свойства - вызывать агглютинацию клеток,мно­ гим из них присущи и другие особенности, приводящие к нару­ шению некоторых фундаментальных процессов в биологических объектах. Известно, что многие лектины проявляют митоген- 31 ныв, цитолитические и токсические свойства. Лектины могут нарушать биосинтез и функционирование ферментных систем, что особенно ярко проявляется в тех случаях, когда ферменты является гликопротеинами. Инструментом нашего исследования служил фитолектин кон- канавалин А (кон А), выделенный Самнером в 1919 году из ме­ чевидной канавалии Canavalia ens iformus.Молекула кон А со­ стоит из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица представляет собой глобулярный белок с молекулярной массой 25 кД. С углеводсвязывапцимся участком, который имеется у каждой субъединицы, может связываться только один гдикози- льный остаток. Молекула кон А содержит также ионы Мг£+ и Са^+, необходимые для проявления углеводсвязывапцей актив­ ности. Кон А способен связывать маннозу, глюкозу, N-ацетил- глюкозамин и их производные. Наибольшей комплементарностью к связыващим центрам кон А обладает дрожжевой маннан иман- нозосодержащие гликопротеины. Все известные на настоящий момент дрожжевые секретируе- мые белки являются гликопротеинами, во всяком случае на стадии предшественника. Высокомолекулярные полиманнозные це­ пи присоединяются к полипептиду через хитобиозный мостик по остаткам аспарагина. Кроме такого N-гликозилирования, дрож­ жевые гликопротеины часто О-гликозилированы, в этом случае короткие маннановые цепочки присоединяются по остаткам се- рина и треонина. Углеводная часть таких типичных для кле­ точной оболочки ферментов, как кислая фосфатаза (КФ) и ин- вертаэа, составляет до 50 % их молекулярной массы. Изучение молекулярных механизмов секреторного процесса у дрожжевых организмов представляет определенный научный и практический интерес, особенно усилившийся в последние годы в связи с использованием дрожжей для биотехнологических це­ лей - синтеза чужеродных белков и получения их в секретиру- емой форме. Для успешного изучения секреторного процесса необходимо создать условия, в которых секретируемый белок был бы легко доступен определению. Чтобы получить такую возможность ис­ следователи прибегают к широкораспространенному методу про- топластирования: с помощью литических комплексов клеточная 32 стенка разрушается полностью, в случае протопластов,или час­ тично, в случае сферопластов. Клетки после такой обработки, естественно, нельзя считать интактными. Однако при их поме­ щении в специально подобранные жидкие среды удается наблю­ дать выход вновь синтезированных компонентов периплазмы и клеточной стенки во внешнюю среду. Используя технику протопластирования и изучая закономер­ ности секреции некоторых гликопротеинов у дрожжевых прото­ пластов и сферопластов,нам удалось существенно расширить по­ нимание процессов регуляции их биосинтеза и секреции /3/. Если на протопласты с полностью удаленной клеточной стен­ кой подействовать определенными концентрациями кон А, то бу­ дет наблвдаться подавление многих биохимических реакций, в том числе и биосинтез секретируемых гликопротеинов (рисунок I ) . 100 20- 100 КОН А; мкг/мл Рис. I. Зависимость биосинтеза и секреции кислой фосфатазы, а также включения (^Н)-лейцина в белок, от концент­ рации кон А у протопластов. За 100 % принята актив­ ность КФ в контроле. I- общая активность, 2 - секре- тируемая активность, 3 - активность,связанная с про­ топластами, 4 - вклинение (^Н)-лейцина. 33 5 Совершенно по-иному обстоит дело, если клеточную стенку удалить не полностью, а частично, то есть,если дектином по­ действовать на сферопласты (рисунок 2). В этом случае кон А вызывает эффект, выражащийся не в общем подавлении белко­ вого синтеза, а в избирательном торможении секреции глико­ протеинов клеточной оболочки, например, КФ и инвертазы. 8 0 - >-о. 40- 0 25 50 100 КОН А мкг/мл Рис. 2. Зависимость биосинтеза и секреции кислой фосфатазы, а также включения (^Н)-лейцина в бедок, от концент­ рации кон А у сферопластов. За 100 % принята актив­ ность КФ в контроле.I - общая активность,2 - секре- тируемая активность,3 - активность,связанная с сфе- ропластами, 4 - включение (^Н)-лейцина. Таким образом нам удалось показать, что воздействуя на измененную клеточную поверхность, можно вызвать избиратель­ ное торможение секреции гликопротеинов без нарушения их синтеза. Однако секретировать в среду гликопротеины могут не только клетки, лишенные оболочки,но и интактные дрожжи. При росте на богатых питательных средах в культура л ьную жид­ 34 кость экспортируется до 40 % инвертазы и КФ. Применив лек­ тин для изучения секреции белков целыми клетками, мы прежде всего установили, что лектин в широких пределах его концен­ траций не влиял на рост клеток. В то же время,подобно тому, как это наблвдается у сферопластов, кон А специфически тор­ мозил экспорт КФ и инвертазы, вызывая их накопление внутри клеток. На рисунке 3 показано влияние различных концентраций лектина на распределение КФ в клетках и среде. Полное прек­ ращение экспорта фермента наступало при концентрации кон А 400 мкг/мл. Важно отметить, что даже при полном подавлении экспорта КФ при указанной концентрации и вше, кон А не вы­ зывал изменения активности КФ, локализованной в клеточной оболочке, то есть определяемой на целых клетках. Более детальное рассмотрение характера действия кон А приведено на рисунке 4. Так, если клетки росли в присутст­ вии той концентрации лектина, которая тормозила экспорт, то вся активность КФ, предназначенная для выхода в культураль- ную среду, накапливалась внутри клеток. Возможность ее вы­ хода могла быть создана путем введения в среду ингибитора связывания лектина-^--метилманноаида.Одновременное внесение ^-метилманнозида и ингибитора белкового синтеза-циклогекси- мида не мешало выходу фермента. Это указывало на то,что эк­ спортированный белок не был синтезирован de novo. Выход на­ копленного фермента можно было предотвратить путем обра­ ботки клеток ингибитором дыхания - азидом натрия перед вне­ сением -метилманнозида. Это свидетельствовало об энергоза­ висимости процесса прохождения фермента через плазмалемму. Последнее из указанных обстоятельств было продемонстриро­ вано с помощью цитохимической реакции на КФ. Только при об­ работке клеток азидом натрия удалось зафиксировать накопле­ ние КФ в примембранном слое клеток /2/. Аналогичные результаты были получены нами для другого секретируемого фермента - инвертазы. Механизм действия лектина на процесс секреции не ясен. Предполагается, что кон А взаимодействует с углеводсодержа- щими рецепторами, ассоциированными с плазмалеммой. Различ­ ный эффект лектина определяется разной доступностью этих 35 5* ' • • , Кон fi С 200 too eoО too 4000 «кг/мл Рис. 3. Зависимость экспорта КФ от концентрации кон А в среде. I - активность КФ внутри кле- ток, 2 — в клеточной оболочке9 3 — в культуральнои жидкости• Внутриклеточную актив-* ность определяли в лиэате протопластов. * ' 800 400 200 0 2 4 6 8 Роет . 1 Рис. 4. Накопление экспортируемой КФ внутри клеток,обуслов­ ленное кон А, и снятие этого эффекта // метилманно— зидом. I - внутриклеточная активность КФ в конт­ рольном варианте, 2 - добавление кон А, 500 мкг/мл, умедуицее за кон А внесение а(/ -мет илманноз и да (0,5 М) и циклогексимида (10 мкг/мл). Стрелкой от­ мечен момент внесения ,^-метилманнозида и циклогек­ симида. Ьокуол b ПА ЭПР ПП Ядро I—т КС Рис 5 Схема секреции белков у дрожжей. КС - клеточная стенка, ПП - периплааыатическое про­ странство, ПЛ - пдазмалемма, АГ - аппарат Гольдки, ЭПР - эндоплазматический ретиху- дш. рецепторов для внешних агентов у интактных клеток и клеток, частично или полностью лишенных клеточных стенок. Таким образом, на интактных клетках лектин полностью тормозит только экспорт ферментов в окружающую среду. На основании полученных данных, а также наших работ по опреде­ лению проницаемости клеточной оболочки дрожжей /2/ и изуче­ нию секреции гетерологичных белков /I/, нами предложены су­ щественные дополнения в схеме секреции белков у дрожжевых организмов (рисунок 5). В ней предусмотрено разветвление терминальной стадии секреторного процесса на два независи­ мых потока: доставляющего ферменты клеточной оболочки на периферию клетки и обеспечивающего экспорт белков в окружа­ ющую среду. С помощью конканавалина А можно полностью раз­ общить эти потоки. Л и т е р а т у р а 1. Скрябин К.Г., Циоменко A.B. и др. Биотехнология,1987. - Т. 3. - С. 312. 2. Циоменко A.B., Лупашин В.В. и др.Микробиология,1987. - Т. 56. - С. 797. 3. Циоменко A.B., Рязанова Л.П. и др. Биохимия, 1983. - Т. 271. - С. 1000. РОЛЬ ЛЕКШНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЖИВЫХ СИСТЕМ РАЗНЫХ УРОВНЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ Л.И. Линевич Институт биохимии им. А.Н. Баха АН СССР, г. Москва Лектины, главным свойством которых является специфичес­ кое связывание с углеводами определенного строения, участ­ вуют в клеточном узнавании, поскольку клеточная поверхность включает углеводы или углеводсодержащие полимеры. Под узна­ ванием понимают специфически направленное и пространственно организованное установление контактов между молекулами био­ полимеров. Такие контакты устанавливаются при стерической дополнительности (комплементарности) взаимодействующих по­ верхностей /2/. В.А. Энгельгардт в своей статье "О некото­ рых атрибутах жизни: иерархия, интеграция,узнавание" пишет: 39 "Это значение так велико и настолько выражено именно в про­ цессах живого мира, что есть основание видеть в нем, как уже делают некоторые авторы, типичный атрибут жизни такого же порядка, как, например, организация; это, впрочем, тем более обосновано, что именно для возникновения организации явления узнавания, несомненно, играют роль одного из ключе­ вых факторов" /2/. Создатель теории происхождения жизни А. И. Опарин /I/ рассматривает межмолекулярные взаимодействия как важный фак­ тор эволюции, а явления самосборки всевозрастающей сложнос­ ти - как определенные стадии эволюционного процесса. Лектин-углеводное взаимодействие, определяющее узнава­ ние клеток по их поверхности, является организованным прин­ ципом становления жизни на разных ступенях иерархии,что вы­ является при рассмотрении следующего ряда систем возрастаю­ щей сложности: одноклеточные (прокариоты и эукариоты), про­ стейшая форма многоклеточности (колониальные микроорганиз­ мы), многоклеточные (губки и высшие организмы), межвидовые сообщества, взаимовыгодные (симбиоз в лишайниках и азотфик- сирутсщих микроорганизмах) и антагонистические (патосистемы бактерии - растения, бактерии - животные). По одноклеточным эукариотам узнавание изучено на дрож­ жах, у которых выражено половое узнавание. Выделены и изу­ чены компоненты клеточной поверхности дрожжей, обладающие лектиновой активностью,и полимеры углеводной природы, спе­ цифически связывающиеся с этими веществами, локализованными в оболочке клеток противоположного пола. Клеточное узнавание при развитии колониальных микроор­ ганизмов изучено на слизевиках. Такие вещества, как диско- идин и паллидин, которые являются лектинамм, ответственны за стадии агрегации одноклеточных форм слизевиков в много­ клеточные формы. Формирование при этом колонии с внутренней организацией - первый шаг на пути возникновения многокле­ точных организмов, поэтому их изучение представляет особый интерес для эволюционной теории. В межклеточных и межтканевых взаимодействиях, которые представляют собой универсальный интегрирующий механизм це­ лостности организма на всех этапах эволюции, лектины и спе- 40 пифические для них углеводы и углеводсодержащие полимеры клеточных поверхностей также играют большую роль. Особенно наглядно это продемонстрировано на губках. Роль лектинов в клеточных узнаваниях у высших животных еще не изучена, од­ нако широкое распространение лектинов в животных дает воз­ можность предположить, что и у высших организмов в основе клеточного узнавания лежат механизмы, сходные с изученными на более простых организмах - колониальных формах и губках. На экологическом уровне, т.е. при образовании систем взаимовыгодных и невыгодных сообществ, участие лектинов по­ казано на весьма многочисленных примерах. Так, доказано участие лектинов в образовании лишайников - симбионтов во­ дорослей и грибов. Доказано, что эукариотический организм - гриб - выделяет лектин, который узнает совместимый вид про- кариотического организма - водоросли и связывается за счет угле водсодержащих компонентов его поверхности. Особенно интенсивно в последние годы изучается механизм образования симбиотической системы клубеньковые бактерии - бобовое растение. Изучение молекулярных основ взаимодейст­ вия - и макросимбионтов показало, что это крайне слож­ ный и многофакторный процесс, детали которого еще не ясны. Связывание бактерий с клетками корневого волоска кажется наиболее важным этапом становления симбиотической системы, однако для формирования клубенька необходимы по крайней ме­ ре еще три стадии: узнавание бактериями корневых волосков до связывания с ними, внедрение бактерий внутрь корневых волосков вслед за связыванием и превращение бактериальных клеток в бактероиды, т.е. форму, в которой протекает про­ цесс азотфиксации. На всех этапах образования симбиотичес­ кой системы и в процессе ее дальнейшего функционирования ведущая роль принадлежит углеводсодержащим биополимерам кле­ точной поверхности бактерий и их взаимодействию с лектинами. В последние десятилетия интенсивно изучается роль лек­ тинов при антагонистических взаимоотношениях видов. Получе­ ны данные об углевод-лектиновом узнавании в образовании раз­ личных патосистем: при бактериальных и грибных заболеваниях растений и животных. Особенно наглядно показано,что взаимо­ отношения партнеров в сообществах высших растений с бакт^ 41 6 риями и грибами определяется углевод-лектиновым узнаванием на примере взаимодействия картофеля с вирулентными и авиру­ лентными штаммами бактерий и пшеницы с патогенным грибом. Только начинается изучение роли лектинов в развитии ин­ фекционных заболеваний животных и человека. Результаты ис­ следований последних лет с большой убедительностью говорят о том, что инфекционному процессу предшествует специфичес­ кая адгезия бактерий к животной клетке, которая является следствием лектин-углеводного узнавания. Роль такого узна­ вания в адгезии, предшествующей началу инфекционного про­ цесса, установлена при изучении взаимодействия кишечной па­ лочки со слизистой кишечника. Аналогично идет адгезия воз­ будителя брюшного тифа, холерного вибриона и возбудителей других инфекционных заболеваний. Лектины, по-видимому, име­ ют значение не только в начале развития заболевания, но и на дальнейших его этапах. Так, показано, что некоторые -эн­ дотоксины по механизму действия сходны с такими лектинами, как абрин и рицин. Дифтерийный токсин был подвергнут весьма интенсивному изучению, в результате которого было показано, что он может быть рассмотрен как модель токсина с лектино­ вой активностью. Уже сейчас можно утверждать, что главной функцией лек­ тинов является узнавание углеродсодержащих кошонентов кле­ точных поверхностей, которое на каждом из уровней организа­ ции ведет ко все возрастающей интеграции. Углевод-белковое узнавание здесь проявляется как организационный принцип ста­ новления жизни разных ступеней иерархии. Дальнейшее изуче­ ние -этой категории должно помочь понять природу жизни в це­ лом. Поэтому исследование лектинов как компонентов узнающей системы является весьма перспективным направлением биохимии, имеющим большое общебиологическое значение. Л и т е р а т у р а 1. Опарин А.И. Материя - жизнь - интеллект. - М.:Наука, 1977. 2. Энгельгардт В.А.//Современное естествознание и мате­ риалистическая диалектика. - М.: Наука. - С. 342. 42 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЮНКАНАВАЛИНА А НА ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ Г.М. Кравцов, Е.Э. Граевская, И.О. Дулин, E.H. Гончаренко, Ю.Б. Кудряшов Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Лектин-Кон А и антитела к IgE стимулируют тучные клетки к выделению биогенного амина - гистамнна /3/. В механизме действия на тучную клетку Кон А и анти-IgE много общего.Кон А и анти-IgE инициируют подвижность поверхностных рецепто­ ров, что сопровождается агрегацией белков мембраны, то есть приводит к образованию кластеров /9/. Оба соединения вызы­ вают увеличение уровня свободного кальция и активацию фос- фоинозитидного цикла в тучных клетках - ступеней, необходи­ мых для индукции экзоцитоза /б/. Поэтому механизм действия Кон А на тучные клетки можно рассматривать как модель собы­ тий, происходящих при активации мастоцитов in vivo.В насто­ ящее время практически отсутствуют данные о роли цитоскеле- та в секреции тучных клеток. Далеки от завершения исследо­ вания, направленные на изучение конкретных механизмов пере­ дачи сигнала от рецептора к внутриклеточным компонентам ма­ стоцитов. В представленном исследовании рассматриваются следующие вопросы: Роль цитоскелета в рецепции Кон А; место протеинкиназы С в секреции тучных клеток, индуци­ рованных Кон А-, взаимосвязь фосфорилирования белков и высвобождения ги- стамина при действии на тучные клетки Кон А. При фиксации тучной клетки глютаровым альдегидом в ней можно заметить базальную мембрану (плазматическую) и рядом как бы внутреннюю мембрану, видимо, образование, состоящее из микрофиламентов, темноокрашенные секреторные гранулы и ярко выраженное ядро. После выделения цитоскелета с помощью обработки мастоцитов тритоном Х-100 форма клетки сохраняет­ ся, хотя и не видно плазматической мембраны, гранулы совер­ шенно прозрачны, организованной микрофиламентной системы не наблюдается. Микротубулярная система не просматривается как на целых фиксированных клетках, так и на цитоскелвте, что 43 6* согласуется с данными других авторов, полученных в самое по­ следнее время /2/. Для определения мест связывания Кон А с тучными клетками мастоциты обрабатывали FlTC-Кон А (250 мкг/мл), часть клеток после отмывки от флуоресцентного лектина фиксировали глюта- ровым альдегидом, из другой части получали цитоскелет и так­ же фиксировали.FlTC-Кон А связывается как с целыми клетками, так и с обработанными тритоном X—100 мастоцитами.Из получен­ ных нами данных следует, что при связывании Кон А с рецепто­ ром образуются кластеры (кэпы), и рецептор Кон А непосредст­ венно связан с элементами цитоскелета. Еще одно важное дока­ зательство участия цитоскелета в рецепции Кон А было получе­ но при электрофорезе белков целых клеток и цитоскелета на полиакриламидном геле. Как видно из рисунка I, полоса белка около 30 кДа присутствует на электрофореграмме белков целых отмытых клеток и во фракции цитоскелетных белков. 93 кДа — 67 кДа — 43 кДа• — 30 кДа 20 кДа — 14 кДа 12 3 4 Рис. I. Схема электрофореграммы белков тучных клеток и цито­ скелета после воздействия на них Кон А. 1. Контроль, клетки: 2. Кон А (30 мкг/мл); 3. Контроль, цитоскелет; 4. Кон А (30 мкг/мл), цитоскелет. 44 На основании полученных результатов можно сделать за­ ключение, что одна из субъединиц рецептора Кон А тучных клеток прямо связана с белками цитоскелета, и при взаимо­ действии с лектином, по-видимому, меняется подвижность ци- тоскелетного каркаса, что приводит в конечном счете к обра­ зованию кластеров. После связывания Кон А с рецептором тучных клеток про­ исходят увеличение содержания свободного Са^+ и дегрануля­ ция. Повышение концентрации свободного кальция связано с открыванием рецепторзависимых кальциевых каналов /I/. В то же время, как известно из данных литературы /5/,Кон А очень быстро (в течение 30 с) вызывает через активацию фосфолипа- зы С усиление обмена фосфоинозитидов с образованием диацил- глицерина - вторичного посредника передачи сигнала /8/. Ди- ацилглицерин вместе с Са^+ активирует протеинкиназу тучных клеток /7/. Соединение, имитирулдее действие Са*"+ и диацкл- глицерина на протеинкиназу С - опухолевый промотор, форбо- ловый эфир, в нашем случае 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-аце- тат (ТРА), - усиливает высвобождение гистамина из тучных клеток. В связи с этим можно предположить, что один из механиз­ мов секреции, индуцированной Кон А, непосредственно связан с активацией протеинкиназы С. Для проверки этого положения было проведено сравнительное исследование влияния Кон А и ТРА на фосфорилирование белков тучных клеток. ТРА вызывает усиление фосфорилирования белков с молекулярными весами 14,5; 20, 28, 36, 47, 62-65, Кон А усиливает фосфорилирова­ ние белков с молекулярными весами 14,5; 20-28 нДа (рисунок 2). Сравнивая кинетики высвобождения гистамина и фосфорили­ рования белков, следует отметить, что повышение фосфорили­ рования белков 14,5; 20, 23-25 и 28 цЦа наблюдается как при действии ТРА, так и Кон А и совпадает по времени с деграну­ ляцией. На основании этих экспериментов нельзя ответить на вопрос, фосфорилирование какого класса белков (белки плаз­ матической мембраны, гранул, цитозоля или цитоскелета) иг­ рают ключевую роль в экзоцитозе мастоцитов. Известно, что процесс секреции в тромбоцитах, хромафинных клетках,нейтро- филах, клетках поджелудочной железы и нервных окончаниях /4/ 45 tcd cd cd =ч Ft « g tt ы tc=d5 LOt=cd^ cd cd со «C4Z Юß О D~ CNI CV C\2 C\J со -^r to2 ОО) Ш i i i I I cd cc=dC w X =c^dС ЮЕ=cd£ tiCvZ к CОV ОCOJ CcOv t l 1 J4AI, 6 Кнгибирование связывания ^"41-ЦП с ЭР двухантенной структу­ рой углеводной части ЦП, показанное нами, является дополни­ тельным подтверждением специфичности рецептора ЭР к фраг­ менту I. Таким образом, можно констатировать, что рецептор ЦП на ЭР специфически связывает лишь два участка углеводной цепи ЦП: концевые остатки сиаловой кислоты и удаленный от конца углеводный фрагмент I. Резюмируя, можно заключить, что спе­ цифичное взаимодействие Ц1 с рецепторами ЭР имеет лектино- подобный характер. Л и т е р а т у р а 1. Barnes G., Frieden Е. // В Lochern, and Blophys. Res. Commune. - 1984. - Vol. 125. - N 1. - P. 157-162. 2. Emmelot P. // Eur. J. Cancer. - 1975. - Vol. 9. - P. 519-353. 51 7* ' 1 i' «-v-G'iTiOIUKuv'l I 3. Endo M., Suzuki К., Schmid К. // J. Biol. Chem. - 1982. - Vol. 257. - N 15. - P. 8755-8758. 4. Hunter W.M., Greenwod P.C. // Nature. - 1962. - Vol. 194. - N 4828. - P. 495-496. 5. Pfeffer S.R., Swislocki N.I. // Mech. of Ag. and Dev. - 1982. - Vol. 18. - P. 555-567. 6. Stocks J., Gutteridge J.M., Sharp J.R. // Clin. Sei. Mol. Med. - 1974. - Vol. 47. - P. 223-255. 7. Tanaka Y., Briomin V.A,, Kavamura X. et al. // J. Biooh-im. - 1983. - Vol. 94. - N 3. - P. 841-817. УЛ ЬТРА СТРУКТУР HD E РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕНТИНОВИХ РЕЦЕПТОРОВ НА ПОВЕРХЖСТИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК О.В. Юрченко, Е.П. Ветрова, O.A. Хомутовский, М.Д. Луцик, 0Передерей Институт проблем онкологии им. P.E. Кавецкого АН УССР, Институт биохимии им. A.B. Цалладина АН УССР, Киев Использование лектинов в электронной цитохимии позволя­ ет не только определить природу углеводных детерминант по­ верхностных рецепторов и оценить степень их распределения, но и связать тип распределения лектиновых рецепторов с осо­ бенностями тонкого строения изучаемых клеток. Лектины, наряду с антителами, стали важным инструментом в исследованиях структуры клеточной поверхности. С помощью лектинов стало возможным идентифицировать отдельные глико- протеины на молекулярном уровне, а благодаря специфичности их взаимодействия с углеводами, появилась возможность диф­ ференцировать определенные углеводные группы на поверхности клетки, что является существенным дополнением характеристи­ ки клеток разного происхождения. Лимфоидные линии являются клонами клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки,и служат моделью для все­ стороннего изучения маркеров различных ступеней дифференци­ ровки лимфоидных клеток. Данное исследование проводили на лимфоидных линиях че­ ловека В- и Т-клеточного происхождения: RPMI-I788,Daudl,Yur- kat, MDLT-4. Использовали лектины клещевины (RCA), сои (sBA), улитки (HPL), арахиса (PNA),завязи пшеницы(WGA). Вы­ деление лектинов в чистом виде и их конъюгация с маркера- 52 ми - ферритином (Р) и коллоидным золотом (Au) - проведена М.Д. Луциком. Цитохимическую реакцию выявления рецепторов лектинов проводили на отмытой забуференным физиологическим раствором от среды инкубации суспензии клеток, предварительно кратко­ временно префиксированных 0,1 %-ным глютаровым альдегидом. Условия проведения цитохимической реакции зависели от ис­ пользуемого метода выявления (прямого или непрямого) марке­ ра и лектина. При прямом методе выявления материал обраба­ тывали коньюгатами лектинов в течение двух часов. При не­ прямом методе выявления префиксированные клетки обрабатыва­ ли нативными лектинами в течение 1-2 часов. После отмывки клетки конъюгировали в течение одного часа тиреоглобулин- коллоидным золотом или овомукоид-коллоидным золотом.Для до­ казательства специфичности связывания при использовании каж­ дого лектина проводили контрольные эксперименты в присутст­ вии соответствующего углевода-ингибитора в 0,5 М концентра­ ции или 0,1 %-ного овомукоида (для WGA) . После проведения цитохимической реакции клетки фикси­ ровали 4 %-ным глютаровым альдегидом на 0,1 М какодилатном буфере, дофиксировали 2 %-ным раствором OsO^, содержащим 1,8 % K4Fe(CN)6, обезвоживали в спиртах восходящей концент­ рации и заключали в аралдит. Все этапы, кроме последнего, проводили при 4°С. Ультратонкие срезы изготавливали на уль­ трамикротоме LKB (Швеция) и просматривали с помощью мик­ роскопа JEM-I00B (Рпония). Культура клеток RPMI-I788 (лимфобластоидная линия кле­ ток периферической крови человека, *^ансформированных виру­ сом Эгаптейна-Барр) и культура клеток Daudi (B-клеточная ли­ ния из лимфомы Беркитта) представлены мононуклеарными клет­ ками с фенотипическими признаками B-лимфоцитов.Культура кле­ ток М0ъТ-4 (Т-клеточный острый лимфобластнвй лейкоз) и ку­ льтура клеток Yurkat (Т-клеточная лимфома) не обладали столь выраженным полиморфизмом, как мононуклеары В-клеточ- ных линий. Хотя для каждой линии характерен некоторый поли­ морфизм, все же можно установить определенный клеточный тип, свойственный данной линии. Электронномикроскопические приз­ наки менее ценны для разделения клеточных линий по проис­ 53 хождению, однако можно выделить несколько характерных приз­ наков, стабильных для изученных линий. О круглое ядро в клетках Т-клеточных линий расположено в центре клетки, вокруг которого в небольшом ободке цитоплаз­ мы наблюдается незначительное количество органелл, а грану­ лярный эндоплазматический ретикулум представлен короткими канальцами, рассеянными по цитоплазме. Розетки гликогена, видимые в электронном микроскопе без специальной обработки, обнаруживаются только в клетках Т-клеточных культур. В B-клеточных линиях цитоплазма занимает значительную площадь, в которой находится ядро изрезанной формы или с глубокой инвагинацией. Гетерохроматин ядра занимает большую площадь по сравнению с клетками культуры M0LT-4 и Yurkat. Количество цитоплазматических органелл, среди которых гра­ нулярный эндоплазматический ретикулум хорошо развит, значи­ тельно больше. Следует отметить, что по развитости элемен­ тов гранулярного эндоплазматического ретикулума в культуре RPMI-I788 можно вццелить клетки с разной степенью выражен­ ности гранулярного эндоплазматического ретикулума, что под­ тверждает данные цитохимических исследований о способности клеток этой культуры при культивировании дозревать до более дифференцированных форм. Большое количество микроворсинок на поверхности клеток характерно для линий B-клеточного про­ исхождения. Таким образом, наиболее подготовлены к активным кон­ тактным взаимодействиям клетки B-клеточных линий. На их по­ верхности имеются многочисленные отростки, на которых можно предполагать наличие разнообразных рецепторов. Если учесть, что клетки всех исследованных культур гетерогенны по проис­ хождению и степени дифференцировки, то можно предвидеть,что спектр их рецепторов довольно широк. На поверхности клеток культуры Daudi конъюгаты РыА-Аи обнаружены в небольшом количестве. Результаты, полученные с помощью конъюгатов другого лектина этой же D-галактозоспе- цифической группы - RCA-AU, почти аналогичны.Конъюгаты RCA- -Аи в виде редких, единичных зерен располагаются на поверх­ ности почти упорядоченно-Конъюгаты WGA-(ovo-Au), связываю­ щиеся с Ы-ацетил-п-глюкозаминозильными сахарными детерми­ 54 нантами рецепторов, располагались на поверхности в виде кластеров. При исследовании B-клеточной культуры RPMI-I788 мы ис­ пользовали только один лектин сои, и конъюгаты SBA-AU И SBA-F выявлены лишь в виде одиночных гранул, следовательно, в гликокаликсе клеток данной культуры N-ацетил-в-галактоза- минозильные детерминанты почти отсутствуют. При изучении локализации поверхностных рецепторов на клетках Т-лимфоидных культур установлено: на поверхности клеток линии MDLT-4 лектин D-галактозоспецифической группы RCA, кокъюгированный с коллоидным золотом, представлен поч­ ти непрерывным слоем гранул, а конъюгаты WGA-AU располага­ ются в виде кластеров. На поверхности клеток культуры Yur- kat конъюгаты НРъ-р, SBA-F, WGA-Au располагаются в виде кла­ стеров, а конъюгаты PMA-AU обнаруживаются лишь изредка на небольшой части клеток. Следует отметить, что расположение рецепторов на повер­ хности клеток В- и Т-лим$юидных культур в основном не зави­ село от функционального состояния подлежащих участков ци­ топлазмы, если судить по наличию в этих участках клетки раз­ личных органелл. Однако в клетках культур Т-клеточного про­ исхождения над активными участками цитоплазмы расположение конъюгатов часто бывает кластерного типа. Таким образом, на поверхности клеток всех исследованных лимфоидных линий выявлены рецепторы, тройные к WGA, причем располагаются они только в виде кластеров. Согласно данным литературы, углеводные сахарные детерминанты, связывающие этот лектин, являются обязательными компонентами гликока- ликса опухолевых клеток.При этом все трансформированные ви­ русом клетки связывают WGA и агглютинируются им, в то время как исходные клетки только связывают WGA, но не агглютини­ руются. Предполагается,что активация тропных к WGA рецепто­ ров происходит лишь после малигнизации клеток. Кроме того, трансформированные клетки закономерно связывают еще три лек­ тина: RCA, SBA, Con А. Дальнейшее изучение распределения рецепторов на лимфо­ идных линиях с расширением набора лектинов будет способст­ вовать обнаружению углеводных детерминант,специфических для клеток разного генеза и степени дифференцировки. 55 РОЛЬ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ЛЕШНОВ В ПРЕОДОЛЕНИИ ГЕМАТОТИОДЧЕСЮГО БАРЬЕРА ПРЕДШЕСТВЕННИКАМИ Т-ЛИ10ОЩТОВ И.Д. Рябинина, И.В. Мирошниченко, A.A. йрилин Институт иммунологии Минздрава СССР, г. Москва Способность мигрировать в тимус является специфическим признаком предшественников Т-лимфоцитов (ПТЛ). Эксперимен­ тальные данные относительно поверхностных структур этих кле­ ток, обеспечивающих преодоление гематотимусного барьера,не­ проницаемо го не только для других клеток, но и для крупных молекул, в литературе отсутствуют /3/. Можно предположить, что ПТЛ обладают суммой свойств по­ верхности, которые обеспечивают их взаимодействие с распоз­ нающими структурами гематотимического барьера. По-видимому, существенным элементом процесса проникновения ПТЛ в тимус является адгезия ПТЛ к клеткам, формирупцим барьер, на ос­ нове взаимного распознавания их поверхностных компонентов. Очевидно, что природа этого взаимодействия должна быть иной, чем в случае хоминга зрелых лимфоцитов в периферические лим- фоидные органы. В качестве одного из возможных механизмов, лежащих в основе миграции ПТЛ в тимус, может быть рассмот­ рено углеводно-белковое лектиновое распознавание, достаточ­ но широко распространенное в биологических системах, что и сделано в данном исследовании. В работе использованы клетки костного мозга нормальных и бестимусных мышей линии ВАЬВ/с, а также гибридов (СВА х х СЭТВь/6) Fj из питомников АН СССР "Центральный"и АМН СССР "Столбовая". Клетки фракционировали методами отрицательной и положительной иммуноадсорбции /I/ с использованием анти­ сывороток к маркеру Т-клеток антигену Thy-1 и маркеру ПТЛ SC—I; в результате получали фракции, обогащенные ранними SC-l+Thy-1~ и поздними SC-1+Thy-1+ ПТЛ.Рецепторы для лек­ тинов определяли с помощью набора лектинов, меченных изот- иацианатом флуоресцеина (препараты предоставлены М.Д. Луци- ком, Львовское отделение Института биохимии им. A.B. Палла- дина АН УССР) методом проточной иммуноцитофлуорометрии на приборе Epix. Для оценки миграции ПТЛ в тимус клетки при­ жизненно метили изотиацианатом флуоресцеина (изомер I,"Sig- 56 ma"), вводили внутривенно мышам, облученным за 3-4 часа в дозе 8,5 Гр, через 3 часа извлекали и суспендировали тимус и методом проточной цитофлуорометрии определяли содержание в суспензии меченых клеток. Прежде чем оценивать роль лектинового распознавания в преодолении гематотимического барьера, следовало определить наличие на поверхности ПТЛ рецепторов для различных лекти­ нов. На рисунке I представлены данные об экспрессии рецеп­ торов для 8 лектинов на клетках костномозговых суспензи*, обогащенных ПТЛ, находящимися на трех стадиях развития. 100 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. I. Сравнение лектиновых рецепторов у ПТЛ разно* степе­ ни зрелости. Обозначения: Рецепторы к лектинам PNA tl), SBA (2), софоры (3), улитки (4),Кон А (5), проростков пшеницы (б), бобовника (7),чечевицы (8). По оси ординат - процент положительных клеток. Наиболее ранние из них,ПТЛ мышей nude, sс-1+Thy-1"-клетки, не испытавшие влияния тимусных гормонов. Следующему этапу соответствуют sc-1+Thy-1~-клетки костного мозга эутимусных мышей - ранние ПТЛ, на которые могли влиять гормоны тимуса, но не вызывали их дифференцировку в более зрелые клетки.На­ конец, поздние sc-i+Thy-i+-imi, образующиеся из ранних ПТЛ после действия на них гормонов тимуса. Все три типа суспен­ зий содержали значительные примеси других клеток, однако различия между ними сводились именно к различию стадий соз­ ревания ПТЛ. Во всех трех типах суспензий содержание рецепторов для некоторых лектинов было одинаковым. Это касается рецепторов для лектинов чечевицы и проростков пшеницы (оба типа рецеп­ 57 8 торов содержатся почти на 100 % клеток), лектинов бобовника и улитки (около 70 %). Содержание клеток, экспрессирупцих рецепторы для Кон А, варьирует без ясной закономерности: на sc-1+Thy-1" -клетках эутимусных мышей оно меньше (около 20%), чем на клетках двух других типов (33-34 %). Рецептор для лектина софоры выражен на единичных клетках (3-5 %) суспен­ зий, содержащих ранние ПТЛ, и на 10 % клеток суспензий, со­ держащих поздние ПТЛ. Вце более существенно аналогичная за­ кономерность проявляется в отношении рецепторов для лекти­ нов сои и арахиса. По мере созревания процент зВА+-клеток увеличивается в последовательности 24, 34, 43,процент РЫА+- клеток - в последовательности 16, 66, 78, что,очевидно, от­ ражает изменение экспрессии соответствующих рецепторов по мере дифференцировки ПТЛ. Поскольку наиболее вероятным фактором,определяющим раз­ витие ПТЛ в костном мозге, является активность циркулирую­ щих гормонов тимуса,мы оценили также влияние препарата гор­ монов тимуса, тимотропина на экспрессию лектиновых рецепто­ ров на ПТЛ. Из рисунка 2 следует, что подобная обработка не влияла на экспрессию рецепторов для всех лектинов, кроме Кон А, агглютининов арахиса и сои, в то время как обработка нейроаминидазой нехолерного вибриона практически во всех случаях усиливала экспрессию рецепторов. Число клеток, не­ сущих рецептор для Кон А, несколько снижалось, число sBA+- клеток возрастало на 5 %, тогда как число РнА+-клеток уве­ личивалось очень существенно (на 23 %) - в такой же степе­ ни, как при обработке нейроаминидазой (на 27 %). Не исклю­ чено, что эффект тимотропина в какой-то степени обусловлен десиалированием активации эндогенных ферментов. В связи с тем, что наиболее закономерные изменения, ин­ дуцируемые тимотропином на поверхности ПТЛ, касались рецеп­ торов для лектинов сои и арахиса и, учитывая, что обработка тимотропином существенно усиливает проникновение ПТЛ в ти­ мус /2/, мы исследовали роль лектиновых рецепторов в мигра­ ции ПТЛ в тимус. Обычно через 3 часа после введения 10 -I07 клеток кост­ ного мозга в тимус проникает 2-5x10^ меченых клеток, т.е. около 0,1 % от введенной дозы. Обработка тимотропином вво- 58 130 120 IIO 100 Рис. 2. Изменение рецепторов под влиянием тимотропина иней- роаминидазы. Обозначения: Рецепторы к лектинам РИА TD, SBA (2), софоры (3). улитки Т4), Кон А (5), проростков пшеницы (6), бобовника (7). Обработка тимотропином т,,,,». нейроаминидазой 114 По оси ординат - изменения процента положительных клеток по отношению к необработанным клеткам, при­ нятым за I0Õ %. димых клеток увеличивает это количество примерно в 2 раза (рисунок 3). Примерно такой же результат дает обработка кле­ ток нейроаминидазой, способствующая, как и тимотропнн, экс­ прессии рецепторов для лектинов арахиса и сои, а также по­ явлению антигена Thy-1, свидетельствующему о переходе ПТЛ на стадию поздних ПТЛ. Блокада рецепторов для лектина сои на клетках костного мозга 5-кратно ослабляла миграцию меченых клеток в тимус, а блокада рецепторов для лектина арахиса ослабляла ее в 10 раз, практически доводя до уровня фона.В обоих случаях бло­ када осуществлялась путем обработки клеток немечеными пре­ паратами соответствующих лектинов. Представленные данные свидетельствуют о различной роли концевых Сахаров мембранных гликопротеинов ПТЛ в преодоле­ нии гематотимического барьера. С наибольшей определенностью можно говорить об участии в этом процессе клеточных рецеп­ торов, имеющих концевой дисахарид fo -галактозил-н-ацетижга- лактозамин, который распознает лектин арахиса (его компо- 59 8* 2 , 0 1,8 1.6 1.4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 I 2 3 5 Рис. 3. Изменение хоминга ПТЛ после различных обработок. Обозначения: без обработки (I), обработка нейроами­ нидазой (2), SBA (31, PNA (4) и тимотропином (5). По оси ординат - индекс стимуляции миграции по отноше­ нию к контролю (необработанные клетки), принятому за I. нент M-ацетилгадактозамин распознает лектин сои). Действи­ тельно, блокада и-ацетилгалактозамина лектином сои лишь ча­ стично подавляет миграцию ПТЛ в тимус, тогда как блокада дисахарида лектином арахиса полностью предотвращает преодо­ ление клетками гематотимического барьера. По-видимому, тот же результат дает блокада этого дисахарида при сиалировании мембранных гликопротеинов. Очевидно, это является причиной неспособности РНА~-зрелых Т-клеток проникать в тимус.С дру­ гой стороны, обращает на себя внимание сходство действия де- сиалирования клеток на поступление ПТЛ в тимус и на захват зрелых лимфоцитов печенью. Возможно, в обоих случаях в рас­ познавании клеток участвуют тканевые лектины со сходной спе­ цифичностью, близкой к специфичности лектина арахиса. 60 Разумеется, лектиновое распознавание не исчерпывает всех механизмов, которые лежат в основе преодоления ЮТ гематоти- мического барьера. Достаточно упомянуть о роли совместимости по некоторым аллоантигенам /2/. Определенную роль в этом про­ цессе играют, очевидно, стадиоспецифические структуры повер­ хности ПТЛ, отсутствие которых препятствует миграции в ти­ мус, например, РКА+-кортикальных тимоцитов. По-видимому, в индукции эксцрессии этих структур состоит (наряду с усилени­ ем экспрессии рецепторов для лектинов арахиса и сои) усили- ващее действие гормонов тимуса на миграцию ПТЛ в тимус. По- видимому, это действие проявляется в двух ситуациях - в кос­ тном мозгу, когда действие циркулирующих гормонов тимуса под­ готавливает ПТЛ к миграции в тимус, и в процессе преодоления гематотимического барьера, когда клетки оказываются в зоне досягаемости тимусных гормонов, что способствует проникнове­ нию их в орган, как бы усиливая целенаправленность процесса при его осуществлении. Л и т е р а т у р а 1. Мирошниченко И.В., Ярилин A.A., Шарова Н.И., Акназа- рова Р.Х., Рябинина И.Д., Филатов A.B. //Иммунология. - 1987. - * 2. - С. 29-32. 2. Ярилин A.A., Мирошниченко И.В., Рябинина И.Д., Фила­ тов А.В.//Бюл. экспер. биол. - 1966. - Р 10. - С. 447-449. 3. Lahey K.D., Pereira G.//Anat.Res. - 1977. - Vol.189. - P. 545. 61 РОЛЬ ЛЕКТИНА ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ПЛАЗМАЛЕМШ КЛЕТОК КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ С КЛЕТОЧЮ-ГОВЕРХЮСТШМИ МЕТАБОЛИТАМИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИГОФТОРОЗА Н.В. Любимова, Е.П. Шувалова, В.М. Лахтин, М.Л. Давлетшина Институт биохимии им. А.Н. Баха АН СССР, г. Москва Работа посвящена изучению первьк этапов взаимоотношений растений и патогенных микроорганизмов на примере системы клубни картофеля - гриб, возбудитель фитофтороза Fhybophtho- га lnfeetans (Monfc.)de3y. Для этого гриба характерно наличие специализированных рас, способных поражать одни сорта карто­ феля (совместимость) и не поражать другие (несовместимость) /7/. Целью исследований являлось: I. Изучение процесса меж­ клеточного распознавания партнеров на уровне взаимодействия препаратов изолированных цитоплазматических мембран расти­ тельных клеток с компонентами клеточной поверхности мицелия патогена. 2. Выявление роли фитолектина в межклеточном узна­ вании и индуцировании устойчивости картофеля к патогену 3. Изучение структурно-функциональной перестройки плазмалем­ мы растительной клетки год влиянием внешних воздействий как фактора, определяющего переход клетки из нативного "неак­ тивного" состояния в "активное" состояние сверхчувствитель­ ности по отношению к воздействию метаболитов патогена. Из клубней картофеля методом аффинной хроматографии на хитине выделен лектин (ЛКЮ в гомогенном состоянии, согласно данным ДДС-електрофореза в ПАГе. Химический анализ показал, что это гидроксипролинбогатый высокогликозилированный (на 50%) гликопротеин, специфически связывающий олигомеры N-аце- тил-Д-глюкозамина, состоящие из 2-5 остатков, связанных по ß -1,4 связям /12, 10/. Установлено, что препарат плазмалеммы из клубней карто­ феля обладает лектиновой активностью, специфичной к N-аце- тил-Д-глюкозамину, аналогично ЛКК /II/. В работе использо­ 62 вали препараты плазмалеммы, выделенные из активированных ра­ невым стрессом тканей клубней картофеля и неактивированных (раневая и нативная плазмалеммы). Методом солевого осмотического шока получены клеточно- поверхностные гликоконьюгаты мицелия несовместимой и совме­ стимой рас гриба /II, 4/. Фракционирование соединений мето­ дом колоночной хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии, ГЖХ и аминокислотный анализ показали (рисунки 1-5), что в состав гликоконьюгатов входят гликопептиды и -глюканы. Гликопеп- тиды имеют мол. массу порядка 2000 Д и содержание углеводов и белков в соотношении 4:1. Углеводная часть молекулы содер­ жит глюкозу и арабиноэу, аминокислотный анализ, наряду с широким набором аминокислот, выявил наличие глюкозамина. р-глюканы имеют мол. массу порядка 6000 Д, не содержат бел­ ка, состоят только из остатков глюкозы, по-видимому, связан­ ных по р -1,3- 1,6 связям, аналогичные известным супрессо- рам возбудителя фитофтороза, подавляющим защитные реакции картофеля на инфицирование патогеном /8/. Взаимодействие препаратов нативной и раневой плазмалемм с суммарными препаратами гликоконьюгатов совместимой и не­ совместимой рас гриба, а также с отдельны«* фракциями глико­ ле пти до в и р-гдеканов изучено по связыванию флуоресцеин-ме- ченых препаратов (рисунок 6), тушению собственной белковой флуоресценции плазмалеммы (рисунок 7), изменению термотроп ных переходов плазмалеммы с использованием флуоресцентного зонда 3-метоксибензантрона (рисунок 8) и подавлению лектино- вой активности плазмалеммы (таблица) /4, 6, 5/. Установлено, что как нативная, так и раневая плазмалеммы взаимодействова­ ли с гликоконъюгатами совместимой и несовместимой рас гриба, фи этом раневая плазмалемма связывала большее количество гликоконьюгатов и была более чувствительна в распознавании метаболитов разных рас, чем нативная. Гликоконьюгаты несов­ местимой расы в большем количестве связывались плазмалеммой, чем гликоконьюгаты совместимой расы. Отмечено четкое разли­ чие в характере тушения флуоресценции плазмалеммы гликопеп- тидами и ß -глюканами (рисунок 9). фи этом глюканы, связы­ ваясь с плазмалеммой, не влияли на ее гемагглютинирующую ак­ тивность, в то время как гликопептиды значительно ее подав­ ляли (таблица). 63 /1 гликопептида ТОО 160 Рис. I. Профиль элоции с сефадекса С-75 гликохоныо- гатов гвтогена: 2 - 6елки0АЫ совместимой расы 4 " ^елки°АЫ несовместимой расы 1,0. 200 250 300 як 200 250 ЭООш Рис. 2. Спектры поглощения в У*-свете глюканов (I) и гликопептнвов ттогена (2): а - совместимая раса; 6 - несовместимая раса GS 9 36 34 32 30 28 26 19 17 15 13 II см- 1 Рис. 3. №факрасные спектры глюканов (I) и гликопептидов (2) совместимой расы патогена Рис. 4. Газожидкостная хроматограмма ацетатов альцонитрилов гликопептида совмести­ мо*' расы патогена после кислотного гидролиза По-видимому, на пяазмалемме имеется как рецепторы-лекти- ны, связывающие по И-ацетил-Д-глюкозамину г лико пептиды кле­ точной поверхности патогена, так и другие рецепторы, не об­ ладающие лектиновой активностью, связывающие р -гжзканы, супрессоры возбудителя фитофтороза. Известно, что воздействие метаболитов патогена или ране­ вого стресса на клубни картофеля проявляется в индуцирова­ нии в растении состояния потенциальной устойчивости к забо- 67 9* Рис. 5. Аминокислотный состав гликопептида совместимой расы патогена леванию /Э/. Можно полагать, что механизм такого действия определяется структурно-функциональной перестройкой расти­ тельной плазмалеммы под влиянием внешних воздействий. Как показали исследования /1-3/, такого рода стрессовые воздей­ ствия вызывали повшение проницаемости плазмалеммы, актива­ цию на уровне транскрипции синтеза плаэмалемных белков, уве- 68 и® Углтш, ш» Рис. 6. Взаимодействие фдуоресцеин-меченых гликоконьюгатов патогена с препа­ ратом нативной плазмалеммы карто­ феля: 1 - контроль (гликоконъюгаты) 2 - гликоконъюгаты несовместимой расы - гликоконъюгаты + плазмалемма совместимой расы личение "текучести" липидного матрикса плазмалеммы вследст­ вие повыпения ненасыценности жирных кислот, активацию мемб- раносвязанных катион-зависимых транспортных АТФаз, много­ кратное увеличение лектиновой активности плаэмалемных вези­ кул /1-3/. На основании полученных данных и анализа литературы мож­ но предположить, что процесс межклеточного распознавания растений и патогенных микроорганизмов осуществляется на 69 Рис. 7. Тушение флуоресценции плазмалеммы (ПИ) картофеля гликоконъюгатами СГК) пато­ гена (в координатах Штерна-Фольмера): 2 - нативная^б * нес0вместим0й Расы 3 - раневая Ш + ГК совместимой расы 4 - нативная Таблица Подавление гемагглютинирующей способности препаратов плазмалеммы из картофеля гликопептидами возбудителя фитофтороза* Глико пептиды Плазмале мма совместимой несовместимой расы расы Нативная 8 20 Раневая 20 100 Примечание: В таблице приведены концентрации гликопептидов (мкг гликопептида/мкг плазмалемного белка), вызывающие заметное ингибирование гемагглюти- нации; даны средние арифметические значения трех независимых опытов. 70 1 e»£ /я 3 1000-Г1-IT' Рис. 8. Изменение флуоресценции зонда 3-метоксибензантрона в препа­ рате раневой плазмалеммы кар­ тофеля под действием глико­ коньюгатов патогена (в коор­ динатах Аррениуса): 1 - плазмалемма (контроль) 2 - гликоконьюгаты совмее- тимой расы 3 - гликоконъюгаты несов­ + плазмалемме местимой расы уровне взаимодействия мембраносвязанных компонентов расти­ тельной клетки с клеточно-поверхностными метаболитами инфек­ ционной гифы гриба, посредством лектин-углеводного связыва­ ния. Вследствие межклеточного узнавания метаболизм расти­ тельной клетки претерпевает значительные изменения. Важное место в этих процессах занимает структурно-функциональная перестройка ее плазмалеммы, которая, очевидно, приводит к повыпению чувствительности клетки в распознавании метаболи­ тов гриба и быстрому включению защитной реакции сверхчувст­ вительности. В совместимой комбинации супрессоры гриба, ком­ плементарные поражаемому сорту растения, подавляют механизм активации клетки, возможно, также посредством рецепции на растительной плазмалемме. Предполагается, что синтез плаэма­ лемных белков-рецепторов, по-видимому, активируется процес- 71 1,1 1,05 2» 50 УлиминСшг/мО Рис. 9. Тушение флуоресценции раневой плазмалеммы картофеля гликопептидами и - глюкалами патогена (в координатах Штерна-еольмера): 1 - совместимой расы 2 _ гликопептиды несовместимоя расы 3 - совместимой расы р -глюканы 4 - несовместимой расы сом межклеточного распознавания партнеров или раневым стрес­ сом. Л и т е р а т у р а : 1. Любимова Н.В., Верулидзе Г.Р. // Биохимия. - 1984.- Т. 49. - # 5. - С. 781-786. 2. Любимова Н.В., Верулидзе Г.Р., Метлицкий Л.В. // Фи­ зиология растений. - 1987. - Т. 33. - I. - С. 135-142. 72 3. Любимова H.B., Лахтин В.М., Бинюков В.И., Шувалова Е.П. // Приклад, биохимия и микробиология. - 1988. - Т.24. - I. - С. 102-109. 4. Любимова Н.З., Лахтин В.М., Шувалова Е.П. и др. // Физиолог, растений, 1988. - Т. 35. 5. Любимова Н.В., Салькова Е.Г. // Приклад, биохимия и микробиология. - 1988. - Т. 24. 6. Мерзляк М.Н., Кашулин П.А., Любимова Н.В. и др. // Тезисы Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологи­ ческих мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и ре- цепторных процессов". - Минск, 1988, 23 мая - I июня. 7. Метлицкий Л.В., Озерецковская 0. Л. Фитоалексины. - М.: Наука, 1973. - 175 с. 8. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Леонтьева Г.В. и др. Фактор расовой специфичности возбудителя фитофтороза // УЬЯ, АН, СССР, сер. Биологическая, 1982. - Т. 6. - С.852-866. 9. Furulcni К,, Tomiyama К., Boke N. //Phy topabholv-1979. - Vol. 69, - N 7. - P. 754-736. 1 . Hobst G.-J.j Martin S.R., Allen A.K. et al. //Blochen,. J, - 1986. - Vol. 233. - N 4. - P. 731-736. IT. lakhbin V.M., Lubimova U.V. // Lec bin-carbohydrate in­ teraction under potato blight. - Proceedings of the 9fch In­ ternational Symposium on Glycoconjugates, Lille, July 6-11, 1987, - G. 18. 12. Matsumoto I., Jimbc A,, Mizuno Y. et al. Purification and characterization of potato lectin // J. Biol,Chem.-1983. - Vol. 25s. - N 5. - p. 2886-2892. B3AИЮД ЕЙСТВИЕ ЛЕКТИНА ИЗ КАРТОФЕЛЯ С ГЛИКОШЛИМЕРАМИ OOBTHBBACTBRIUM SSPEDONICUM PSEUDOMONAS SOLANACEARUM Л.Д. Варбанец !-&ститут микробиологии и вирусологии им. Д.К . Заболотного АН УССР В последние годы обсуждаются вопросы участия гликополи­ меров в процессах узнавания при инфицировании растений. Ана­ логично животным, явление узнавания в растениях может вовле­ кать комплементарное взаимодействие гликополимеров одного из организмов с лектинподобным компонентом другого. Биологи­ ческие функции лектинов во взаимодействии хозяин-паразит до 73 Ю сих пор не ясны, но известно, что эти механизмы имеют адап­ тированный характер и способствуют созданию устойчивости растения к заражению микроорганизмами. То есть одна из функ­ ций лектинов может заключаться в том, что аналогично иммун­ ной системе иммунокомпетентных организмов, они фиксируют па­ тогенные микроорганизмы и тем самым способствуют их разруше­ нию. Эта крайне важная линия защиты растений только в редких случаях нарушается фитопатогенами, что приводит к развитию инфекционного процесса. Поскольку Corynebacfcerium sepedonicum и Pseudomonas so- lanacearum являются патогенами картофеля, нами из клубней картофеля был выделен лектин и исследовано его взаимодейст­ вие с полисахаридами, липополисахаридами и внеклеточными гли ко полимерами. Полисахариды (ПС) из С.sepedonicum были выделены мягким щелочным гидролизом клеток с дальнейшим осаждением спиртом и очисткой ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-ТСК геле /I/. Липополисахариды (Л1Е) экстрагировали из клеток P.soianacea- rum 45% водным фенолом при 65-68°С (2 ч). Для выделения 0-специфического полисахарида и фракций ЛПС гидролизовали 1% уксусной кислотой (100°С, 2 ч). Осадок липида отделяли центрифугированием (25 ООО х g , 40 мин), а супернатант концентрировали до объема ~ 10 мл и фракционировали на колонке (70,0 х 3,0 см) с сефадексомГ-50, используя 0,025 М пиридин-ацетатный буфер, pH 4,5. Внеклеточные гликополимеры фракционировали ионообменной хроматографией на колонках (90,0 х 2,0 см) с ДЭАЭ-ТСК гелем. Было получено 3 фракции гликополимеров, элюирующихся буфером различной ионной силы (0,01 М; 0,25 М и 0,50 М NaHgPO^, pH 6,0): нейтральный гликополимер (ГП I) и два заряженных (ГП 2 и ГП 3). lb учение ПС, изолированных из с.sepedonicum 7756 и 7757, показало, что повторяющееся звено их представлено гек- сасахаридом, состоящим из четырех остатков рамнозы, одного остатка фукозы и одного - р> -гексуроновой кислоты. Внеклеточ­ ные гликополимеры этих штаммов содержали в своем составе глюкозу, фукозу, арабиноэу. В ЛПС P.solanacearim в качестве нейтральных моносахари­ 74 дов обнаружены рамноза, рибоза, ксилоза, глюкоза, гептоза в соотношении 2,1:0,37:0,26:0,36:0,30, а также следы фукозы. Глюкозамина содержалось 8,25%. Внеклеточные гликополимеры P.aolanacearum: исходный, ГП I, ГП 2, ГП 3 содержали в качестве преобладающего моноса­ харида рамнозу, в меньших количествах - глюкозу, галактозу, маннозу, ксилозу, фукозу в различных соотношениях. В составе всех исследованных гликополимеров обнаружены глюкозамин и галактозамин, однако соотношения их различны: в ГП I -1:1, ГП - 2 - 1:3,4, ГП 3 и в исходном ГП - 1:20,0 и 1:22,0 соот­ ветственно. Лектин из картофеля был выделен, как описано ранее /4/. Исследования показали, что ПС и внеклеточные гликополи­ меры С.sepedonicum, а также ЛПС P.Bolanacearum и его от­ дельные компоненты - О-специфический полисахарид и кор-оли- госахарид в концентрациях от 2,0 мг до 0,8 мкг не тормозят агглютинацию эритроцитов лектином из картофеля. Иэ данных литературы /5/ известно, что лектин картофеля агглютинирует ЛГК как вирулентных, так и авирулентных штам­ мов, хотя последние слабее, а экзополисахарид (ЭПС) виру­ лентных штаммов подавляет агглютинацию. В связи с этим нами было исследовано взаимодействие внеклеточного гликополимера P.aolanacearum и его фракций с лектином из картофеля и по­ казано, что все они тормозят реакцию гемагглютинации эритро­ цитов кролика в присутствии лектина: минимальная ингибирую- щая доза (в пробе) составляла для исходного ГП - 0,08 мкг, ГП I и ГП 2 - 0,01 мкг, а ГП 3 - 0,7 мкг. Одна иэ функций лектинов растений - защитная, поэтому при взаимодействии с авирулентными фитопатогенными штаммами они их связывают в результате реакции Сахаров ЛПС с лекти­ ном, что приводит к иммобилизации патогена, и растение в дальнейшем не инфицируется. В присутствии же внеклеточного гликополимера, которьй взаимодействует с активный центром лектина, агглютинации ЛПС лектином не происходит. Поэтому возможно, что роль внеклеточного гликополимера в индукции заболевания заключается в том, что, находясь за пределами бактериальной клетки, он взаимодействует со всеми 75 10* доступными участками на лектине растения и тем самым способ­ ствует патогену свободно размножаться во внутриклеточном пространстве растения и синтезировать новый внеклеточный гликополимер, который будет связывать следующую молекулу лектина. Возможно даже образуется комплекс лектина с глкко- полимером, токсичный для растения, который и вызывает увяда­ ние. Такое предположение согласуется с отсутствием синтеза внеклеточного гликополимера шероховатыми мутантами /3/, яв­ ляющимися авирулентными. Л и т е р а т у р а : 1. Варбанец Л.Д. Структурно-функциональные исследования полисахаридов Corynebacteriuin jbichiganense subsp. sepedoni­ cum // Микробил. журн. - 1987. - 5. - С. 22-27. 2. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К. Почетнова. - М.: Мир, 1967. - 512 с. 3. Drigues Р., Bemery-Lafforgue D., Fr igale t A., ,Dupin P., 3amain В., Asselineau J. Comparative studies of lipopoly- saocharide and exopolysaccharide from a virulent strain of Pseudomonae aoianacearmn and from three aviruier.t mutante // J. bacterid. - 1985. - Vol. 162. - tr 2. - P. 504-509. 4. Methods in ünzymology. Sd. Ginsburg. - 1978. - Ac. Press N-Y, S~E, L. - P. 340-345. 5. Sequteira L., Graham T. Agglutination of avirulenb strains of Pseudomonas phaseolicola by potato lectin // Phy­ siol. Plant Pathol. - 1977. - Vol. 11. - N 1. - P. 43-54. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ ВОЗБУДИТЕЛЬ ФИГОФТОРОЗА-КАРТОФЕЛЬ НА УРОВНЕ ЛЕКТИНОВ Б.Б.-О. Громова Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений, г, Ленинград В последнее время все чаще встречаются публикации, по­ священные особой группе белков и гликопротеидов со специфи­ ческими свойствами - агглютинировать клеточные элементы крови лектинами. 76 Несмотря на широкий фронт работ по изучению лектинов, к ним продолжает проявляться интерес, поскольку все еще недо­ статочно ясна их роль в растении. Мы остановимся на значении лектинов во взаимоотношениях патоген-растение-хозяин, В 1950 г, Erupe было установлено, что фитолектины распо­ знают слабые различия в структуре углеводов. Это послужило основанием для предгюложения о включении их в процессы кле­ точного узнавания - взаимодействия не только между клетками растения, но и между клетками микроорганизма и растения. Це­ лая серия исследований связывает с эндогенными лектинами проявление защитных механизмов организма, которые выражаются якобы в блокировке патогена, осуществляемой лектинами хозяи­ на. Подобные исследования касаются в основном бактериальных и вирусных патогенов. Они базируются на предположении, что агглютинины бобовых участвуют в присоединении азотфиксирую- щих бактерий к корням растений. Исследования, отражающие роль лектинов растения в проявлении устойчивости к фитопато­ генным грибам, полны противоречивых сведений. Так, в одних случаях защитные механизмы лектинов проявляются в ингибиро- ваиии прорастания спор, роста гиф, синтеза клеточных стенок грибов, лизисе зооспор, агглютинации прорастающих цистоспор грибов. В других случаях, несмотря на то что лектины не про­ являют перечисленных свойств, действие их тоже трактуется как защитное, но уже не благодаря прямому действию на пато­ генный микроорганизм, а в результате подавления комплемен­ тарного взаимодействия между полисахаридами клеточных стенок патогена и лектином клеток хозяина. Каковы же функции лектинов в системе микро-макроорганиэм на молекулярном уровне и, в частности, в системе картофель - Phyfcophfchora Infes bans Mont. de Вагу? Для определения свойства устойчивости картофеля к возбу­ дителю фитофтороза используют клубни и листья. Следователь­ но, необходимо установить значение лектинов листьев и клуб­ ней во взаимоотношении патоген-хозяин. О наличии лектинов в клубнях картофеля имеется ряд публикаций, факт наличия лек­ тинов в листьях необходимо было установить и изучить их свойства и функции. Проведенньми исследованиями были идентифицированы эри- 77 троагглютинины в соке листьев картофеля, в различных фракци­ ях белков: водорастворимых, полученных аммонийносернокислым фракционированием, в белках мембран хлоропластов. Кроме то­ го, в белках грибницы возбудителя фитофтороэа картофеля так­ же были индентифицированы агглютинины. В связи с тем, что вопросы паразитизма решались нами на основании представления об иммунохимическом сходстве белков фитопатогена и растения, представлялось необходимым диффе­ ренцировать антигены, образующие в перекрестной реакции по­ лосы преципитации, ответственные за проявление сходства аг­ глютининов картофеля и патогена. Для выделения лектинов были использованы методы ионооб­ менной и аффинной хроматографии. Данные, полученные в ре­ зультате колончатой хроматографии, свидетельствуют о гетеро­ генности лектина. Так, после ДЕАЕ-хроматографии было получе­ но четыре группы эритроагглютинирующих элюатов. Электрофоре- тический анализ этих элюатов выявил гетерогенность каждого и различия по электроподвижности. Объединенные после ДЕАЕ-хро­ матографии агглютинирующие элюаты, нанесенные на колонку с КМ-целлюлоэой, образовали один пик (ЛЛЦ). ЛЛЦ при электро­ графическом исследовании разделились на четыре фракции. Лек- тины листьев, полученные методом аффинной хроматографии на овальбумине из белка куриного яйца (Л/01 в геле агар-агара в веронал-ацетатном буфере, pH 8,55, разделились на четыре компонента, проявив при этом самую низкую подвижность. Сум­ мированные результаты электрофоретического разделения после хроматографии на целлюлозах и овогеле показали, что компо­ ненты лектинов по электроподвижности соответствуют почти всем компонентам водорастворимых белков с катодной подвижно­ стью. Преципитирующая активность лектина позволит осущест­ вить их иммунохимический анализ, в результате была выявлена более сложная структура ЛЛЦ. Обнаруживаются компоненты не только в катодной части иммунофореграммы, но и в анодной. Иммунологический анализ лектинов, выделенных аффинной хрома­ тографией на овогеле, свидетельствует о том, что это доволь­ но сложная группа. Четко выявляется основная часть с низкой 78 подвижностью в геле агар-агара (Л/О) и группа (ЛД)-2), не­ значительно представленная в количественном отношении. Кроме того, установлено, что два электрофоретических компонента лектина клубней, обнаруживаемые в ШАГ и невыявляемые при разделении в агаре, были проявлены при иммунофорезе и оха­ рактеризованы как гетерогенные структуры. Таким образом, анализ лектинов листьев и клубней выявил их различия в электрофоретических и иммунохимических свойст­ вах, хотя имеются и сходные структуры. Кроме того, исследо­ вания с использованием конкурентного ингибирования биологи­ ческой активности показали, что лектины листьев и клубней несколько отличаются и по углеводной специфичности. Извест­ но, что гаптеном лектина клубней являются олигомеры N-аце- тил-Д-глюкозамина. Мы определили, что гаптеном лектинов лис­ тьев является мономер этого аминосахара. Немаловажной характеристикой для познания свойств лекти­ на является его функциональная активность. Наши исследования показали, что в выделенных агглютинирующих биополимерах лис­ тьев и клубней картофеля обнаруживается ферментативная ак­ тивность, например,в ЛЛЦ - пероксидазная активность. Из шести определяемых ферментов в Л/0 было установлено наличие эсте- разной и пероксидаэной активностей. Наряду с указанными свойствами, было установлено, что лектинам из листьев картофеля свойственна функция ингибиро­ вания. Нами впервые выделен ингибитор трипсина (ИГА) иэ лек­ тинов листьев методом аффинной хроматографии на трипсин-ага- розе. ИГА из лектина агглютинирует эритроциты, при электро- форетическом исследовании он представлен двумя компонентами, которые по подвижности соответствуют двум из четырех компо­ нентов лектинов с овогеля. Аналогичную подвижность проявляет также ИГА, выделенный из суммарной фракции белков листьев. Сходные с Л/0 и с ИГА эритроагглютинирующую активность и электрофоретическую подвижность, выявляемые при иммуноэлект- рофорезе, обнаруживает ингибитор химиотрипсина (ИХА), выде­ ленный из суммарной фракции белков листьев. Для выявления роли лектинов во взаимоотношениях с фито- патогеном на молекулярном уровне необходимо установить обна­ руживают ли они иммунохимическое сходство с биополимерами 79 патогена и какова доля гас участия в этом взаимодействии. Бы­ ло установлено, что при взаимодействии с сыворотками к раз- ньм расам возбудителя фитофтороза, отличающихся генотипом, не выявляется специфики. Во всех случаях иммунохимически сходными с патогеном оказались отдельные компоненты ЛЛЦ, со­ ответствующие по гюдвижности фракциям, характерным роду So­ lanum. При этом спектры сходства лектинов листьев как с эн­ догенными мицелиальными, так и с э крацеллюлчрными белками патогена, были похожи. В противоположность ЛЛЦ основные ком­ поненты Л/0 не выявляли иммунохимического сходства с протеи­ нами возбудителя фитофтороза. Основные компоненты ИГА и ИХА также не были сходны с патогеном. Иммунохимически сходными с биополимерами патогена оказались лектины клубней (ЛК-Э*- 100). При этом спектры сходства с патогеном у агглютинирую­ щих и неагглютинирующих биополимеров клубней совпадали. Кроме того, что было обнаружено иммунох: имиче с кое сходст­ во на уровне лектинов растения и биополимеров патогена, представлялось целесообразным выявить, участвуют ли лектины растения в ответной реакции на заражение фитопатогеном. При сравнении количественных изменений лектинов листьев на зара­ жение растения разными расами в пределах одинаковых по раст­ воримости белков наблюдаются изменения, не связанные с виру­ лентностью патогена. Например, в цитоплазматических и вакуо- лярных белках при заражении расой 4 и I. 2. 3. 4 наблюдается, увеличение титра агглютинации в сравнении со здоровыми рас­ тениями, в то время как в периферических мембранных белках происходит снижение титра в обоих случаях. Причем, чем боль­ ше усиливается синтез лектинов в одних белках, например, ва~ куолярных, тем значительнее снижается в других - мембран­ ных. По-видимому, процессы в клетке зараженного растения, происходящие на уровне синтеза лектинов, направлены на ста­ билизацию метаболизма до уровня здорового растения. Исследования свидетельствуют также о локализации лекти­ нов в большинстве электрофоретических компонентов белков листьев и клубней картофеля, о том, что лектины ответственны за проявление неспецифического взаимодействия между патоге­ ном и растением. Хотя мы располагаем ограниченными данными, можно допустить, что в распознавании, а также в проявлении 80 совместимости патогена и растения (в частности, возбудителя фитофтороза и картофеля) немаловажное значение имеют лекти- ны-ингибиторы, которые могут инактивировать протеинаэы пато­ гена, предотвращая проявление паразитизма, или осуществлять регуляцию взаимоотношений в системе патоген-хозяин. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕКТИНОВ ППЕНИДО A.M. Ямалеев. A.A. Ямалеева, З.В. Петрова Отдел биохимии и цитохимии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР Всеобщность распространения и широкий набор функций лек­ тинов позволяют предположить об их защитной роли в растени­ ях, выполняющих в данном случае функцию неспецифической за­ щиты от болезней грибного происхождения. Как известно, успех селекционной работы по иммунитету пшеницы к грибным болезням во многом связан с быстрым прогрессом в области растительной молекулярной биологии, в частности лектинов, которые функ­ ционируют в процессах, идущих с участием межклеточного узна­ вания (растение-хозяин-патоген). Биохимические свойства аг­ глютининов зародыней пшеницы широко описаны. Однако свойства агглютининподобного белка взрослых растений до настоящего времени исследованы слабо. Кроме пшеницы, лектины также идентифицированы в листьях и корнях несколько других видов растений. Иммуноцитохимические исследования показали, что как в зародыпах, так и во взрослых растениях лектины сосре­ доточены в органах, которые находятся в почве во время про­ растания,роста и развития. Установлено, что лектины большей частью расположены в поверхностных слоях этих органов. Инте­ ресно отметить, что связь между лектинами корня и листа и лектинами семени все еще находится под вопросом, потому что белки могут проявлять значительные биохимические различия. Чтобы лучше понять функции лектинов пшеницы и контроль их экспрессии, мы иммунохимически охарактеризовали агглютинины зародышей в связи с геномньм составом ппеницы. Трехгеномный гексаплоид T.aeetlvum (мягкая ппеница) яв­ ляется основным хлебом человечества. Исходя из огромной важ­ ности задачи борьбы с возбудителями грибных болезней этой 81 11 пшеницы путем создания устойчивых сортов, все больше возрас­ тает роль редких видов гшеницы и ее диких сородичей с раэнъ*«. геномным составом. Так, донорами первого генома (А) поли­ плоидных пшениц считаются Т.отarbu, T.monococcum, T.boeobl- cum. Современные культурные пшеницы принадлежат главным обра­ зом к двум полиплоидным видам - Т.durum и T.aestlvum. Пер­ вый относится к тетраплоидньи пшеницам и имеет геномную фор­ мулу ААВВ, второй - к гексаплоидам с геномной формулой ААВВДД. Итак, образование лектинов в развивающемся зерне происходит под контролем одного (у диплоидной пшеницы), двух (у тетраплоидной пшеницы) или трех геномов (у гексаплоидной пшеницы) при участии разных тканевых и клеточных структур. Методом двойной иммунодиффузии были изучены лектины пше­ ниц Т.urarbu, T.boeotlcum и T.monococcum - представителей генома А. При проявлении антисыворотяой на Т.fclmopheevLl в спектре лектинов T.monococcum и T.boeotlcum выявляется по 5 компонентов. Интересно отметить, что в этих спектрах линии идентичны как го числу, так и по интенсивности. В белках Т.urarbu в аналогичных условиях выявляются 3-4 компонента, два из которых проявляются очень интенсивно, фи проявлении этих антигенов сывороткой на T.peraicum выясняется следую­ щее: в спектре лектинов т.urarbu выявляется пять компонен­ тов, два из которых не обнаруживаются в белках T.boeotlcum и T.monococcum. Следует отметить, что спектры T.monococcum и T.boeotlcum при проявлении антисывороткой на T.perelcum отличаются наличием перекрестов, что говорит о некоторой их специфичности. Таким образом, иммунохимический анализ лектинов из семян доноров генома А пшеницы показывает, что по характеру, числу и интенсивности белковых компонентов наибольшую идентичность проявляют к T.tlmopheevll (AAGG-) лектины T.boeotlcum и T.monococcum, тогда как спектр лектинов Т.urarbu несколько отличается от них и проявляет большую гомологию с тетра­ плоидной ппеницей (геномный состав ААВВК С другой стороны, идентичность T.boeotlcum и T.monococcum по антигенному со­ ставу свидетельстсует о том, что оба эти вида имеют общий геном. Последнее подтверждается исследованиями спиртораство- римых белко в-глиадино в. Сравнительный анализ лектинов из семян доноров генома В (Ae. longisaima, Ae. speltoides, Ae.blcornis, Ae.sharonen- sis дал возможность выявить их гетерогенность и специфич­ ность. Сыворотка на лектины T.timopheevii выявляет наи­ большее число компонентов среди изученных видов эгилопсов в спектре лектинов Ae.apeltoidea. При проявлении данной сыво­ роткой наибольшую идентичность обнаруживают лектины Ae.loo­ gisa ima, Ae.blcornis, Ae.sharonenais. У них проявляется оди­ наковое число компонентов, хотя и отмечено некоторое пере­ распределение в интенсивности и расположении линий. Таким образом, иммунохимический анализ лектинов Ae.speltoides и других доноров генома В ппеницы сывороткой на T.timopheevii позволяет судить об их филогенетической близости, т.е. в становлении T.timopheevii с генотипом AS участвовал Ае. speltoides, внесший в этот генотип геном &. Сравнительный иммунохимический анализ лектинов различных доноров генома пшницы позволил выяснить следующее: в лекти- нах Ae.tauachii (геном Д) гомологичной сывороткой выявляет­ ся 5 компонентов, наиболее интенсивными из которых являются первый, третий и четвертый от старта компоненты в иммунодиф­ фузии. Несколько обедненными при этом оказались спектры А е. longissima (геном В) и T.urartu (геном А). Заслуживает вни­ мания, что четвертый компонент Ae.tauachii сильно проявля­ ется также в спектре T.urartu и очень слабо в лектинах А е. longlselma. Таким образом можно заключить, что доноры разных геномов гексаплоидной ппеницы обладают специфичными спектра­ ми иммунопреципитации. Были исследованы также между собой лектины Ae.speltoides, T.timopheevii, Т. persicum, Ae. longissima. При прояв­ лении лектинов вшеуказанных видов сывороткой на белки T.ti­ mopheevii в гомологичных белках выявляется 5-6 компонентов. В спектре Ae.apelfcoides обнаруживаются медленно движущиеся интенсивные линии. Однако, одна очень четкая линия быстрой подвижности отсутствует в спектре лектинов T.timopheevii, но присутствует в лектинах Ae.speltoides. Возможно этот белковый компонент маркирует геном A. T.timopheevii. Лекти­ ны Т.persicum и Ae.longisalma сывороткой T.timopheevii проявляются менее гетерогенно. В их спектрах отсутствует 83 11* компонент, специфичный для генома &. Иммунохимическая дифференциация геномов А, AB, AS- по лектинам дала следующие результаты. Антисыворотка на гекса- плоидную пяеницу Московская 35 полным набором ААВВДЦ в гомо­ логичных реакциях дает наиболее богатый спектр. Сходные спектры выявляются в лектинах T.spelfca. Сравнительно более близкими по идентичности и характеру спектрами вслед за T.spelfca обладают Т.persicum, затем T.urartu. Спектры T.monococcum и T.timopheevii дали данной сывороткой обед­ ненное число компонентов, что указывает на некоторую фило­ генетическую отдаленность этих видов. Был проведен сравнительный иммунохимический анализ лек­ тинов генома Д, Геномов AB и АВД в связи с устойчивостью их к пыльной и твердой головне. Лектины представителей генома Д, AB, АВД при проявлении антисывороткой на гексаплоидную пшеницу обнаруживают гетерогенные и специфичные спектры. Все три представителя гексаплоидкых пшениц - Московская 35, Сан- зар, T.spelta - дают между собой наиболее сходные спектры. Данной сывороткой устойчивый к пыльной и твердой головне сорт Санзар-2 дает наиболее богатый спектр. Среди изученных гексаплоидных пшениц более обедненным спектром обладают лек­ тины T.spelfca, который характеризуется восприимчивостью к головневым болезням. Спектры лектинов Т.persicum, T.turgidum и Т. fcimonovum очень сходны между собой: практически все выявленные данной сывороткой компоненты идентичны, что говорит о близости про­ исхождения их геномов. Следует отметить, что проявляющиеся очень интенсивно в спектре лектинов Ae.fcauscbil (геном Д1 компоненты, практически отсутствуют в лектинах представите­ лей геномов AB при проявлении сывороткой на геном АВД. Таким образом, в результате иммун ох имиче с ко г о анализа лектинов доноров геномов ппеницы были обнаружены различия между ними как по специфичности, так и по гетерогенности белковых компонентов. Тетраплоидные виды пшеницы по лектинам четко распределяются на две группы соответственно их геном­ ному составу, фи изучении видов пшеницы наблюдаются так­ же различия и внутри геномных групп. В литературе имеют­ ся сведения о том, что пшеница и ее дикие сородичи с раз­ 84 ным геномным составом обладают высокой консервативностью ге­ нов 5g ДНК и рДНК, имеющих важное функциональное значение. Применительно к лектинам работы в этом плане имеют важное значение для решения актуальных проблем происхождения, гене­ тики и селекции пшеницы. ВЛИЯНИЕ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫШЕЙ ППЕНИЦЫ (АЗП) НА НЕКОТОРЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ АССОЦИАТИВНОГО АЗОТФИКСИРУЩЕГО МИКРООРГАНИЗМА AZOSPIEILLÜM BRASILENSE М.А. Галкин Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Академии наук СССР, г. Саратов Способность азоспирилл фиксировать молекулярный азот влияет на физиологию культурных злаков, ассоциированных с ни­ ми. Изменение азотфиксирующей активности (АА) под действием высокомолекулярных веществ растительного происхождения по­ зволяет судить о степени взаимодействия партнеров и имеет важное практическое значение, позволяя вести скрининг сортов по максимальному выходу эффектора, увеличивающего АА, в ри- зоплан и ризосферу. Удобной моделью для изучения влияния вы­ сокомолекулярных веществ, выделяемые ппеницей, на процесс аэотфиксации у азоспирилл может служить агглютинин зародыпей пшеницы (АЗП), возможность выхода которого в ризосферу и его присутствие в ризоплане убедительно доказано в работах /6, 7/. Большинство работ, посвященных влиянию лектинов на фи­ зиологию клетки, выполнены на эукариотических объектах, од­ нако в нескольких публикациях рассматривается подобное влия­ ние лектинов на микроорганизмы. Так, в работах /5, 9/ пока­ зано активирующее воздействие Сon А на рост Bacillus cereus, потребление кислорода, активность дегидрогеназ и фосфатаз, <*. -глюкозидазы и продукцию Ц-ГМФ. Взаимодействие ФГА с неко­ торыми фитопатогенными микроорганизмами исследовалось в ра­ боте /3/, где показано, что небольшие концентрации лектина значительно увеличивают продукцию Ц-ГШ и активность де­ гидрогеназ. Наконец, ранее нами была показана высокая актив­ ность АЗП гю отношению к процессу аэотфиксации у A.brasilea­ se Sp7. Сходный эффект обнаружен для лектиноподобных бел­ ков риса /8/. 85 Суммируя данные о физиологическом действии лектинов на клетку,представляется уместным привести цитату из монографии М.Д. Луцика /2/: "... лектины выполняют роль информативных молекул, передающих сигнал внутрь клетки и вызывающих сдвиги в метаболизме". Целью настоящей работы было изучение влияния АЗП на АА и ряд культуральньк параметров (pH, pOg, фаза роста), связан­ ных с процессом аэотфиксации у A.brasilenae Sp 245. Штамм A.brasilenae Sp 245 был получен из группы коллек­ ционных культур ИБФРМ АН СССР, АЗП получали по методике, предложенной для группы растительных белков лабораторией биохимии ИБФРМ АН СССР. В качестве контрольного белка ис­ пользовали BSA (Serva),Культивирование микроорганизмов, до­ бавление лектина и оценку аэотфиксации проводили, как опи­ сано ранее /I/. АА выражали в мг Я2/Мг сухих веществ (с.в.) суспензии/сутки. Было установлено, что АЗП стимулирует процесс аэотфикса­ ции у A.brasilenae Sp 245, причем наблюдаемый эффект макси­ мален при концентрации лектина, равной 0,5-1 мкг/мл, а сам вид зависимости (рисунок I) напоминает зависимость, получен­ ную для A.bras Lieпае Sp7 /I/. При 30-минутной преинкубации АЗП с 5% раствором Н-ацетил-Д-глюкозамина эффект исчезал. Исследования показали, что обнаруженный эффект для A. brasi- lenee Sp245 максимален в середине логарифмической фазы рос­ та культуры и практически исчезает к началу стационарной фа­ зы (рисунок 2). Это хорошо согласуется с литературными дан­ ным /I/. Из литературы /4/ известно, что оптимум парциального давления кислорода pOg для аэотфиксации у азоспирилл равен 0,015 атм. Было изучено ингибирующее влияние кислорода, со­ держащегося в газовой фазе, на процесс аэотфиксации в при­ сутствии АЗП в концентрации 0,5 мкг/мл. Кислород вводился в количестве 5 и 10% от общего содержания газов. Результаты показывают, что если 5% содержания Og приводит в контроле к уменьшению АА др 0,123 мг Kg (мг с.в.) сут., а 10% его со­ держание полностью блокирует процесс аэотфиксации, то в при­ сутствии АЗП АА оказалась равной соответственно 0,283 и 0,073 мг Ng /I мг с.в./сут. BSA , добавляемый в среду в 86 3 2 / / 3 V Рис. I. Зависимость аэотфиксирующей активности (AA) A.braallenae Sp 245 от концентрации АЗП (I) и BSA (II) /И \_rtfА[/М c.i./сУГ] I\l [ка/М ЛД *г JL — 1 3 1 7 ? 5 з То 7 S ^ ^ ^ 7 Л? ^ /, Рис. 2. Зависимость аэотфиксирующей активности (АА) в присутствии 0,5 мкг/мл АЗП от возраста культуры A.brasilenae Sp 245. AA - (I). Количество клеток в мл - N (II) Рис. 3. Зависимость аэотфиксирующей активности (AA) A.braailense Sp 245 в присутствии 0,5 мкг/мл АЗП от pH среды культивирования той же концентрации, подобного эффекта не вызывал. Была установлена зависимость активирующего воздействия АЗП в концентрации 0,5 мкг/мл на АА от pH среды культивиро­ вания (рисунок 3). Существование эффекта активации процесса аэотфиксации у аэсспирилл в присутствии АЗП в достаточно широком диапазоне pH культуральной среды (5-7,5) и вид зависимости эффекта от pH позволяют предположить, что электростатические взаимодей­ ствия "микроорганиэм-лектин" не играют существенной роли в механизме возникновения эффекта. Отсутствие вышеописанного эффекта при преинкубации лектина с гаптеном ( N-ацетил-Д- -глюкозамин) свидетельствует об известной специфичности процесса взаимодействия АЗП с микроорганизмами, а зависи­ мость степени усиления АА от возраста культуры наводит на мысль о лабильном характере связывания АЗП поверхностными структурами микробных клеток. В заключение автор выражает благодарность сотруднику группы растительных белков лаборатории биохимии ИБФРМ АН СССР Семенову С.В. за помощь в выделении АЗП. Л и т е р а т у р а 1. Галкин М.А., Никитина В.Е. и др. // ГТрикл. биохимия и микробиология. - 1987, ХХШ. - Вып. 3. - С. 389-391. 2. Луцик М.Д., Панасюк Е.М., Луцик А.Д. Лектины.- Львов: Изд-во Львов, ун-та, 1981. - С. 76. 3. Casterea&na М.С. et al. // J. Phytopathol. - 1987. Vol. 149. - Я 4. - P. 345-358. 4. Hartman A. et al. // J. Bacteriol. - 198?. - Vol.169. - N 3. - P. 944-948. 5. Lau T.M., Chan K.Y. // Microbios. - 1984. - Vol. 39.- P. 137-150. 6. Miahfcind M., Palevitz B.A., Raikhel N.V. // Set. - 1983. - Vol. 220. - N 4603. - Р. 1290-1292. 7. Stinisaen H.M., Chrispeels M.J., Peumana W.J.// Plan­ ta. - 1985. - Vol. 164. - P. 278-286. 8. Tabary F., Balandreau J., Bourrillon R. // Btochem. - Blophys. Res. Commun.- 1984.- Vol.119.- N 2.- P-549-55?. 9. Tabary F., Frenoy J. // Biochem. J. - 1985. - Vol. 229. - P. 687-692. 90 ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИЗОФОРМ ЛЕКТИНА ППЕНИЦЫ В БЕККРОССНЫХ ЛИНИЯХ СОРТА САРАТОВСКАЯ 29 И МОНЭСОМНЫХ ЛИНИЯХ СОРТА САРАТОВСКАЯ 46 Л.И. Крапивина Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР, г. Саратов Количественное содержание изоформ лектина пшеницы варьи­ рует в зависимости от ее сорта. Известно, что синтез субь- единиц каждого иэолектина кодируется генами определенного генома /3, 4/, поэтому содержание изоформ может зависеть непосредственно от изменений в геномах этих сортов. В работе использовались экстракты из зерновок двух сор­ тов гексаплоидных пшениц Саратовская 29 (С29)и Саратовская 46 (С46), а также беккроссные линии сорта С29, которые от­ личались от родительского сорта содержанием Ьг генов, несу­ щих устойчивость к бурой ржавчине, и моносомные линии по ге­ ному АА сорта С46, созданные на основе серии Чайниз Спринг. Анализ изолектинов осуществлялся с помощью метода ионооб­ менной хроматографии на колонке с SP - сефадексом /4/. Элюционные образцы изолектинов моносомных линий пред­ ставлены на рисунке 1а, беккроссных линий на рисунке 16. Таблица Содержание изолектинов в моносомных линиях по геному АА сорта С46 и беккроссных линиях сорта С29 Содержание изолектинов, % Сорт, линия СЬдд CIM М + m М + m M + m I 2 3 4 С46-эуплоид 53,0+0,04 34,0+0,03 13,0+0,06 1А-моно 21,0+0,06 48,0+0,04 31,0+0,05 2А-МОНО 54,0+0,05 32,0+0,04 15,0+0,03 ЗА-моно 55,0+0,03 34,0+0,03 11,0+0,05 4A-MOHO 52,0+0,04 25,0+0,05 23,0+0,04 91 12* Продолжение табл. I 2 3 4 5A-MOHO 51,0+0,04 38,0+0,04 11,0+0,03 6A-MOHO 52,0+0,05 35,0+0,03 13,0+0,03 7А-МОНО 50,0+0,06 31,0+0,05 15,0+0,04 Саратовская 29 36,2+0,03 59,2+0,05 4,5+0,02 С29АМ2 19,4+0,04 24,b+0,03 55,9+0,03 С29 28,1+0,06 36,6+0,03 35,3+0,03 Агро 2 13,0+0,03 20,3+0,04 66,7+0,07 Агро 4 39,1+0,05 43,8+0,04 17,2^0,05 Ясар 29/377 30,0+0,06 60,0+0,04 9,0+0,05 По содержанию изолектинов от эуплоида отличается только 1А-моно линия. Она содержит СЪдд в 2,5 раза меньше, чем эу- плоид, CLgg в 1,5 раза, a CL^ в 2,4 раза больше, чем в С46. Таким образом, уменьшение количества первой изоформы вызы­ вает увеличение второй и третьей, содержание СЬ&Д снижается наполовину. В отличие от моносомных линий изменения в содержании изоформы беккроссных линий наблюдались во всех линиях.наи­ менее ярко они выражены в линии Ясар 29/377. Интродукция Lr генов из различных видов пырея имела общую тенденцию к сни­ жению содержания CL^ и CLgB и увеличению содержания clDD- Так, в линиях С29АМ2 количество CLDD возросло в 12,4 раза, Агро 2 - в 14,7, С29 Agr - в 7,8 раза. Наибольшее снижение съм отмечено в линии С29АМ2 - в 1,9 раза, а изоформы CLgB- в линии Агро 2 - в 2,9 раза. Таким образом, гетерогенность распределения отдельных изоформ лектина пшеницы в моносомных линиях по геному АА сорта М46 и беккроссных линиях сорта С29 свидетельствует о генетическом контроле синтеза изолектинов и зависимости ак­ тивности генов, кодирующих отдельные субьединицы, от изме­ нений в геноме. Так, интродукция генов из пырея связана со значительным говыпением титра агглютинации и увеличением со­ держания изолектина. Нехватка одной хромосомы аллельной пары IA-MOHO линии сорта С46 приводит к снижение содержания съм 92 Титр РГА Кони,, М •0> / 4̂ö2) х CLjfi у л, О£ 4'А з А а Л Cd'x &S* ~2ß Тить РГАtf õ О 20 40 МЛ Концам Ufa CiЯс / С4#/ // Clße &\лз А "Л / / С1#е> 'х С^/в/З 0,2 Ияо v zo уо » to *0 6 Ло <н> АА РИС. ИзолентИНЫ МОНОСОМНЫХ ЛИНИЙ ПО геному АА гексаплоидной пшеницы Саратовская 46 UU и беккроссных линий гексаплоидной пшени- цы сорта Саратовская 29 (Б): А: а - эуплоид: С46; б-з - моносомные линии Б: а - сорт С29; б - С2ЭАЛ2; в - С29 г. Агро 2; д - Агро 4, е - Ясар 29/377 93 в два раза, а также к изменению содержания других изоформ. Таким образом, гетерогенность распределения изолектинов в эуплоидах С29 и С46, моносомных и беккроссных линиях поз­ воляет использовать их в качестве биохимического маркера в цитогенетических и генетических исследованиях. Лектин пшени­ цы может быть дополнительным белковым маркером длинного плеча первой гомеогруппы хромосом /I, 2, 3,/. Л и т е р а т у р а : 1. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. -Львов: Вища школа, 198I. - 155 с. 2. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в ге­ нетике и селекции. - М.: Наука, 1985. - 271 с. 3. Feumans W.J., Sbi.ni.ssen Н.М., Carlier A.B. // Pianba, - 1982. - Vol. 154. - P. 562-567. 4. Sbinissen Н.М., Peumans W.J., Law C.N., Payne P.L.// Theor. Appl. Genet. - 1983. - Vol. 57. - P. 53-58. ИСГШЬЗОВАНИЕ АГГЛЮТИНИНА ИЗ ЗАРОДЫШЕЙ ППЕНИЦЫ (АЗШ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ (АЦ) ИЗ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА БЫКА Ф.Б. Зайцева, В.М. Петров, В.М. Липкин Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР, г. Москва Аденилатциклазная система (АЦС) представляет собой фер­ ментативный комплекс, осуществляющий синтез циклического аденозин-монофосфата в ответ на связывание гормона клеткой- мишенью. Она состоит из трех функционально различающихся белков: рецептора, ГГФ-связывающего регуляторного белка и собственно каталитического компонента - фермента аденилат- циклазы. В коре головного мозга быка обнаружены две формы аденилатциклазы: кальмодулин-чувствительная (КМ-чувствитель- ная) и кальмодулин-независимая. Первая форма составляет при­ мерно 20% от общего количества фермента в мозге, или менее 0,001% всего мембранного белка /I, 3/. Данная работа посвя­ 94 щена выделению КМ-чувствительной АЦ из коры головного мозга быка. Перед солюбилизацией мембраны обрабатывались буфером с 2М NaCl, что тзволило удалить часть периферических белков, а также эндогенный кальмодулин без потери аденилатциклазной активности. Солюбилизацию белков проводили буфером с 0,5% Луброл-РХ при весовом соотношении белок-детергент 1:3. Каль- модулин-чувствительные белки выделяли из препарата солюбили- зированных мембран при помощи КМ-сефарозы (КМ иммобилизовали на BrCN -сефарозу 4В с плотностью 0,8 мг/мл сорбента). По­ лученный препарат кальмодулин-чувствительной аденилатциклаэы на этом этапе был очищен в 1300 раз, удельная активность его составляла 0,66 мкМ/мг мин. Аденилатциклаэа является гликопротеином и сорбируется на иммобилизованном АЗП /2/. Это свойство фермента использовали на следующем этапе его очистки на АЗП-сефарозе (АЗП иммоби­ лизовали на ВгСВ-сефарозу 4В с плотностью 5 мг/мл сорбен­ та в присутствии 20 мМ Н-ацетилглюкоэамина /НА.ГА/. Сорбент инкубировали 5 часов ( fc°= +4°С) с препаратом АЦ после КМ-се­ фарозы. Аденилатциклазу элюировали буфером с 0,3 М МАГА при +20°С. В результате получили препарат кальмодулин-чувстви- тельной аденилатциклаэы, с конечным выходом 3,5%, очищенной в 12 000 раз по сравнению с исходными мембранами. Удельная активность препарата 5-6 мкМ/мг мин (таблица I). В присут- Таблица I Выделение КМ-чувствительной аденилатциклаэы из 500 г коры головного мозга быка Удельная Общая ак­ Белок Очистка Этап очистки фермента­ тивность препа­тивная нМ/мин мг рата активность % % нМ/мг мин I 2 3 4 5 6 7 Мембраны 0,5 7500 100 15000 100 I Мембраны обрабо­ танные 2 М NaCl 1,0 7500 100 7500 50 2 95 Продолжение табл. I 2 3 4 5 6 7 Солюбилизация 0,5 Луброл-РХ 1,3 6000 80 4500 30 2,6 Хроматография на КМ-сеф. 660 530 7 0,8 0,0053 1300 Хроматография на АЗП-сеф. 6000 260 3,5 0,044 0,0003 12000 етвии 5 мкМ кальмодулина аденилатциклазная активность препарата увеличивалась в 2,5 раза, а под действием 50 мкМ форсколина в 8 раз. По данным электрофоретического анализа, в денатурирующих условиях (0,1% ДЦС-Na/ молекулярная масса фермента составляет 160+5 КД. Для проведения структурных ис­ следований фермент получали в гомогенном состоянии при по­ мощи электроэлюции из геля после электрофореза. Определяли аминокислотный и углеводный составы аденилатциклазы (табли­ ца 2). Предполагается, что N-концевая аминокислота фермента блокирована. ГЬказано, что КМ-независимая форма аденилатцик­ лазы, в отличие от КМ-чувствительной, не сорбируется на АЗП- сефарозе. Таблица 2 Характеристика аминокислотного и углеводаого составов КМ-чувствительной аденилатциклазы Аминокислота, Моль % сахар I 2 Аах 8,3 Thr 7,4 Ser 9,1 Glx 11,9 Pro 5,2 Gly 12,4 Ala 6,6 Val 5,8 Met 1,8 96 Продолжение табл. 2 I 2 Не 8,0 Leu 8,1 Туг 3,0 Phe 2,8 Hia 1,6 lys 3,9 Arg 3,9 Рос 10,74 Man 12,84 Gal 5,74 GlcNAc 70,66 Белок, % 86,18 Углеводы, % 13,82 Л и т е р а т у р а 1. Neer E.J. // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249.-P. 6527-6531. 2. Pfeoffer E., Moliner S., Pfeuffer T. // EMBO J. - 1985. - Vol. 4. - P. 3675-3679. 3. Mestcott K.K., La Porte D.C., Storm D.H. /// Proc. Natl. Acad, Sei. USA. - 1979- - Vol. 76. - P. 204. ЛЕКТИНЫ ГЕНЕРАТИВНЫХ ОРГАНОВ И ИХ РОЛЬ В РАСГОЗНАВАНИИ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ПЫЛЬЦЫ И ПЕСТИКА Е.Л. Голынская, Е.Б. Корвацкая Киевский государственный университет им. Т.Г. Шевченко Экспериментально обнаружено неизвестное ранее свойство пестиков цветковых растений синтезировать эндогенные лекти­ ны. В качестве объекта исследования использовали примулу об- 97 13 ратноконическую - гетеростильное растение с гетероморфной системой несовместимости. Методом дробного этанольного фракционирования из неопы- ленных, легитимно и иллегитимно опыленных пестиков выделены суммарные лектины. Разработан метод оценки относительной ак­ тивности индивидуальных Сахаров в реакции торможения эри- троагглютинации применительно к совокупности лектинов. Срав­ нена относительная активность 12 простых Сахаров в реакциях ингибирования. Установлено, что лектины неопыленных пестиков длинно- столбчатой формы достоверно активнее ингибируготся L-араби- нозой, глюкозой, галактитом, а лектины неопыленных пестиков коротко столбчатой формы - галактозой, ксилозой, фруктозой. Наряду с этим, неопыленные пестики каждой формы примулы со­ держат лектины, которые ингибируютс.я сахарами, проявившими максимальную активность относительно лектинов пестиков про­ тивоположной формы примулы. При легитимном опылении каждой формы ингибирование лек­ тинов сахарами, характерными для неопыленных пестиков данной формы, снижается, а ингибирование сахарами, характерными для противоположной формы, усиливается. ?ти процессы не наблю­ даются при иллегитимном опылении. Данное явление расценива­ ется как свидетельство использования лектинов определен­ ной специфичности, свойственных преимущественно неопыленным пестикам, в ходе прогамной фазы оплодотворения. Суммарные лектины, выделенные из пестиков, разделяли ме­ тодами гельфильтрации на сефадексах. Определяли общее число белковых фракций, характер распределения белковых пиков на элюционной кривой, а также распределение белковых фракций, обладающих и не обладающих агглютинирующей способностью (да­ лее - агглютинирующие и неагглютинирующие белки). Установлено, что белки неопыленных пестиков длинностолб- чатой формы на элюционной кривой распределяются в виде двух пиков с объемами выхода 64 мл (свободный объем колонки1» и 214 мл (основной пик). Первый из них содержит агглютинирую­ щие белки, второй - также и неагглютинирующие белки. Белки, выделенные из пестика спустя 24 ч после легитим­ ного опыления выходят из колонки также двумя пиками. Отмеча­ 98 ется существенное смещение основного пика в направлении фракции с меньшим порядковым номером (v = 190 мл). Белки, выделенные из пестика спустя 24 ч после иллегитимного опыле­ ния, выходят из колонки также двумя пиками, При этом ха­ рактерно смещение объема выхода основного пика в сторону фракций с большим порядковым номером (Ve = 220 мл). Зареги­ стрировано перемещение на элюционной кривой агглютинирующих белков в сравнении с неопыленным пестиком. При опылении аг­ глютинирующие белки обнаружены также в зоне низких экстинк- ций, в последних фракциях элюата. Агглютинирующие и неагглютинирующие белки, элюированные с колонки, гидролизовали в кислой среде и определяли состав аминокислот на аминокислотном анализаторе типа AM-881.Аг­ глютинирующие белки, которые вымываются в свободном объе­ ме колонки, по составу аминокислот отличаются от остальных фракций и, вероятно, не являются их агрегатами. Агглютинирующие белки основного пика неопыленных пести­ ков характеризуются высоким содержанием основных и кислых аминокислот. При опылении аминокислотный состав белков пес­ тика сравнительно с контролем меняется. Отмечены некоторые общие для легитимного и иллегитишого опыления тенденции, а также существенные отличия. В обоих вариантах наблюдается снижение содержания основных и кислых аминокислот и увеличе­ ние количества нейтральных. При легитимном опылении увеличи­ вается содержание глутаминовой кислоты, при иллегитимном - глутаминовой и аспарагиновой кислот (либо их амидов), фи легитимном опылении несколько увеличивается содержание цро- лина, отмечено необычайно высокое содержание оксипролина, - явление, которое не проявляется ни в одном из вариантов опы­ та. Если сумму всех аминокислот гидролизата принять за 100%, то по абсолютному содержанию доля оксипролина составит 41,5% от суммы аминокислот. При иллегитимном опылении увеличивает­ ся содержание пролина, однако оксипролин не определяется. Характерной особенностью белков, которые вымываются в зоне низких экстинкций, следует считать максимальное содер­ жание пролина. Известно, что пролин у всех без исключения растений играет особую роль в метаболизме растущих пыльцевых трубок и может непосредственно включаться в состав специфи­ 99 13* ческих белков стенки пыльцевой трубки. Гликопротеины с высо­ ким содержанием оксипролина выявлены в составе пыльцевых трубок некоторых растений. Высокое содержание пролина и ок­ сипролина в составе агглютинирующих белков, обнаруженное в наших экспериментах, может свидетельствовать об участии аг­ глютинирующих белков в процессах роста пыльцевых трубок. Агглютинирующие и неагглютинирующие белки, элюированные с колонки, прибавляли в серии разведений к искусственной среде, на которой выращивались пыльцевые трубки примулы, в сочетаниях, имитирующих легитимное и иллегитимное опыление. Установлено, что агглютинирующие белки неопыленных пестиков длинностолбчатой формы стимулировали рост легитимных пыльце­ вых трубок и ингибировали рост иллегитимных. Неагглютини­ рующие белки не влияли на рост легитимных трубок и ингибиро­ вали рост иллегитимных. Белки, выделенные из пестиков спустя 24 ч и после леги­ тимного опыления, проявили иное воздействие на рост пыльце­ вых трубок. В этом варианте ингибирующее влияние белков на рост пыльцевых трубок не определяется. Стимулирование прояв­ ляется сильнее относительно иллегитимной пыльцы, которая не участвовала в опылении. При всех вариантах опыта длина пыльцевых трубок на средах с добавками агглютинирующих бел­ ков была выше таковых на средах с добавками неагглютинирую­ щих белков. Агглютинирующие белки, выделенные из пестиков спустя 24 ч после иллегитимного опыления, при всех раз ведениях ин­ гибировали рост иллегитимных пыльцевых трубок, а при высоких концентрациях ингибировали и рост легитимных пыльцевых тру­ бок. При низких концентрациях рост легитимных пыльцевых тру­ бок стимулировался. Таким образом, в ходе прогамной фазы оплодотворения с агглютинирующими белками пестиков примулы происходят опреде­ ленные превращения, которые выявляются в изменении их спо­ собности ингибироваться простыми сахарами, изменении профиля элюции при гель-хроматографии в таких, как изменение ами­ нокислотного состава белков и изменение характера их влияния на рост пыльцевых трубок. Отмеченные процессы нельзя отнести к категории случайных явлений. 100 Совершенно очевидно, что реакция гемагглютинации, сы­ гравшая такую важную роль в исследовании лектинов, в природ­ ных условиях никогда не реализуется. В эксперименте при уча­ стии лектинов форменные элементы крови и другие клетки, а также макромолекулы, группируются в физиологически неактив­ ные конгломераты. Возникает вопрос, не является ли способ­ ность лектинов вызывать г ема г глю тинацию, свойственную этому классу гетерополимеров, проявлением их функциональной роли - способности участвовать в организации физиологически актив­ ных надмолекулярных и субклеточных структур, когда упоря­ доченное целое характеризуется большими возможностями, чем сумма составляющих. Одним из достижений молекулярной биологии является пони­ мание, что многие биополимеры, которых считали растворимыми и потому обособленными, в действительности образуют строго упорядоченные системы, надмолекулярные комплексы, и это яв­ ляется необходимым условием их биологической активности. Белки, состоящие из субьединиц, могут обладать сложной иерархической организацией. Ферменты объединяются друг с другом в метаболические ансамбли. Отдельные ферментативные реакции формируют согласованное функциональное целое. В свою очередь, многие ферменты, представляющие собой сложные мно­ гокомпонентные системы, связаны в комплексы с плазматиче­ скими мембранами пластид, митохондрий и др. О природе межмолекулярных взаимодействий, обусловливаю­ щих надмолекулярную организацию биополимеров, известно очень мало. Нами выдвигается гипотеза, что в организации прост­ ранственной организации молекул и надмолекулярных структур, связанных с выполнением их функций, участвуют лектины, и в этом заключается их универсальная роль в жизнедеятельности клетки. Возможно, что лектины, биополимеры и субклеточные структуры имеют в своем составе унифицированные элементы сборки, при помощи которых объединяются в надмолекулярные комплексы. Лектины по-видимому участвуют и в построении мембран и стенки пыльцевой трубки, структура которых, возможно, про­ граммируется мембраной интины. Лектины могут обеспечивать контакт и взаимодействие пузырьков аппарата Гольджи с мем­ 101 браной пыльцевой трубки в зоне роста. Формально эти процессы напоминают реакцию гемагглютинации при участии лектинов, но отличаются от нее тем, что конечным результатом является не конгломерат клеток, а специализированная функционально ак­ тивная структура. Следует подчеркнуть, что лектины являются носителями ионов Са^+, роль которых в создании внутримоле­ кулярных , межмолекулярных и межклеточных контактов необы­ чайно велика. В соответствии с развиваемыми здесь представлениями рас­ познавание при участии лектинов в процессах взаимодействия пыльиы и пестика заключается, очевидно, в обеспечении прост­ ранственной ориентации и функционального объединения компо­ нентов растущей пыльцевой трубки и метаболитов пестика. ЛЕНТИН ПЫЛЬЦЫ ТАБАКА: СЕКРЕТОРНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ РОСТА ПЫЛЬЦЕВЫХ ТРУБОК И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ К.В. Ильченко Институт ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР, г. Киев Наличие лектинов в генеративных органах было показано у целого ряда покрытосеменных /I, 2/. Обнаруженные в этих ра­ ботах количественные изменения лектинсодержащих фракций и их углеводной специфичности при легитимном и иллегитимном опы­ лениях у примулы позволили предположить, что лектины играют существенную роль в контроле опыления у растений, вовлекаясь во взаимодействие между пыльцой и пестиком /I/. Вместе с тем хорошо известно, что у некоторых видов, в частности у табака, в критических этапах такого взаимодейст­ вия участвуют растущие пыльцевые трубки. Чтобы говорить об участии лектинов в контроле роста пыльцевых трубок табака, следовало доказать их наличие в составе пыльцы, выявить пути вовлечения лектина во взаимодействие с пестиком и определить возможные способы регуляции этих метаболических путей. Работа проводилась на примере пыльцы двух видов табака: NLcotiana alata Link et Otto и N.tabacum Ь. Все операции с пыльцой и пыльцевыми трубками проводили как было описано ра­ нее /4/. Условия экстрагирования лектина были подобраны экс­ периментально. Экстрагирующая смесь содержала трис-глицино- 102 вый буфер, pH 8,3, 0,2% аскорбиновой кислоты, 1% поливинил- гшрролидона, 2% 2-мекаптоэтанола. Белок определяли по методу Брэдфорда /5/. Все операции с кровью и постановка иммуноло­ гических реакций осуществлялись по общепринятой методике /3/. Тестирование сырых экстрактов пыльцы с помощью реакции гемагглютинации позволило.обнаружить лектиновую активность в их составе. Лектиновая активность обнаруживалась в осадке после высаливания белков сульфатом аммония, что свидетельст­ вует о белковой природе ее носителя. Определены некоторые свойства лектина: - он не терял активности после экспозиции в течение 30 мин при 65°С, - специфично агглютинировал эритроциты голубя и челове­ ка, а также папаинизиро ванные эритроциты курицы; - специфичность лектина к углеводам в результате испыта­ ния 8 моно- и 3 дисахаридов установить не удалось; - внеклеточные белки пыльцы не содержат лектина, что свидетельствует о его локализации в цитоплазме вегетативной клетки. Вместе с тем, в ходе роста пыльцевых трубок in vitro лектин определялся в составе культуральной среды, что сви­ детельствует о его секреторном выделении. Как абсолютная, так и удельная активность секретированного лектина увеличи­ вались в ходе роста пыльцевых трубок (рисунки I, 21. Значе­ ние удельной активности тотального препарата лектина, полу­ ченного из зрелой, непроросшей пыльцы составляло 71 ед/мг белка для пыльцы N.alata и 167 ед/мг - для N.tabacum.a че­ рез 24 ч роста пыльцевых трубок активность секретированного лектина достигала в случае N.alata 250 ед/мг, а в случае N.tabacum 715 ед/мг, что, соответственно, в 3,5 и 4,3 раза вше, чем в сухой пыльце (рисунок 2). Сравнивая эти данные, можно отметить, что возрастание удельной активности лектина связано скорее с возрастанием его абсолютной активности, чем со снижением количества суммарного секретированного белка. По-видимому, в ходе роста пыльцевых трубок происходит по­ стоянное выделение дополнительных порций лектина. Для выяснения механизмов регуляции секреции лектина оп­ ределялась зависимость этого процесса от содержания внекле- 103 1:16 2,0 / 1,5 1:8 г 1,0 / / 1:4 И £ 0,5 1:2 1:1 JA *—А LiZ , .1 12 17 24 Рис. I. Динамика секреции суммарного белка и лектина в ходе роста пыльцевых трубок Р7Я -титр РТА I I - содержание белка в культувальной сре­ де, мг/мл точного кальция в среде роста пыльцевых трубок, а также эф­ фект некоторых других веществ, модулирующих секрецию белков у животных. При изменении содержания внеклеточного кальция в интервале от 10~® М до 10 М (таблица I) обнаружено, что абсолютная активность выделенного лектина изменяется незна­ чительно, за исключением вариантов с низким (10~®-10-^ М) содержанием внеклеточного Са*"+. Введение в культуральную среду ионофора Х-537А показало, что воздействие внеклеточ­ ного кальция на секреторный процесс опосредуется путем воз­ действия его на внутриклеточный пул Са^+. Удельная активность секретируемого лектина изменяется в более широких пределах. Наиболее высокое ее значение заре­ гистрировано при 10"^ М внеклеточного кальция. Однако учи- 104 800 • 1-1 р Г~] р / У / В / / гП / / 4 12 17 24 Рис. 2. Изменение удельной активности секретиро ванного лектина ед/мг белка Kžži - N.alata I 1 - N.tabacum Таблица I Влияние ионов Са2+ на секрецию лектина пыльцевыми трубками Концентрация кальция и Активность лектина способ ее создания абсолютная удельная I 2 3 Са-ЭГТА буфер + ионофор Х-537А КГ2М I 4 73,5 Ю-3М I 8 113,6 ГО-4М I 16 200,0 Ю"5М I 8 581,4 Ю-6М I 4 240,4 10~7М I 4 142,8 го^м I I 14,5 Са-ЭГТА буфер без ионофора 10"% 1:2 45,5 105 14 Продолжение табл. I I 2 3 1СГ7М 1:2 100,0 Ю~6М 1:4 208,3 10-5М 1:8 526,3 без буфера 10 1:8 140,8 Ю"7М 1:8 160,0 ю-бм 1:16 297,6 Ю"5М 1:16 240,0 Ю"4М 1:8 200,0 10-3М 1:8 163,3 Ю-2С 1:8 333,3 тывая результаты определения абсолютной активности, можно заключить, что изменение удельной активности в большей сте­ пени определяется изменением количества секретированного суммарного белка, но не специфической активности лектина. По-видимому секреция лектина ингибируется при низких кон­ центрациях Са2+, а увеличение его содержания выше 10"^ М происходит Са-независимым способом. В результате изучения влияния на секрецию лектина других модуляторов получены сходные результаты: удельная активность лектина изменяется сильнее, чем абсолютная, изменение удель­ ной активности в большей степени определяется изменением секреции суммарного белка (таблица 2). Таблица 2 Влияние модуляторов секреции на выделение лектина растущими пыльцевыми трубками Активность лектина Тестируемое вещество абсолютная удельная I 2 3 Контроль 1:32 166,7 106 Продолжение табл. 2 I 2 3 Толбутамид I 4 50,0 Нитроглицерин I 16 43,5 Нитроглицерин + толбутамид I 64 250,0 Фторид натрия I I 2,5 Фторид натрия + толбутамид I 16 500,0 Ионофор Х-537А I 2 6,2 Ионофор Х-537А + толбутамид I 8 166,7 Теофиллин I 4 100,0 Теофиллин + толбутамид I 8 33,3 Папаверин I 8 166,7 Папаверин + толбутамид I 16 200,0 АТФ I 4 83,3 АТФ + толбутамид I 4 55,5 к№ I I 4,1 АМФ + толбутамид I 2 50,0 Активация секреции белка приводит, как правило, к сниже­ нию удельной и очень часто - абсолютной активности лектина. Введение в такую систему толбутамида для снятия эффекта мо­ дулятора приводит к увеличению как абсолютной,так и удельной активности лектина. При подавлении секреции белков метил- ксантинами абсолютная активность лектина всегда в мое в при­ сутствии толбутамида, чем без него. По-видимому, секреция лектина пыльцевьми трубками осу­ ществляется независимым, конститутивным путем, или даже сти­ мулируется толбутамидом. Конститутивность секреции лектина указывает на важную роль этого белка и его выделения при осуществлении роста пыльцевых трубок. Секреция представляет собой удобный путь введения лектина во взаимодействие пыль­ цевых трубок и пестика. Л и т е р а т у р а : I. Голынская Е.Л.; Башкирова Н.В. Томчук H.H. // Физиол. раст. - 1976. - Т. 23. - * I. - С. 88. 107 14* 2. Голынская Е.Л. // Молек. биол. - Киев, 1979. - 23. - С. 34. 3. Луцик М.Д., Панасюк Е.М., Аитонюк В.А., Луцик А.Д.Ме­ тоды поиска лектинов (фитогемагглютининов) и определения их иммунохимической специфичности. - Львов: Изд-во Львовского мединститута, 1980. - 20 с. 4. Шпилевая С. П., Ильченко К. В. //Докл. АН УССР. Сер. Б. - 1984. - 8. - С. 78. 5. Bradford М. // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72. - N 1 - 2. - P. 248. ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНА ИЗ СЕМЯН СОИ НА СТРУКТУРУ И ЭНЕРГО- ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ РЕАКЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ И.М. Жесткова, В.Г. Молотковский Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР Экзогенные лектины способны индуцировать или модифициро­ вать ряд процессов, осуществляемых на мембранах различного типа вызывать изменения структурной организации мембран. Исследование таких эффектов служит в настоящее время продук­ тивным способом получения информации, необходимой для созда­ ния концепции физиологической роли лектинов. Становится все более очевидным, что исследование мем­ бранного уровня действия не может ограничиваться рамками плазматической мембраны, поскольку как гликоконъгогаты, так и лектины обнаружены в мембранах большинства органелл. Это предполагает функционирование в них эндогенной лектин-рецеп- торной системы. Вместе с тем, внутриклеточные мембраны еще не стали объектом систематического изучения. Хлоропласты, согласно публикациям последнего времени /2, 4/, обладают компетентностью к галактоз о с пецифичес ким лектинам. При экзогенном действии на мембраны оболочки и тилакоидов они вызывают аналогичные другим типам мембран эф­ фекты - агглютинацию, изменение жидкостности липидного би- слоя и, по косвенным данным, модифицируют работу систем, от­ ветственных за процесс трансформации энергии света. Это до­ пускает возможность регулирования лектинами функциональной 108 активности хлоропластов. В настоящей работе изложены резуль­ таты исследований влияния лектина из семян сои на светозави- симые реакции хлоропластов. Работа выполнена на хлоропластах без оболочки, выделен­ ных из листьев бобов по стандартной методике /I/. Лектин экстрагирован из муки семян сои с последующей очисткой аф­ финной хроматографией и лиофилизацией выделенного белка. При электрофорезе препарат обнаруживал одну диффузную полосу. Агглютинирующая активность, тестированная на 2% суспензии трипсинизированных эритроцитов кролика в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2 составляла < 0,15 мкг/мл. По собственным и литературным данным /3/, лектин специфически связывается с остатками N-ацетилгалактозамина и галактозы. Белок насыщен по центрам связывания Са2+ и Мп2+. На рисунке I показана зависимость скорости фотофосфори- лирования изолированных хлоропластов от концентрации лекти­ на. Максимальное ингибирование наблюдалось при концентрации 100 мкг/мл, дальнейшее увеличение не изменяло достигнутого эффекта. Предварительная инкубация с галактозой как конкурентным углеводом предотвращала ингибирующее влияние лектина на фо- тофосфорилирование. Это подтверждает, что его ингибирование определяется взаимодействием лектина с углеводными остатками на поверхности тилакоидов. Эффективность действия лектина в гипотонической среде оказалась заметно выше в сравнении со средой, оптимальной для функционирования хлоропластов. Несомненно, это связано с увеличением доступности лектин-связывающих компонентов в результате перехода мембран в набухшее состояние. Значимых величин ингибирование достигало лишь после до­ статочно продолжительного выдерживания хлоропластов с лиган- дом (рисунок 2). Еще более медленно развивалась агглютинация хлоропластов. Первые признаки образования конгломератов ви­ зуально наблюдались через 2-2,5 часа. Маловероятно поэтому, что подавление фосфорилирования явилось следствием адгезион­ ных взаимодействий тилакоидных мембран. Сопоставимую с выделенным лектином способность ингиби­ ро вать фосфорилирование и агглютинировать хлоропласты обна- 109 100 \ *4 § о е< 20 60 100 нгг/мл Рис. I. Зависимость скорости синтеза АТФ от концентрации лектина. Хлоро- пласты инкубированы с лектином 15 мин.Кофактор транспорта элек­ тронов - фенаэинметасульфат.100% активности соответствует т 495 т мкмоль АТ$. мг хлорофилла .час ружили и другие специфичные к галактозилам лектины, в том числе рицин, лектин фасоли обыкновенной и арахиса. Эти ре­ зультаты представляются важными с точки зрения универсаль­ ности действия углеводевязывающих белков. Прединкубация хлоропластов с лектином в темноте в тече­ ние 15 мин замедляла скорость реакции Хилла, определяемой по восстановлению феррицианида в среде, не содержащей фосфатак- цепторной системы (таблица Р. Ингибирование носило выраженную концентрационную зависи- 110 10 20 30 мин Рис. Z. Временная зависимость действия лектина на фотофосфорилирование. На оси абс­ цисс время инкубации хлоропластов с лектином (60 мкг/мл). 100% активности соответствует 410 мкмоль АТФ.мг хлоро- филл~1-час-1 Таблица I Действие лектина на реакцию Хилла (мкмоль восстановл. феррицианида . мг хлорофилла-* . час-*) В а р и а н т - F ССР % +5 мкМ FCCP % -Лектин 117 314 -100 +Лектин 12 мкг/мл 103 88 88 28 +Лектин 30 мкг/мл 67 57 16 5 мость. Обнаружено, что степень ингибирования резко увеличи­ валась при деэнергиэации мембран внесением в среду прото- III О О нофора фторкарбонялцианидфенилгидразона (FCCP) (таблица I). Аналогичные результаты получены с хлоропластиками,предвари­ тельно обработанными ЭДТА, что открывает в мембранах канал свободной диффузии Н4. Усиление ингибирующего влияния лекти­ на на транспорт электронов в деэнергизированных хлоропластах пока не поддается рациональному объяснению. Уникальной особенностью тилакоидных мембран является ко­ личественное преобладание галактолипидов. Логично допустить, что галактолипиды наделены функцией мембранных рецепторов, и обнаруженные нами эффекты, полностью или частично, есть результат их взаимодействия с лектином. С помощью липофильного флуоресцентного зонда дифенилгек- сатриена изучено состояние липидного бислоя мембран после воздействия на них лектина. Обнаружено, что величина поляри­ зации флуоресценции встроенного в мембраны дифенилгексатрие- на увеличивается под влиянием лектина в пределах 19% (таб­ лица 2). Таблица 2 Поляризация флуоресценции (Р) дифенилгексатриена в хлоропластах под действием лектина Вариант Р Р Возбуждение при 360 нм, -лектин 0,26+0,02 флуоресценция при 460 нм. +лектин 0,31+0,02 0,05 Инкубирование хлороплас­ тов с лектином (60 мкг/ мл) в течение 15 мин. Повьшение поляризации флуоресценции липофильного зонда в данном случае свидетельствует о более плотной упаковке липи- дов в бислое под влиянием лектина и уменьшении их ротацион- но-вращательной подвижности. Наблюдаемый масштаб изменений дает возможность предположить локальные изменения организа­ ции липидного бислоя. В принципе возможны два варианта механизмов наблюдаемо­ го явления: связывание лектина с галактолипидами, либо с компонентами электронтранспортной цепи гликопротеидной при­ роды, что сказывается на подвижности липидов в анулярном слое. 112 Приведенные данные позволяют отнести лектины, по крайней мере специфичные к галактозе, к числу природных модификато­ ров функциональной активности хлоропластов. Кроме того, они указывают на возможность существования в тилакоидных мем­ бранах специфических рецепторов, углеводный компонент кото­ рых несет галактозу, и допускают существование эндогенных лектинов, способных связываться с детерминантной группой таких рецепторов. Возникновение лектин-рецепторного комплек­ са может служить способом регулирования транспорта электро­ нов и фотосинтеза в целом. Л и т е р а т у р а : 1. Жесткова И.М., Молотковский Ю.Г. // Физиол. раст. - 1984. - Т. 31. I. С. 90-97. 2. Goltzev V., Kantcheva М., DoltchLrikova V., Kovatchev D. // Cell Slectrophor. Proc. Int. Meet., Rostock, Sept. 24- 28. - Berlin, New York, 1985. - P. 691-696. 3. Lis H., Joubert Fr.J., Sharon N. // Photochemistry. - 1985. - Vol. 24. - P. 2803-2809. 4. Nandy P., Dattachoudhury M., Chakrabarti P. // Proc. Indian Acad. Sei. - Vol. 59. - N 6. - P. 437-440. ИСГОЛЬЗОВАНИЕ КОНКАНАВАЛИНА А ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ 1ЮЛИСАХАРВДЗВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ГОРОХА Л.В. Косенко, М.А. Пацева, В.М. Лахтин Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР Участие полисахаридов Rhizobium в процессах формиро­ вания бобово-ризобиального симбиоза предполагает наличие у близкородственных штаммов бактерий индивидуальных особенно­ стей полисахаридного комплекса, определяющих симбиотические свойства микросимбионтов. Ранее мы гоказали, что экэополи- сахариды (ЭПС) пяти штаммов клубеньковых бактерий (кл.6 .1 гороха имеют одинаковый моносахаридный состав /I/. В них 113 15 обнаружены глюкоза, галактоза, глюкуроновая и пировиноград­ ная кислоты, что подтверждает данные литературы о сходстве ЭПС Rhizobium legmpinosarum не только между собой, но и с ЭПС R.brifolii и R.phaseoll /3/, а также нерегулярные компо­ ненты: манноза и неидентифицированный липофильный сахар X Трам = 0,82), содержание которых варьировало от штамма к штамму. При этом были установлены коррелятивные зависимости: прямая - между количеством маннозы в полисахаридах и такими симбиотическими свойствами клубеньковых бактерий, как эф­ фективность (г = +0,89) и азотфиксирующая активность (г = +0,80), обратная - по отношению к вирулентности (г = -0,73) и конкурентоспособности (г = -0,94). Это указывало на воз­ можную сигнальную роль маннозы в системе углевод-белкового "узнавания" растений-хозяев и их микропартнеров. Поскольку от количественного содержания маннозы в экзополисахаридах зависит проявление симбиотических свойств бактерий, то можно предположить, что манноза влияет на лектинсвязывающую спо­ собность ЭПС. Однако при изучении активности взаимодействия лектина гороха с ЭПС изучаемых бактерий четких результатов по ингибирующей активности ЭПС в связи с присутствием в них маннозы обнаружено не было. Это можно объяснить тем, что кооперирование симбиотических партнеров - процесс многопла­ новый, в котором функционирование их углевод-белковой систе­ мы рекогниции обеспечивается взаимодействием многих химиче­ ских факторов, суммарное влияние которых маскирует вклад маннозы в лектин-рецепторные взаимосвязи симбионтов. Для выявления индивидуальной роли маннозы в лектинсвчзы- вающей способности ризобиальных полисахаридов использовали конканавалин А (Кон А), который, как известно, проявляет значительную структурную аналогию с лектином гороха, одина­ ковую с ним специфичность, но более дифференцированно "отли­ чает" маннозу от глюкозы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали пять штаммов Rhizobium legumino- sarum, полученных из Всесоюзной коллекции. ЭПС получали из освобожденной от клеток бактерий куль- туральной жидкости путем осаждения сернокислым аммонием (50% 114 насыщения). Лектин экстрагировали из муки семян гороха 0,9%, NaCl, очищали аффинной хроматографией с использованием се- фадекса Г—100 /2/. Активность взаимодействия ЭПС с лектинами определяли реакцией подавления гемагглютинирующей активности лектинов (РПГА). Результаты выражали в процентах. Лектин-аффинную хроматографию проводили на колонках (6,5 х 0,5 см), заполненных сефарозой 4В-Кон А (опыт)и сефарозой 4В (контроль), уравновешенных трис-буфером, pH 7,2. Элюиро- вали тем же буфером. Объем проб составлял 0,05 мл. Содержа­ ние углеводов в пробах определяли по реакции с фенолом и сер­ ной кислотой /4/. Моносахаридный состав фракций устанавлива­ ли методом газожидкостной хроматографии в виде пентаацетатов полиолов, условия проведения ГЖХ описаны в /2/. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ При изучении активности взаимодействия ЭПС с Кон А в растворимой форме (проведение РПГА в планшетах) показано, что наиболее сильными ингибиторами гемагглютинирующей актив­ ности Кон А являются экзополисахариды, содержащие большие количества маннозы. Кон А-связывающая способность ЭПС, рас­ положенных по убыванию содержания в них маннозы: 3,7% (шт. 2526), 1,6-1,3% (шт. 2406 и 250а), 0,5-0,3% (шт. 2496 и 2486), составляла соответственно 37, 28-22 и 14-12%. Это позволяло предположить, что манноза, либо являющаяся струк­ турным компонентом ЭПС, либо входящая в состав полисахарид- ного комплекса, может усиливать активность взаимодействия ЭПС клубеньковых бактерий гороха с маннозоспецифичными лек­ тинами. Для подтверждения этого мы проводили лектин-аффин­ ную хроматографию исследуемых э кз о по ли с ахаридо в с использо­ ванием Кон А, иммобилизованного на сефарозе 4В. При проведе­ нии обычной гель-хроматографии на сефарозе 4В, работающей как молекулярное сито, было показано, что ЭПС всех изучаемых штаммов гетерогенны или полидисперсны, что видно из элюцион- ных профилей, представленных на рисунке. В состав полис&ха- ридного комплекса входит не менее двух-четырех компонентов. Вместе с тем элюционные профили ЭПС всех пяти штаммов очень сходны между собой. Поведение этих же гликополимеров в ус­ ловиях проведения лектин-аффиннай хроматографии (сефароза 115 15* шт , г* Ye u ^ 10 20 30 мл 0 10 20 Рис. Лектин -аффинная хроматография ЭПС клубеньковых бактерий гороха (колонка 6,5x0,5 см): А - сефароза 4В; сефароза 4В-Кон А 4В-Кон AI изменяется в зависимости от содержания в них ман­ нозы. Это особенно заметно при сравнении ЭПС штаммов 2526 и 2486, содержащих 3,7 и 0,3% маннозы, соответственно. Аф­ финная задержка выхода ЭПС с колонки была наибольшей для. ЭПС, содержащих большее количество маннозы: объем элюции ЭПС по мере уменьшения в них маннозы составляет 30, 25, 17, 13 и 10 мл. Для решения вопроса, являются ли экзо полисахариды кл. б. гороха гетерогенными или полидисперсными, что вообще харак­ терно для бактериальных полисахаридов, мы изучали моносаха- ридный состав четырех фракций, вьщеленных из ЭПС шт. 2526 на колонке сефароза 4В-Кон А. Результаты представлены в таб­ лице. Таблица Моносахаридный состав фракций ЭПС в. leguminosarum 2526 (% от суммы Сахаров) Фракции Глго- Галак- Ман- Неиденти- Соотношения коза тоза ноза фицирован­ объем ный сахар глюкоз ы: галакто­ элюции X зы: маннозы:X 0-4,0 76,3 21,3 1,3 1,1 4:1:0,05:0,05 44,0-7,5 73,5 18,8 2,2 5,5 4:2:0,1:0,3 7,5-13,5 73,3 17,5 2,8 6,4 4:1:0,2:0,4 13,5-23,0 68,0 8,2 8,8 15,4 8:1:1:2 Примечание: Вследствие малого количества материала содержа­ ние глюкуроновой и пировиноградной кислот не оп­ ределяли. Полученные данные однозначно указывают на существование в полисахаридном комплексе ЭПС, по крайне мере, двух инди­ видуальных полисахаридов. Первые три фракции очень сходны между собой и, по нашему мнению, представляют полидисперсный материал с характерным для ЭПС кл.б. гороха составом. 1У фракция содержит основное количество маннозы и неидентифи- цированного сахара X. Присутствие этих Сахаров в небольших количествах в I-Ш фракциях, возможно, является результатом их загрязнений 1У фракцией. 117 Установление присутствия манноз о содержащего компонента в полисахаридном комплексе ЭПС кл.б. гороха представляет ин­ терес в связи с существованием ризобиального маннозо-, но не глюкозоспецифичного /5/ лектина, обнаруженного нами у всех пяти изучаемых штаммов, различающихся по проявлению его ак­ тивности в зависимости от симбиотических свойств бактерий, и свидетельствуют о сложном характере лектин-углеводных взаимосвязей симбионтов. Проведенные исследования демонст­ рируют возможность использования конканавалина А, как и дру­ гих лектинов, для изучения функциональных детерминант уг­ ле во дсо держащих полимеров, а также возможности лектин-аффин­ ной хроматографии для разделения гликополимеров. Л и т е р а т у р а : 1. Дубовенко М.А., Носенко Л.В. //Микроорганизмы в сель­ ском хозяйстве: Тезисы докл. Ш Всес. науч.конф. - М., 1986. - С. 104. 2. Ковалевская Т.М., Носенко Л.З., Захарова И.Я. - Мик­ робиология, 1985. - Т. 53. - Вып. 5. - С. 810. 3. Луцик М.Д. - Биохимия, 1974. - Т. ,"39. - Вып. 4. - С. 811. 4. Dubois М., Gilles К.А., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. // Anal. Chem. - 1956. - Vol. 28. -КЗ.- P. 550. 5. Kijne J.W,, Schaal van der I.A.M., Diaz C.L. et al, - Lectins: Biology, biochemistry, clinical biochemistry. Ber­ lin, New York, Walter de Gruyter, 1983. - Vol. 3. - P. 521. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКТИНОВ ЛЮПИНА С ЦЕЛЬЮ ВЫЯСНЕНИЯ ИХ УЧАСТИЯ В СИСТЕМЕ БОБОВЫЕ РАСТЕНИЯ - КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ Е.Д. Кругова, С.М. Маличенко, М.В. Стадник, Н. И. Назаренко, Е.П. Старченков Институт физиологии растений и генетики АН УССР, г. Киев В процессе "узнавания" клубеньковыми бактериями бобовых растений устанавливаются межклеточные контакты и формируется 118 биологическая система. В такой системе, образующейся в слу­ чае совместимых видов, проявляется основное качество симбио­ за - способность фиксировать молекулярный азот /I, 3/. Предполагают, что в основе специфичности взаимодействия определенного вида ризобий со свойственным им бобовым расте­ нием может лежать способность лектина корней растения-хозяи­ на узнавать и связывать углеводные рецепторы на поверхности клеток симбиотических бактерий /5, 6/. Лектиновая гипотеза установления контакта при формировании симбиотической систе­ мы у бобовых в настоящее время находится в центре внимания исследователей. В связи с полифункциональной ролью лектинов и особой их гипотетической функцией у бобовых, мы исследова­ ли лектиновую активность люпина, в котором до настоящего времени эти белки не изучались, а также влияние некоторых факторов на активность фитогемагглютинина корней люпина. В качестве тест-системы для определения активности лек­ тина использовали агглютинацию куриных эритроцитов. Углевод­ ную специфичность определяли методом ингибирования лектина углеводами /4/. Лектины вьщеляли из муки семян и корней про­ ростков люпина при помощи ступенчатого элюирования этано­ лом /2/. Нами было установлено, что семена, корни проростков и корневые клубеньки люпина обладают гемагглютинирующей ак­ тивностью. Как видно из данных таблицы I, титр лектина по РГА изменяется в зависимости от вида эритроцитов, возраста растений, степени разведения белка (таблица I). Далее была определена углеводная специфичность лектинов из семян и кор­ ней люпина по торможению интенсивности эритроагглютинации. Установлено, что фитогемагглютинины из семян и корней люпи­ на являются галактозоспецифичными; кроме того, их активные центры комплементарны к нескольким углеводным остаткам, ко­ торые не полностью идентичны для препаратов белков из данных объектов. Одним из доказательств лектиновой гипотезы "узнавания" симбионтов могло бы служить снижение содержания лектинов в корнях при повмпении концентрации в среде ионов N0^ и , угнетающих образование клубеньков. В связи с этим мы провели ряд опытов, в которых исследовали действие высоких доз азота 119 и инокуляции клубеньковыми бактериями на содержание раство­ римых лектинов в корнях проростков люпина. Таблица I Титр лектина в зависимости от объекта исследования и вида эритроцитов Вариант Вид эритроцитов Разведение Титр лектина по опыта белка РГА 0,1% взвесь эри­ троцитов курицы I : 8 I : 4 Проростки 0,1% взвесь эри­ люпина троцитов курицы I : 3 I : 128 0,2% взвесь эри­ троцитов барана I : 1,5 нет агглютинации 0,1% взвесь эри­ троцитов курицы I : 3 I : 128 Семена 0,$ взвесь эри­ люпина троцитов человека I : 3 I : 2 0,1% взвесь эри­ троцитов человека I : 8 I : 4 Клубеньки 0,1% взвесь эри­ растений троцитов курицы I : 3 I : 64 Растения выращивали в кюветах, заполненных речным пес­ ком, куда вносили питательную смесь Гельригеля с 2,5 или 1,5 нормы азота. Контрольный вариант был без азота и инокуляции. Анализировали верхний и нижний участки корня. Было показа­ но (таблица 2), что минеральный азот увеличивает уровень ра­ створимых лектинов в корнях люпина на первых этапах роста растения, однако это не может служить косвенным доказатель­ ством участия лектинов в процессе узнавания клубеньковыми бактериями бобового растения, так как высокие концентрации азота ингибируют образование клубеньков. В то же время ино­ куляция семян люпина перед посевом клубеньковыми бактериями также увеличивает активность лектина в нижней части корня. У 3-дневных растений на фоне высокой дозы азота лектиновая ак­ тивность выпе в верхнем участке корня. 120 Таблица 2 Влияние азота и инокуляции на содержание лектина в корнях проростков люпина (Активность в 50 мкл, ЕА) Фракции 3-дневные 10-дневные Варианты дан, участки корня % верхний нижний верхний нижний Контроль 30 4 4 16 16 без азота 40 8 8 50 - 4 4 8 60 2 4 4 4 76 4 4 16 16 1,5 нормы 30 64 4 4 4 азота 40 64 32 8 8 50 16 16 16 32 60 32 16 4 4 76 8 8 16 8 Инокуляция 30 4 4 8 128 40 + 4 16 32 50 + + 4 32 60 2 4 8 16 76 4 4 16 16 1,5 нормы 30 4 4 4 16 азота + ино­ куляция 40 32 2 8 4 50 64 4 32 8 60 128 4 8 4 76 128 2 2 4 Примечание: - - отсутствие активности + - фракция активна без раз ведения Обнаружен сложный характер зависимости активности лекти­ нов от наличия минерального азота и инокуляции, но явно про­ является стимулирующее действие инокуляции как в верхнем участке корня (зоне дальнейшего образования муфты клубень­ 121 16 ков), так и в нижнем - зоне корневых волосков. Таким образом, увеличение активности лектина в ответ на инокуляцию специфическими к данному бобовому растению клу­ беньковыми бактериями служит подтверждением лектиновой гипо­ тезы распознавания партнеров при установлении симбиоза. Л и т е р а т у р а 1. Базилинская М.В. Использование биологического азота в земледелии. Обзорная информация. ВНИИТЭИСХ. - М., 1985. С. 56. 2. Кругова О.Д., Малгченко С.М., Гладун М.В. // Тези допов1дей, У Укр. б1ох1м: 3- и зд.,част. 2. - Ки1в. 1987. - 31 с. 3. Линевич Л.И. // Успехи биол. химии. - 1979. - Т. 20.- С. 71-94. 4. Луцик М.Д., Панас ю к E.H., Луцик А.Д. Лектины.- Львов: Вища школа - 198I. - С. 149. 5. Dazzo F.B., Georges L. Truchet. Interactions of Lec­ tins and their Saccharide Receptors in the Bhizobium // J. Membrane Biol. - 1983» - Vol. 73« - P. 1-16. 6. Dazzo F.B., Johke W.E., Brill W.J. // Biochim.et bio- phys. Acta. - 1978. - Vol. 35. - N 539* - P. 276-286. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА ЛЕКТИНОВ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS B.C. Подгорский, Э.А. Коваленко Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР, г. Киев Бактериальные лектины в настоящее время вызывают при­ стальное внимание ученых в связи с возможностью их примене­ ния наряду с растительными, а также ввиду ряда преимуществ по сравнению с последними (они обладают высокой удельной ак­ тивностью, большим разнообразием по углеводной специфично­ сти; получение бактериальных лектинов более технологично и 122 т.д.). Особый интерес представляют продуцируемые в среду, так называемые лектины "свободного типа" или внеклеточные лектины, что связано с простотой их выделения и дешевизной получаемых препаратов. Об этой группе лектинов имеются лишь единичные сообщения /4, 5, 6/, данные же о физиологических особенностях роста бактерий - продуцентов внеклеточных лек­ тинов - и закономерностях биосинтеза этих биологически ак­ тивных веществ отсутствуют. Эффективность процессов синтеза, осуществляемых бактери­ ями, зависит прежде всего от физиологических свойств бакте­ рий, состава питательной среды и способов ведения процесса. Обеспечив оптимальные условия глубинного культивирования продуцентов, можно достичь значительного увеличения их про­ дуктивности. Так как синтез внеклеточных лектинов (как и ци- топлазматических) регулируется окружающей средой, нами было изучено влияние внешних условий на образование этих соедине­ ний с порообразующими аэробными бактериями рода Bacillus (на примере представителей наиболее распространенного вида В.subfcilis; штаммы: 605 ИМВ, 668 ИМВ, 685 ИМВ из коллекции отдела антибиотиков ИМВ АН УССР). Определение динамики накопления лектинов в культуральной жидкости при росте продуцентов в периодическом режиме куль­ тивирования и при использовании различных биостимуляторов показало, что для каждой культуры временной промежуток син­ теза лектинов ограничен поздней экспоненциальной и ранней стационарной фазами роста бактериальных штаммов /I, 2/, что является особенностью внеклеточных лектинов бацилл. Установ­ лено также, что температура 37°С является оптимальной как для роста продуцента, так и биосинтеза лектинов (рисунок I). Данные представляются нам интересными,так как для лекти­ нов, секретируемых в экспоненциальной фазе роста, непрерыв­ ное культивирование (хемостат) может обеспечить идеальные условия для достижения устойчивых уровней этих внеклеточных белков. Для выполнения определенных функций лектины бактерий должны четко реагировать на среду, непосредственно окружаю­ щую данный микроорганизм, и, следовательно, состав пита­ тельной среды может оказывать определенное влияние на био­ синтез лектинов бациллами. 123 16* рГА /титр / Рис. I. Влияние температуры культивирования на динамику биосинтеза внеклеточных лектинов В.s ub tills : рГА - реакция гемагглютинации; штаммы: I - 605 ИМВ, 2 - 668, 3 - 685 ИМВ; температура: А - 37°С; Б - 30°С; В - 42 С 124 Поскольку лектины являются угл ево довязывающими белками, необходимо было установить взаимосвязь между наличием в сре­ де того или иного углевода и лектинпродуцирующей способнос­ тью культур, а также выяснить роль отдельных углеводов в ре­ гуляции синтеза лектинов. С этой целью глюкоза в контрольной среде Гаузе /3/ заменялась на эквивалентное количество га­ лактозы, лактозы или фруктозы. Отмечена существенная зависимость удельной лектиновой активности культуральной жидкости исследуемых культур от внесения в среду определенных углеводов (рисунок 2). В от­ дельных случаях активность увеличивалась в десятки раз (ри­ сунок 2, В). ЛА. 60С 50С. 40С 300 200 100 I ŝsa. 12 3 4 12 3 4 12 3 4 Рис. 2. Влияние различных углеводов в среде на биосинтез внеклеточных лектинов В. aubtlltas ЛА - титр" рГА/мг белка в им культуральной жидкости; штаммы: А - 605 ИМВ; Б - 668 ИМВ; В - 685 ИМВ; углеводы: I - глюкоза; 2 —галак­ тоза; 3 - лактоза; 4 - фруктоза 125 Так как одни и те же углеводы могут выступать в качестве индукторов синтеза лектинов для одних штаммов и репрессоров для других, мы считаем, что регуляция секреции лектинов может осуществляться доступными источниками углерода. Проведенные нами исследования являются начальным и необ­ ходимым этапом работы с бактериями - продуцентами лектинов, который позволит перейти к дальнейшей более тонкой физиоло­ гической и биохимической регуляции, а также улучшению лек- тин продуцирующей способности штаммов методами генной инжене­ рии. Для этого требуется индивидуальный подход к каждому ор­ ганизму с учетом знания динамики биосинтеза лектинов и влия­ ния на этот процесс факторов внешней среды. Л и т е р а т у р а : 1. Подгорский B.C., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. // Микробиол. журн. - 1988. - Т. 50. - 2. - С. 12-16. 2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. // Киев: Наукова думка, 1982. - 278 с. 3. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокул ова И.Б. // Киев: АН УССР, Минздрав УССР, 1983. - 49 с. 4. Das Gupta В.Е., Sugijama Н. // Can. J. Microbiol. 1977. - Vol. 23. - P. 1257-1260. 5. Gilboa-Garber N. // Mefch. Enzymol. - 1982. - Vol.85.- P. 378-585. 6. Sheladia V.L., Charber J.P., Guevara J., fivans D.J. // J. Bacterid. - 1982. - Vol. 152. - N 2. - P. 757-761. ПРИНЦИПЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АГГЛЮТИНАЦИИ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛЕКТИНОВ НА ОСНОВЕ МЕТОДА СПЕКТРОТУРВВДИМЕТРИИ И.Б. Жулин, С.Ю. Щеголев Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР, г. Саратов Недостатками ряда известных методов исследования кле­ точной агглютинации являются их невысокая информативность и низкая точность (визуальное определение титра агглютинации в 126 лунках, микроскопия, включая цитохимические методики, фото­ метрия при одной длине волны света А /10/, либо сложность методик и их приборного обеспечения (кондуктометрические и флуоресцентные счетчики частиц, лазерная фотон-корреляцион­ ная спектрометрия /I/). В работах /2, 8/ для количественного анализа ранних ста­ дий агглютинации, на которых примерно за 30<-60 мин образуют­ ся агрегаты из нескольких частиц (максимально порядка деся­ ти), использован метод спектротурбидиметрии /4, 7/, реали­ зуемый на обычной спектрофотометрической аппаратуре (ФЭК, СФ, Спекорд и т.п.). При использовании традиционного вариан­ та метода /4, 7/ для клеток с диаметром d около I мкм (бак­ терии и некоторые форменные элементы крови1 или для частиц с d 0,1 мкм (споры ряда бактерий, некоторые вирусы, рибосо­ мы, отдельные типы липосом и мембранных везикул) погрешности определения размера и числовой концентрации частиц N дости­ гают максимумов /6/ (порядка 30% для d и более 60% для N ). Как будет показано в данной работе, отмеченные затрудне­ ния можно устранить, если ограничить задачу корректным опре­ делением относительных изменений размера и концентрации час­ тиц при агглютинации. При этом существенно упрощаются проце­ дуры определения изменений d и К . В частности, отпадает необходимость в использовании специальных калибровок /4, 6, 7/ и компьютерной обработки результатов с пектро турбидимет­ рии /7/. Учитывая, что при агглютинации объемная концентрация клеток (субклеточных или иных частиц) остается неизменной, можно получить 1 =. / N2 => d| / , (I) где N - число частиц (например, клеток или агрегатов) в единице объема суспензии, d - диаметр сферических частиц эквивалентной монодисперсной системы со значениями Н, рав­ ными числовой концентрации частиц реальной взвеси. Здесь и далее индексами "I" и "2" обозначены значения соответствую­ щих параметров до и после агглютинации. Параметр 1 показыва- Т£7 ет во сколько раз уменьшается концентрация Ы и, кроме того, ему можно придать смысл среднего эффективного числа клеток (частиц), вошедших в состав одного агрегата /2/. Обозначая 1* измеренное значение i (в отличие от ис­ тинного - см. ниже), получаем !•= [(2 - п2) / (2 - пл)]1/2 , п< 2 (2) 1*= (D-, / Ои) 5 / (Н - 1) , П А 1 (3) где Д - оптическая плотность суспензии, п = - д lgD / д lg Л, 5 = (а, + xig) / 2. Величину п определяют по результатам из­ мерений Д при нескольких значениях Л. в диапазоне оптической прозрачности компонентов суспензий (ДА — 200-300 нм)/4,7/. По формуле (3) при 5 = 4 (d « 71 - рэлеевские частицы) 1* = = flg/Äj, при Б = 2 (d~ А ) 1* = (Ä2/flj)3, при Б = 0 (d?>A/ (f1 - Z4»), где Iй- и рс - показатели преломления частиц и ок­ ружающей их среды) i* = (flj/flg)3. Эффективность соотношений (2), (3) анализировали в компьютерном эксперименте, основные результаты которого приведены на рисунке I. По значениям и п2, рассчитанным для модели оп­ тически "мягких" сферических частиц /5/ при заранее заданных значениях 1 , определяли 1* , используя формулы (2),(3). Данная модель может служить хорошим приближением для описа­ ния некоторых оптических свойств суспензий агглютинирующих клеток или субклеточных частиц /9/. Сравнивая значения I" с I , оцениваем систематическую погрешность, которая является следствием ряда допущений, принятых при выводе формул (2), (3). Заметим, что при получении соотношения (3), не наклады­ вались принципиальные ограничения на показатель преломления, форму частиц и степень шлидисперности систем (в отличие от формулы (2)), а также на геометрию измерительного устройства (о влиянии последней см. работу /9/). Принимая во внимание, что стандартное оборудование поз­ воляет надежно регистрировать значения/ Д n|<>J 0,1 и I Äg/Äj - l|ž 0,03*0,05, находим, что i* отличается от i не более, 1Г0 2, Рис. I. Зависимость i* от п по формулам (3) и (2) (штрихи) при i =1,5 II), 2 (2), 2,5 (3) и 3 (4) чем примерно на 10% при выполнении условий: 1,5 < 14 5 при - 0,5 4 п 4 1,7 (для формулы (2)); 1,2 < i < 5 при 1,6 4 5 < 4 и 1,2^ 1 < 2,5 при - I <С 5 0,5 (для формулы (31). Ограничение по I сверху не является существенным, по­ скольку при больших значениях i временной интервал агглюти­ нации можно разбить на последовательные отрезки с оптималь­ ными изменениями параметров (например, с и ) и найти значение 1* для исходного интервала по очевидному равенст­ ву j.* = i* • ). Данный прием позволяет расширить область применения формул (2), (31 по параметру Е . Значения 5 > 2 характерны для клеток и субклеточных 129 17 частиц с d < I мкм (некоторые бактерии и их споры, вирусы, рибосомы, ли по сомы и мембранные везикулы), 5 4 2 - а> I мкм (крупные бактерии, тромбоциты и др.),П~ I - а — 5-10 мкм (эритроциты, хлоропласты, митохондрии и т.д.), 5 — 0 - d ^ 10 мкм (дрожжи и т.п.). Важно, что погрешность определения i* по формуле (3) достаточно мала вблизи значений 5 = 4 и п = 2 (см. выше). о о о - 2 + -3 а - 4 20 60 WO Рис. 2. Зависимость i от времени t при агглютинации WGA (50 мкг/мл) и,2) и СопА (100 мкг/мл) (3) подвижных (I) и обездвиженных (2) клеток A.brasilenae Sp 245 и St.aureus 209-Р (3) в сравнении с контролем (A.brasilense Sp 245 без лектина) (4) На рисунке 2 приведены результаты экспериментального анализа реакции агглютинации бактерий Staphylococcus aureus 209-Р и Azosptrillum brasLlense Sp 245 под действием Con А и WGA ( PharmacLsb. Использовали подвижные и обездвиженные (до­ бавление Ю мкМ карбонилцианид-хлорфенилгидразона), не ли­ шенные жизнеспособности клетки. A.brasilenae. Условия выра­ 130 щивания и препарирования культур приведены в работах /3, 2/. Постановка опытов по агглютинации была аналогична описанной ранее /2/. Спектротурбидиметрию проводили на приборе СФ-26, снабженном диафрагмой для уменьшения эффекта малоуглового рассеяния света /9/. Скорость увеличения параметра 1* для стафилококков, со­ держащих приблизительно по 10 клеток в исходных агрегатах, оказалась примерно вдвое ниже, чем для первоначально одиноч­ ных клеток аэоспирилл. Установленное нами фактическое совпа­ дение скоростей реакции агглютинации подвижных и обездвижен­ ных клеток A.brasilense Sp 24-5, вероятно, иллюстрирует от­ меченную в работе /II/ способность подвижных бактерий к аг­ регации в естественных условиях их обитания. Л и т е р а т у р а : 1. Ерш И.Г., Муратов Л.С., Новожилов С.Ю., Штокман Б.М., Штокман М. И. // Доклады АН СССР. - М., 1986. - Т. 287. С. 1239. 2. Жулин И.Б., Панасенко В.И., Ступникова С.К., Щеголев С.Ю. // Биофизика, 1984. - Т. 29. - С. 857. 3. Жулин И.Б. // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1988. 4. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характерис­ тические функции светорассеяния дисперсных систем. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1977. 5. Хюлст вая де Г. Рассеяние света малыми частицами. - М.: Изд-во иностр. лит., 1961. 6. Хлебцов Н.Г., Щеголев С.Ю., Кленин В.И., Френкель С.Я. // Оптика и спектроскопия. - 1978. - Т. 45. - С. 710. 7. Кленин В.И., Хлебцов Н.Г. Применение мини- и микро­ эвм при определении параметров дисперсных систем спектротур- бидиметрическим методом. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1984. 8. Щеголев С.Ю., Семак H.H., Котусов В.В., Игнатов В.В. A.C. 1251908 СССР. - 1986. Б.И. - 31. 9. Latimer P., Wamble F. // Appi. Opt. - 1982. - Vol.21. - P. 244-7. 10. Liener I.E. // Arch. Biochem. Biophys. - 1955,- Vol. 54. - P. 223. 131 17* 11. Sjoblad R.D., Doetch R.N., Emala C.W. // Arch. Micro­ biol. - 1985. - Vol. 142. - P. 101. ЛЕКТИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ ЗАВЯЗЫВАНИЯ 1Ш0Д0В И ЭМБРИОГЕНЕЗА У ГРУШИ ПРИ РАЗНЫХ ФОРМАХ ОПЫЛЕНИЯ В.Н. Само родов, С.В. Поспелов Сельскохозяйственный институт, г. Полтава На значимость лектинов в прохождении эмбриональных про­ цессов впервые обратили внимание советские ученые, сформули­ ровав димерную гипотезу несовместимости у растений с участи­ ем фитогемагглютининов /3/. В настоящее время роль лектинов в оплодотворении глубоко и всесторонне изучается, о чем свидетельствуют материалы международной конференции "Биотехнология и экология пыльцы", проходившей в июле 1985 года в Массачусетсом университете, США /6/. Общим выводом этих работ является то, что в основе реакции самонесовместимости у цветковых растений лежит взаи­ модействие между лектинподобными компонентами пыльцы и ре­ цепторами пестика-гликопротеинами. Однако исследований по регуляции эмбриональных процессов экзогенными лектинами явно не достаточно /1-2; 4; 5/. Тем не менее данные этих работ указывают на высокую физиологическую активность лектинов и перспективность их применения в селек­ ции, генетике, растениеводстве. У.читывая это, мы на протяжении трех лет изучали влияние лектина пестиков кукурузы - конмаидина, на завязывание пло­ дов и образование семян у двух сортов груши при естественном и искусственном самоопылении, а также в отсутствие опыления. Было установлено, что конмаидин при нанесении на цветки увеличивает завязывание плодов, как в отсутствие опыления, так и при самоопылении. При этом эффект стимуляции определя­ ется концентрацией вещества в довольно широких пределах, от 0,1 до 0,0001% (таблица II. Это еще раз убеждает нас, что лектины имеют отношение к проявлению самонесовместимости у растений. В связи с этим важно и то, что созревшие плоды в подавляющем большинстве не содержат семян, являясь партено- карпическими. Интересно, что сходные данные по стимуляции 132 партенокарпии были получены от воздействия лектина фасоли обыкновенной на цветки груши сорта Вильяме и мужскостериль- ные формы томата /5/. Таблица I Влияние конмаидина на завязьюание плодов у груши сорта Любимица Клаппа (среднее за три года) Созревших плодов. % В а р и а н т в отсутствие естественное опыления самоопыление Без обработки (контроль1 0,00 2,25 Обработка раствором конмаидина, % ОД 1,07 4,25 0,01 1,98 6,73 0,001 3,62 3,44 0,0001 4,67 3,92 0,00001 2,10 2,10 Естественное перекрестное о пыление 2,83 2,83 Примечание: Различия существенны на 1-5% уровнях значимости. Полученные в результате действия конмаидина партенокар- пические плоды по степени своего развития не уступают плодам контроля. Для максимальной стимуляции завязывания партено- карпических плодов конмаидин следует наносить дважды, с ин­ тервалом в сутки, в фазу полного цветения или начала опаде­ ния лепестков. Полученные в наших экспериментах бессемянные плоды не столь сужены, как те, которые завязываются при действии на цветки ауксинов и гиббереллина, не имеют наростов и разрас­ таний в области чашечки. Подобная закономерность для бессе­ мянных плодов груши и томата отмечалась ранее при использо­ вании лектинов бобовых культур /5/. Это свидетельствует о различиях механизмов регуляции развития бессемянных плодов на вариантах с конмаидином и при использовании ауксинов и гиббереллина. Следует отметить и то, что конмаидин более ак­ 133 тивен в стимуляции партенокарпии у груши, нежели кинетин и ауксины, уступая лишь гиббереллину. У сортов, склонных к генетическому апомиксису, в отсут­ ствие опыления конмаидин стимулировал завязывание плодов с семенами. В среднем на один плод приходилось не более двух семян, йэ некоторых семян получены матроклинные сеянцы. Описанные эффекты действия конмаидина внедрены в произ­ водство, защищены авторским свидетельством СССР. Л и т е р а т у р а : 1. A.C. I165337 А (СССР) Способ стимулирования партено­ карпии у груш - В.Н. Самор одов, Е.Л. Голынская, С.В. Поспе­ лов, А.И. Коваль, В.А. Слепцов, B.C. Фисун. Заявл. 21.04. 1983, 3583411; Опубл. в Б.И., 1985, 25; МКИ А 01 65/00. 2. Болелова З.А., Лесневич Л.А. Петрушина М.П. и др. // Сельхоз. биология. - 1984. - 2. - С. 57-60. 3. Голынская Е.Л., Глеба Ю.Ю. // II съезд Всесоюз. о-ва генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова / Москва: 31 янв. - I февр. 1972 г. / - М.: Наука, 1972. - Вып. I. - С. 48. 4. Машанов В.И., Шоферистова Е.Г. // Всесоюзное совеща­ ние по отдаленной гибридизации растений и животных (Москва, 3-5 февр. 198I г.) М.: ВАСХНИЛ. 198I. - С. 369-370. 5. Bangerth F., Götz G., Buchloh G. // Pflanzenphysiol.- 1972. - Vol. 66. - H 4. - S. 375-377. 6. Mulcahy D.Z., Mulcahy G.B., Ottaviano E. // Biotech­ nology and Ecology of pollen. Springer. - New York, 1986.- 528 p. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКТИНОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЯ И30ФЕР МЕНТОВ ЩЕЛОЧНОЙ ВДСФАТАЗЫ ТЮЛЕНЯ И.Ю. Сахаров, В.М. Лахтин НИЛ биологически активных веществ гидробионтов МЗ СССР Щелочная фосфатаза (щелочная фосфоэстераяа, КФ 3.1.3.1.) катализирует гидролитическое расщепление различных фосфомо- ноэфиров с образованием фосфат-иона и соответствующего спир­ 134 та, фенола, липида или углевода /2, 3/. Хотя биохимическая роль щелочной фосфатазы понята не до конца, известно, что этот фермент активно участвует в процессах оссификации, транспорта фосфата, утилизации гликогена /5/. Известно, что изоферменты щелочной фосфатазы животного происхождения являются гликопротеидами, что позволяет ис­ пользовать для их идентификации и разделения иммобилизован­ ные лектины /I, 4/. Так, для определения изоферментного со­ става щелочной фосфатазы тюленя нами исследовалось взаимо­ действие ферментного препарата с лектинами чечевицы, пшеницы и улитки. Как видно из таблицы, первые два лектина эффектив­ но ассоциируют с молекулами щелочной фосфатазы, в то вре­ мя как лектин улитки индеферентен по отношению к изучаемому ферменту. Эти данные указывают на гликопротеидный характер тюленьей фосфатазы. Учитывая одинаковую моносахаридную специфичность лектина чечевицы и конканавалина А, мы с помощью колоночной хромато­ графии на иммобилизованном конканавалине А выделили иэофер- мент, специфичный к последнему лектину (изофермент К). При этом более 60% ферментативной активности сорбируется на аф­ финном носителе, тогда как другая теть, не взаимодействуя с конканавалином А, сходит с колонки в свободном объеме (пик I). Нам удалось гюказать, что в изоферменте К щелочной фос­ фатазы тюленя углеводы составляют 23% молекулярной массы. Изоферменты щелочной фосфатазы, содержащиеся в пике I, были подвергнуты дальнейшему анализу с применением лектинов гороха, пшеницы, клещевины и фасоли (таблица I). Большая часть ферментативной активности сорбируется на нерастворимом лектине пшеницы, в меньшей степени щелочная фосфатаза реаги­ рует с лектинами гороха и клещевины, а лектин фасоли с тю­ леньей фосфатазой не реагирует вовсе. На основании данных о взаимодействии фермента с лектина­ ми, для которых характерна олигосахаридная специфичность, на­ ми предложены следующие углеводные структуры для изофермен- тов щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя (рису­ нок I). Так,изофермент К содержит, по-видимому, углеводную последовательность типа I, связанную с остатком аспарагина белковой части молекулы фермента. К этому заключению мы при- 135 Таблица I Взаимодействие лектинов с препаратами щелочной фосфатазы тюленя Источник Процент сорбированного фермента лектина суммарный препарат щелочная фосфа- щелочной фосфатазы таза (пик I) Горох - 44 Пшеница 75 77 У литка 0 - Чечевица 65 - Клещевина - 15 Фасоль - 0 Таблица 2 Аминокислотный состав изофермента К щелочной фосфатазы тюленя кЬофермент К щелочной Щелочная фосфатаза Аминокислоты фосфатазы из тонкого из тонкого кишечника кишечника тюленя быка Asp 61 61 Thr 40 37 Ser 38 24 Glu 60 53 Pro 31 30 Gly 43 45 Ala 42 60 Val 38 42 He 23 12 Leu 50 38 Туг 14 20 Phe 25 15 His 27 14 Lys 35 22 Arg 22 21 * Данные рассчитаны на одну субьединицу фермента. 136 (Man) (Man)-Msm- Man J; Man-GlcNAc-Glc«Ac Asn Man -Man- Man NeuNAc-Gal-Glс NAc-Man 4-4 Man-GlcNAc-GlcNAc Asn MeuNAc-Gal-GlcNAc-Man/ Fuo (NeuNAc-Gal-GlcNAc) wan IleuNAc-Gal-GlcNAc/ \ ,Man-GlcNAc-GlcNAc Asn NeuNAc-Gal-GlcNAc^ / (Fui;) NeuNAc-Gal-GlcNAc/ Gal-GlсNAc yMan (NeuNAc)Gal-GlcNAc \ Man- Gl с HAc- Gl с NAc Asn NeuNAc-Gal-GlcUAc^ M̂an' NeuNAc-Gal-Glc NAcz Gal-GalNAc Ser/Thr Рис. I. Предполагаемые структуры углеводной части иэоферментов щелочной фосфатазы из тонко­ го кишечника тюленя: 1 - олигоманнозидного типа; 2 - комплексного типа (фукозилированные биантенные); 3 - комплексного типа (сиалированные три- и тетраантенные); 4 - комплексного типа (частично десиали- рованные три- и тетраантенные); 5 - муцинового типа шли на основании данных о его специфическом связывании с конканавалином А. Более того, в этой молекуле изофермента, которая также ассоциирует с лектином чечевицы, присутствуют олигосахариды типа 2. Наличие структур 3 и 4 в изоферментах 137 18 щелочной фосфатазы тюленя подтверждается взаимодействием с агглютинином пшеницы и лектином клещевины. По-видимому, не­ которая часть из этих полиантенных структур фукоз илиро вана, на что указывают данные, полученные с лектином семян гороха. Структуры типов 3 и 4 содержат блокированные остатки галак­ тозы (лейкоагглютинирующая форма лектина фасоли), причем концевым остатком в этих последовательностях является N-аце- тилнейраминовая кислота (лектин пшеницы). Отсутствие взаимо­ действия изоферментов щелочной фосфатазы с лектином улитки при наличии связывания с лектином клещевины указывает на вероятное присутствие структуры типа 5. Таким образом, приведенные факты свидетельствуют о нали­ чии минимум трех изоферментов щелочной фосфатазы в тонком кишечнике молодых особей (не более I месяца) тюленя. В связи с тем, что большую часть ферментативной активности в препа­ рате щелочной фосфатазы представляет изофермент К, специфи­ чески сорбирующийся на конканавалине А, именно этот фермент и был использован в дальнейших экспериментах. Препарат щелочной фосфатазы, элюиро ванный с конканавалин А-сефарозы, имеет удельную активность, равную 1500 единиц на мг белка. В электрофорезе в денатурирующих условиях мо­ лекулярный вес равен 70000, в то время как в градиентном электрофорезе в отсутствие денатурирующих воздействий моле­ кулярный вес фермента - 260000. Для изучаемого изофермента К щелочной фосфатазы тюленя был определен аминокислотный состав. Изофермент К содержит значительное количество отрицательно заряженных аминокислот, что и обусловливает, по-видимому, слабокислый характер моле­ кулы (pH = 5,5). Сравнение аминокислотного состава изофер­ мента К с составом щелочной фосфатазы из тонкого кишечника быка показало, что данные молекулы весьма схожи между собою. Однако следует отметить более низкое содержание в тюленьей фосфатазе остатков тирозина и аланина при одновременном обо­ гащении, хотя и незначительном, серином, изолейцином, лейци­ ном, фенилаланином, гистидином и лизином. В дальнейшем нами планируется детальное изучение молекулярных и каталитических свойств изофермента К щелочной фосфатазы тюленя и, в част­ ности, определение последовательностей 0- и N -связанных уг­ леводных цепей выделенного изофермента. 138 Л и т е р а т у р а : 1. Лахтин В.М. // Биотехнология, 1985. - Т. I. - 5. - С. 11-27. 2. Etile Н., Kuller Е., Horn А.// FE BS Letters.- 1985. - Vol. 183. - N 2. - P. 413-416. 3. Fernby H.H. // The Enzymea (Boyer D., ed.).- 1971. - Vol. 4. - P. 417-447. 4. KcComb R.B., Bowers G. N., Posen S. // Alkaline Phosphatase, Plenum Press. - New York, 1979. 5. Whitby L.G., Moss D.W. // Clin, et chim. acta. - 1975. - Vol. 59. - N 2. - P. 361-367. МЕЧЕНЫЕ ЛЕКТИНЫ В ИЗУЧЕНИИ ПОВЕРХНОСТИ РАЗВИВАЮЩИХСЯ НЕРВНЫХ КЛЕТОК Г.Г. Скибо, Л.М. Коваль, М.Д. Луцик, H.H. Кононенко Институт физиологии им. A.A. Богомольца АН УССР, г Киев Институт биохлмии им. A.B. Палладина АН УССР, г. Львов Процессы клеточной дифференцировки имеют основополага­ ющее значение в понимании нормального органогенеза и эмбрио­ нального созревания. Значительное место в этих процессах от­ водится межклеточным взаимоотношениям, главная роль в кото­ рых принадлежит поверхностной мембране. В связи с этим для определения некоторых факторов, участвующих в дифференциров- ке нервной ткани, необходимо знание структурных компонентов мембран нервных клеток в процессе их развития у функциональ­ но различных типов нервных и глиальных клеток, сопровождаю­ щих процесс дифференциро вки. Согласно современным представ­ лениям, в качестве структур, участвующих в процессах узнава­ ния, адгезии и дифференцировки выступают гликопротеиды и гликолипиды плазматической мембраны, часто объединяемые еди­ ным термином "г л и ко ко нъюгат ы" /3/. В настоящей работе приводятся результаты исследования углеводных компонентов поверхности развивающихся функцио­ нально отличных нервных и глиальных клеток с помощью лекти­ нов, маркированных электронноплотной меткой (коллоидным зо- 18* В качестве модельной системы были использованы моносдой­ ные культуры диссоциированных клеток спинного мозга и спи- нальных ганглиев, позволяющих иметь неповрежденную, легко доступную дл* реагентов поверхность мембраны нейронов на различных этапах их дифференцировки - от разобщенных нейро- бластов до стадии зрелых нейронов. Для диссоциации использовали спинной мозг и специаль­ ные ганглии 12-14-дневных мышинных эмбрионов, у которых в этот период завершается формирование двигательных и чувстви­ тельных нейробластов. Ткани диссоциировали механическим спо­ собом и культивировали в монослое по ранее описанной методи­ ке /I/ в течение 12 суток на акларовой подложке, покрытой уплотненным коллагеном или поли- 1 -лизином. Идентификацию функционально различных клеточных типов (нейронов спинного мозга и чувствительных ганглиев) осуществляли с помощью све­ тового микроскопа. После проведения цитохимической реакции ультратонкие срезы залитых в эпон-аралдит участков клеточно­ го монослоя, содержащего тела названных типов клеток, про­ сматривали на электронном микроскопе JEM -IOOOX. В работе использовали набор коньюгированных с золотом лектинов, обладающих специфичностью к следующим углеводным детерминантам: I) N-ацетил-Д-галатоэамину - лектин Helix pomafcia-HPL, Phaaeolus 1imenais-LBA; 2) и-ацетил-глюкозами- ну и N-ацетил-нейраминовой кислоте - лектин Trifcicum vul­ gar Ls-WGA$ 3) N-ацетил-лактоэамину - лектин Ricinus сопшш- nis-RCA; 4) 1-фукозе - лектин Lõbus fcetragonolobua-TPL; 5) Д-маннозе - лектин Lens culinaria-LcL. Величина гранул кол­ лоидного золота варьировала от 16 до 20 нм. Контрольные экс­ перименты на специфичность связывания лектинов проводили в присутствии 0,5 М соответствующего углевода ингибитора. Изучение нейронов и глии монослоя на 12-ые сутки культи­ вирования показало, что на плазмалемме обоих типов нейронов экспонированы Н-ацетилгалактозамин, Ы-ацетиллактозамин, Н- ацетилхитобиозамин и нейраминовая кислота, Д-манноза. Изуча­ емые нейроны не имели детерминант, содержащих L-фукозу, ко­ торые четко выявлялись на мембране глиальных клеток. Плотность и распределение одинаковых углеводных остатков на поверхности мембраны различных типов нейронов имели су­ 140 щественные отличия. Комплексы HPL-AU на мембране нейрона чувствительного ганглия были достаточны многочисленны, гра­ нулы золота располагались в виде кластеров. Места связывания на мембране нейронов спинного моэга были редкими, располага­ лись без определенной ориентации, в виде единичных гранул. Тройные по отношению к N-ацетил-Д-глюкозаминным остаткам и нейраминовой кислоте комплексы WGA-AU были, напротив, немно­ гочисленны на мембране нейронов спинальных ганглиев и мно­ жественными - на поверхности сомы мультиполярных нейронов спинного моэга, однако в обоих случаях они располагались по периметру соматической мембраны одинаково в виде кластеров. Распределение N-ацетил-лактозаминовых остатков, выявляемых КСА-Ди, было аналогичным распределению меченого HPL. Наибо­ лее выраженной для двух типов клеток была разница в плотнос­ ти размещения углеводных детерминант, связывающих RCA: очень высокая на мембране чувствительной клетки, где гранулы рас­ полагались настолько плотно друг к другу, что могли образо­ вывать сплошную линию, и очень низкая- на поверхности клетки спинного мозга, где отмечались единичные гранулы золота по всему периметру соматической мембраны. Лучение топографии гликоконыогатов поверхности отдель­ ной нервной и глиальной клеток в процессе дифференцировки на различных сроках культивирования обнаружило, что хотя общие характеристики углеводного кода функционально разных нейро­ нов, описанных выпе, сохраняются, тем не менее имеют место различия в структуре и распределении углеводных детерминант в пределах отдельных участков нервной клетки (сома, аксон, дендриты, конусы роста, контакты). Так, например, в пределах нейрона спинного моэга отмечалось прогрессивное увеличение мест связывания HPL и WGA лектинов по направлению от сомы к отросткам. Связывание КСА характеризовалось противоположной тенденцией, аксоны и дендриты содержали большое количество мест связывания с кластерным распределением. Конусы роста не связывали лектины, за исключением RCA . В межклеточных щелях выявлялись довольно многочисленные детерминанты ЕВА. Обнаруженные различия в распределении углеводных детер­ минант на поверхности мембраны отдельных участков нервной клетки позволяют предполагать, что они являются отражением 141 различий в функционировании каждой из областей нейрона на соответствующем этапе его дифференциро вки /2/. В то же время функционально различные типы нервных клеток могут иметь свою, специфичную углеводную сигнатуру наружной поверхност­ ной мембраны. Такой вывод позволяет согласиться с гипотезой R.W.Sperry /4/, утверждающей, что нейроны, в зависимости от занимаемого ими положения в определенной системе, могут иметь химические различия в виде соответствующих меток на поверхности, которые позволяют аксонам узнавать либо анало­ гичную, либо комплементарную метку на поверхности нейронов- мишеней. Пэследнее предполагает участие плазмалеммальных уг­ леводных кодов в механизмах, определяющих морфогенетические события как на уровне развивающегося нейрона, так и на уров­ не, характеризующем развитие нервной системы в целом. Л и т е р а т у р а : 1. Скибо Г.Г., Коваль Л.М. Ультраструктурные характери­ стики синаптогенеза в монослойных культурах спинного мозга. - Нейрофизиология. - 1984. - Т. 16. - 3. - С. 336-343. 2. Скибо Г.Г., Коваль Л.М., Луцик М.Д. Электронноцитохи- мическое выявление углеводных детерминант поверхностной мем­ браны культивируемых нейронов. - ДАН СССР, 1988. - Т. 300. - 4. 3. Moscona A.A. The cell Surface In Development.John Wi­ ley. Sons Inc. - New York, 1974. - P. 186. 4. Sperry R.W. Chemoaffinifcy in orderly growh of herve fiber patterns and connections. - Froc. Nat. Acad. Sei. US.- 1963. - Vol. 50. - P. 703-711. ЛЕКТИНЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА ПОВЕРХНОСТИ ЛИПОСОМ. РАЗЛИЧИЯ В СВЯЗЫВАНИИ НОРМАЛЬНЫМИ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ Л.В. Гордеева, A.A. Богданов (мл. 1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Институт экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР, г. Москва Известно, что на поверхности животной клетки имеются уг- 142 леводсодержащие центры связывания лектинов. Количество этих центров не увеличивается при злокачественной трансформации клетки /3; 5/. Однако трансформированные клетки способны агглютинировать в суспензии при гораздо более низких (5-10 раз) концентрациях лектинов, чем нормальные /4/. Остается неясным., какие особенности поверхности трансформированной клетки придают ей поваленную способность к агглютинации. Мы предлагаем модель для изучения межклеточной агглюти­ нации, где одна из взаимодействующих клеток заменена на ли- посому с иммобилизованным на ее поверхности лектином. Получение малых моноламеллярных жпосом, коныогированных с конканавалином А (сопА), было описано ранее /I/. В данной работе были использованы также липосомы, коныогиро ванные с агглютинином из завязи пшеницы (WGA/5/). Эксперименты выпол­ няли на различных линиях нормальных и трансформированных мы­ шиных фибробластов: МЭФ (мыпиные эмбриональные фибробласты), L , 313,SV 313. Клетки выращивали на покровных стеклах, отмы­ вали от среды и инкубировали в капле суспензии липосом при 37°С в течение 15-20 мин /I/. В ряде опытов клетки снимали со стекол раствором Версена, отмывали и использовали в виде суспензии. Степень связывания липосом, коныогиро ванных с лектином (лектин-липосом), с поверхностью клеток оценивали с помощью микрофлуориметрии. Для этого в липосомальную мембра­ ну вводили флуоресцентный маркер периленоилфосфатидилхолин. Флуоресценцию измеряли в относительных единицах. Ноль при­ бора устанавливали по собственной флуоресценции клеток, от­ мытых от среды раствором Хенкса. В каждом эксперименте изме­ ряли флуоресценцию 3-4 участков площадью 3,1 мкм^ на поверх­ ности каждой из 15-20 клеток. После отмывки от несвяэавшихся липосом на поверхности клеток сохранялась диффузная флуоресценция. Специфичность сорбции липосом оценивали по подавлению их связывания с клетками в присутствии ингибиторов. Так, в случае con А-ли- посом связывание подавлялось на 70-75% при добавлении в ин­ кубационную среду «л-метил-D-маннопиранозида (таблица I). Однако оно не уменьшалось, если клетки предварительно обра­ батывали ли го сомами без лектина. фи использовании WGA -липо­ сом 80% связывания угнеталось в присутствии N-ацетилглюкоз- 143 амина. Ту часть тотального связывания, которая исчезала при инкубациях с соответствующими сахарами, мы стали называть "специфическим" связыванием, т.е. обусловленным взаимодейст­ вием клеточных рецепторов с лектинами на поверхности липосом (таблица 2). Таблица I Микрофлуориметрия клеток, инкубированных с con А-липосомами* Клетки ос -метил- D -маннопира- Й1тенсивность флуорес­ нозид (20 мМ) ценции, отн. ед.зех L — 16,2+0,5 + 4,8+0,3 - 15,8+0,9 + 3,2+0,3 МЭФ - 6,5+0,2 + 2,1+0,4 МЭФ*** - 9,7+0,6 + 2,8+0,2 SV зтз - 12,5+1,1 + 3,0+0,3 313 - 4,3+0,1 + 1,1+0,1 Примечание: * Концентрация липида I мг/мл, ** Измеряли интенсивность флуоресценции единицы площади клеточной поверхности. Результаты представлены в виде М +m (15-20 клеток), *** Клетку предварительно обработаны трипсином Таблица 2 Микрофлуориметрия клеток, инкубированных с WGA-ли по сомами * Клетки в- ацетилглюкозамин Интенсивность (50 MNT) флуоресценции L - 45,0+0,2 + 9,0+0,2 144 Продолжение табл. 2 I 2 3 МЭФ _ 21,0+0,9 + 4,0+0,2 Примечание: * Концентрация липида 1,7 мг/мл. Проведено сравнение связывания лектин-липосом с двумя парами линий нормальных и трансформированных фибробластов: МЭФ-L , 3T3-SV 313. Установлено, что клетки линии L специ­ фично связывают в 2,5 раза больше con А-липосом и в 2 раза больше WGA-лигосом на единицу поверхности клетки, чем эм­ бриональные фибробласты. На поверхности SV ЗТЗ клеток специ­ фическое связывание con А-липосом было в 3 раза выпе, чем на клетках линии ЗТЗ (таблицы I, 2). Тот же эффект был получен на суспендированных клетках. Трансформированные фибробласты линии L , обработанные con А-ли по сомами в суспензии, флуорес­ цировали в 2,5 раза ярче, чем нормальные фибробласты. Для пары линий фибробластов Ь и МЭФ установлена зависи­ мость связывания con А-липосом от концентрации внесенного в инкубационную среду липида. С L-клетками связывается в 2-2,5 раза больше con А-липосом в широком диапазоне концентрации липида (от 0,01 до I мг/мл). Дополнительные измерения пока­ зали, что в указанном диапазоне сохраняется линейная зависи­ мость интенсивности флуоресценции от концентрации флуорес­ центного липида. Кратковременная обработка мыл иных эмбриональных фибро- бластов трипсином приводила к увеличению специфического свя­ зывания con А-липосом в 1,6 раза. Трипсинизация L-клеток не вызывала такого эффекта (таблица I). По контрасту с con А- ли по сомами связывание липосом без лектина с МЭФ и L было примерно одинаковым и уменьшалось в 2 раза после обработки трипсином. Различия в связывании лектин-липосом нормальными и тран­ сформированы ьми клетками нельзя объяснить оптическими эффек­ тами, обусловленными разницей в степени распластанности нор­ мального и трансформированного фибробласта. В таком случае 145 19 мы бы наблюдали аналогичные различия в связывании флуорес­ центно меченых лектинов. Однако, свободный конканавалин А при использовании высоких концентраций (50-200 мкг/мл) свя­ зывался даже лучше (в 1,2 раза) нормальными фибробластами линии МЭФ, чем L-клетками. Это связывание угнеталось на 90% в присутствии Л. -метил- D-маннопиранозида.Свободный WGA. (100 -200 мкг/мл) в 1,1 раза лучше связывался МЭФ по сравнению с L . Это связывание также было специфично. Таким образом, молекула лектина, присоединившись к липо- соме, приобретает новое свойство, которого не было у свобод­ ных лектинов: повыпенное сродство к трансформированным, а также к обработанным трипсином нормальным клеткам. Такое же свойство приобретает молекула лектина, присоединившись к по­ верхности клетки. Поскольку мембрана литюсомы является мо­ делью клеточной мембраны, хотя и крайне упрощенной, можно предположить, что и механизмы связывания лектин-липосом с клетками сходны с механизмами опосредуемого лектинами связы­ вания клеток друг с другом. Известно, что трансформированные фибробласты имеют более ворсинчатую поверхность, чем нормальные. Возможно, ворсинки облегчают многоточечное связывание лектин-лигосом, что при­ водит к образованию более стабильных комплексов липесом с клеткой. В настоящее время мы предпринимаем попытки визуали- зовать лектин-липосомы на поверхности нормальных и трансфор­ мированных фибробластов с помощью трансмиссионной электрон­ ной микроскопии. Каково бы ни было объяснение избирательного связывания трансформированными клетками липосом с иммобилизованным лек­ тином, из представленной работы можно сделать следующие вы­ воды: 1. Важные свойства опосредуемого белком межклеточного узнавания могут быть воспроизведены в более простой системе про тео ли по со ма клетка. 2. Иммобилизация векторных молекул на поверхности малых липосом приводит к существенным изменениям свойств самих ли­ посом, а именно, к приобретению способности избирательно связываться некоторыми типами трансформированных клеток. 146 Л и т е р а т у р а : 1. Богданов A.A., мл., и др. // Биол. мембраны, 1986. - Т. 3. - С. 674-684. 2. Bogdanov A.A., jr., Klibanov A.L., Torchllin V.P. // FEBS Letters. - 1988. - Vol. 231. - P. 381-384. 3. С line M.J., Livings ton D.O. // Mature New Biol.-1971. - Vol. 232. - P. 155-156. 4. Nicolson G.L. // Int. Rev. Cytol. - 197*. - Vol. 39«- P. 89-189. 5. Ozanne В., Sambrook J. // Nature New Biol. - 1971. Vol. 232. - P. 156-160. ВЗАИМОСВЯЗЬ ТРАНСПОРТА ИЭЮВ КАЛЬЦИЯ И ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ГИСТАМИНА ИЗ ТУЧШХ КЛЕТОК ПРИ ДЕЙСТВИИ КОНКАНАВАЛИНА А Е.З.Граевская, Г.М.Кравцов, Н.Н.Ломакин, E.H.Гончаренко Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова ЦНИЛ Минздрава СССР, г. Москва При взаимодействии Кон А с плазматической мембраной раз­ личных клеток изменяются ионные потоки и электрические свой­ ства мембраны, формирующие физиологический ответ (деление, секреция) /3/. Следствием рецепции Кон А на тучной клетке является усиление секреции из нее гистамина /5/. Известно, что повышение внутриклеточной концентрации Са^+ - триггер дегрануляции мастоцитов /2/. Предполагается, что лектин, по­ добно антииммуноглобулину Е, мобилизует пул кальция внеш­ ней среды /4/. Однако остаются практически не изученными следующие вопросы: I) влияет ли Кон А на электрический по­ тенциал мастоцитов, 2) какой путь (потенциал- или рецептор- зависимый) входа кальция предпочтителен при действии Кон А на тучные клетки, 3) какие механизмы участвуют в регуляции транспорта Са2+ и, как следствие, в дегрануляции мастоцитов. В настоящей работе мы исследовали влияние Кон А на мем­ бранный потенциал, транспорт ^Са^+, концентрацию свободного Ca + и секрецию гистамина из тучных клеток крыс. Кроме того, 147 1 9 * предпринята попытка изучить влияние модификаторов уровня цА№ на перечисленные процессы. Кон А в зависимости от концентрации усиливает высвобож­ дение гистамина из тучных: клеток крыс линии Kyoto Wis bar. Одновременно наблюдается увеличение концентрации свободного Са**+, измеренного с помощью флуоресцентного зонда quin 2 (рисунок I). Возникает вопрос, усиливает ли Кон А проницае- Высвобождение гистамина, % 20 X Са^+ , нМ 600 i 15 500 400 10 300 KL 200 100 0 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Рис. I. Влияние Кон А на концентрацию свободного кальция (I) и высвобождение гистамина (2) мость плазматической мембраны тучной клетки или лектин вы­ свобождает Са^+ из внутриклеточных депо. С этой целью иссле­ довано влияние Кон А на поглощение внеклеточного радиоак­ тивного кальция в нагруженных и ненагруженных quin 2 масто- цитах. Как видно из рисунка 2а, добавление Кон А к тучнш клеткам повыдает в них содержание ^Са^+. Результаты, полу­ ченные по транспорту ^Са^+ в нагруженные quin 2 мастоци- ты, свидетельствуют в пользу того, что Кон А увеличивает по­ ток радиоактивного кальция через плазматическую мембрану 148 Ca' Содержание гистамина, Ж нМ 800 - 100 700 600 500 400 300 200 100 0 О 10 30 50 100 Кон А , мкг/мл Рис. 2. Влияние модификаторов уровня цАМФ на концентрацию внутриклеточного кальция (а) и высвобождение гис­ тамина из тучных клеток (б), сти­ мулированных конканавалином А: Ii-КонА (50 мгк/мл); 2-дибутирил цА1® (I мМ); 3- форсколин (100 мкМ); 4- теофиллин (2 мМ); 5 - контроль 2+ тучных клеток (рисунок 21. Увеличение входа Ca может осу­ ществляться либо через потенциалэависимые, либо через рецеп- торзависимые каналы, либо по смешанному механизму. Деполяри­ зующие агенты: KCl, вератрин, уабаин не влияют на трансмем­ бранный потенциал, измеренный с помощью флуоресцентного кра­ сителя 3,3 дипропилтиодикарбоцианин йода dia-Cg- /б/, не изменяют внутриклеточную концентрацию свободного Ca и се­ крецию гистамина из тучных клеток. Следовательно, в тучных клетках процесс экзоцитоза не определяется трансмембранным потенциалом, и кальциевые каналы не оперируются потенциалом. Кон А (50 мкг/мл) несколько снижает флуоресценцию dis-Cg-(5\ 149 что свидетельствует о гиперполяризации мембраны (на 10-15 мВ). Таким образом, эффект Кон А на вход Са^+ не связан с деполяризацией плазматической мембраны тучной клетки с от­ крытием потенциалзависимых Са-каналов. Вероятно, основная часть Ca поступает в мастоциты через рецепторзависимые ка­ налы. Как известно, увеличение концентрации цАШ> в тучных клетках ингибирует их дегрануляцию /6/. В то же время, на­ пример для тромбоцитов, показано, что увеличение уровня цАМ$ блокирует рецепторзависимое поглощение кальция /I/. Можно предположить, что и в тучных клетках аденилатциклазная си­ стема и связанная с ней цротеинкиназа А регулирует актив­ ность рецепторзависимых Са-каналов. В наших экспериментах соединения, увеличивающие уровень цАШ> в клетках (теофиллин, форсколин, дибутирил-цАШ?), практически полностью ингкбируют вход ^Са + в мастоциты и устраняют дегрануляцию (рису­ нок 3). При действии дибутирил-цАМФ на тучные клетки, т.е. цри активации протеинкиназы А, наблюдается усиление фосфори- лирования белков с молекулярным весом 14-25 кДа, по-видимо­ му, влияющее на активность рецепторзависимых Са-каналов, ин­ дуцированных Кон А. Таким образом, гюлученные результаты позволяют заклю­ чить, что при действии Кон А на тучную клетку открыведатся рецепторзависимые кальциевые каналы и увеличивается внутри­ клеточная концентрация свободного Са^+, что приводит к сек­ реции, Механизм обратной регуляции активности этих каналов осуществляется, по-видимому, через протеинкиназу А, Л и т е р а т у р а : 1. Авдонин П.В., Алтухова И.П. Биохимия, 1985. -50, - С. 1235-1240. 2. Гущин И.С. // Немедленная аллергия клетки. - М.: Ме­ дицина, 1976. 3. Gelfand S.W., Cheung K.K., Mills G.B.. Grinste in 13. J. // Immunology. - 198?. - Vol. 138. - P. 527-531. 4. Ishizaka Т., Ishizaka K. // Progress In Allergy. - 1984. - Vol. 34. - P. 188-235. 150 5. Siraganin P.A., Siraganin R.P. // J. Immunology. 1974. - Vol. 112. - P. 2117-2125. 6. Winslow G.M., Austen K.P. // Progress in Allergy. - 1984. - Vol. 34. - P. 236-270. МОГУТ ЛИ ФЕРМЕНТЫ, ПРЕВРАЩАЮЩИЕ УГЛЕВОДНЫЕ СУБСТРАТЫ, БЫТЬ ЛЕКТИНАМИ? И.Н. Павлова Институт микробиологии и вирусологии АН УССР, г. Киев Вот уже полтора десятка лет ведется дискуссия вокруг оп­ ределения понятия "лектин". Отсутствие единого мнения иссле­ дователей объясняется не только недостаточностью наших зна­ ний о физиологической роли лектинов, но и неиссякаемым пото­ ком информации о наличии лектиновых свойств у Mira гочисленных белков с различными функциями. Являются ли они все лектина- ми? Официальное определение лектинов основано на критериях, предложенных I.J. Goldstein et ai. /4/: "Лектины - углевод- связывающие белки или гликопротеины иммунного происхожде­ ния, которые агглютинируют клетки и/или преципитируют глико- коныогаты. Они должны нести не менее двух углеводсвязывающих центров". Это определение и было принято Номенклатурным ко­ митетом Комиссии по биохимической номенклатуре в 1981 г. /2/, По мнению других авторов /3, 5/, для признания белка лектином гемагглютинирующие свойства у него необязательны, достаточно и одного углеводевязывающего центра, если белок (неиммунной природы) способен к специфическому узнаванию и обратимому связыванию углеводной части сложных гликополиме­ ров. Вместе с тем, эти авторы считают, что одним из требова­ ний, предъявляемых к лектинам, является отсутствие фермента­ тивной активности, по крайней мере по отношению к сахарам, с которыми они связываются. Наши соображения касаются глав­ ным образом этой части определения понятия "лектин". Если на основании определения /4/, из ранга лектинов ис­ ключаются только те ферменты, у которых совпадают субстрат- связывающий и каталитический центры, то н. Franz eb ai. /3/ отказывают в праве быть названными лектинами всем без исклю­ чения ферментам. J. Kocourek, V.Horejäi /5/ оставляют в ран­ ге лектинов только те, которые проявляют ферментатив­ 151 ные свойства, отличные от способности трансформировать угле­ водный субстрат. Правомочна ли такая дискриминация в отноше­ нии группы углеводспецифичных ферментов? Конечно же, нет. Искусственность такого ограничения очевидна. Признавая право называться лектинами (естественно, при наличии свойств, со­ ответствующих критерию "лектин") за ферментами, трансформи­ рующими неуглеводную часть гликоконьюгатов и, вследствие этого, нарушающими или изменяющими структуру сложной молеку­ лы, лектинологи должны признать, что нет оснований не счи­ тать лектинами ферменты, изменяющие структуру полимера в его углеводной части. В качестве примера ферментов, имеющих все основания быть признанными лектинами, можно назвать исследовавшиеся в на­ шей лаборатории грибную галактозооксидазу /I/ и бактериаль­ ную маннаназу /б/. Первая из них осуществляет окисление га­ лактозы у 6-го атома углерода с образованием галактодиаль- дозы, вторая гидролитически расщепляет концевые % и LCL+ клеток - 4%. В ткани миндалин, где со­ держится немало антигенстимулированных лимфоидных клеток, некоторые из которых имеют признаки иммунобластов или плаз- матизированных лимфоцитов, PNA+ клетки составляли до 53%, почти столько же было HPL+ клеточных элементов (58%), со­ держание клеток, зкспрессирующих рецептор! SBA , равнялось 44%, RCA - 25%. В составе миндалин, по имеющимся данным /5/, PNA+ лимфоциты обнаруживались среди sig+C3<ä+ и sig+ с за- клеток и среди крупных E~Sig~ лимфоидных клеток. В 167 ходе наших последующих исследований, которые будут прове­ дены с использованием двойной ферментной метки - лектинов, конъюгированных с пероксидазой, и моноклональных антител к двй?еренцировочным антигенам Т- и В-димфоцитов в иммуно- цитохимической реакции АРААР (щелочная фосфатаза - антище­ лочная фоофатаза) - мы попытаемся ответить на вопрос,ка­ кие именно субпопуляции лимфоцитов реагируют с указанными лектинами. Довольно высокий процент клеток, реагирующих о РИА, SBA и НРЪ, обнаружен среди кроветворных клеток печени эм­ бриона. Так, у 12-14-неделъного плода человека соответст­ вующие показатели были равны 26, 24 и 28%. Среди них могли быть предшественники B-лимфоцитов и цретимические предше­ ственники Т-лимфоцитов /7, 10/. Клетки линии ШВД-8226 представлены В-клетками, нахо­ дящимися на различных стадиях дифференцировки.Об этом сви­ детельствует наличие поверхностных и цитоплаэматических иммуноглобулинов (Л-- и-4-цепей), СЗ-, FCQ И Рсм-рецепто­ ров поверхностных мембран, антигенов, выявляемых анти-В- клеточннми моноклональными антителами fflIO-IO и ШО-3, вы­ раженная гетерогенность по цитоморфологическим и цитохими­ ческим признакам (активности кислой фосфатазн и кислой не­ специфической эстеразы). На 60-75!? клеток этой линии и ли­ нии ЕВ-3 обнаруживались рецепторы PNA, 90 и 80% клеток соответственно реагировали с SBA и только 15% - с HPL. При изучении злокачественных "B-клеток линии Pay i, полу­ ченных из клеток димфомы Беркитта (африканского типа), также на 70-80% определялись рецепторы PNA, SBA и на 60-70% клеток рецепторы HPL. На клетках линии Moib -4 (Т-ОЛЛ) обнаруживались рецепторы РИА (90%), SBA (53%) и HPL (46%). Представленные результаты находятся в соответ­ ствии с имевшимися данными о том, что РИА реагирует с ран­ ними предшественниками B-клеток и B-клетками на антигенза- висимых этапах дифференцировки, а также клетками-предшест­ венниками Т-лимфоцитов, с последними реагируют также SBA И HPL /8, 9/. В отношении SBA и HPL до сих пор, по сведе­ ниям из доступной литературы, было только известно, что первые связываются о частью В-лимфоцитов, а вторые - с. В- 168 лимфоцитами в эмбриональной печени /6, 7, 2/. Нами проводились также исследования по иммунофенотипи- рованию различных цитологических вариантов 0Л1 у детей, вы­ деляемых в соответствии с FAB - классификацией. В качестве маркеров использовались панель моноклональных антител к дифференцировочннм антигенам Т- и В-лимфоцитов, la-подобно­ му (нп-га) антигену, антигену О-ОЯЛ, стандартные цитохи­ мические реакции. Оказалось, что при ОЛЛ "общего типа" и пре-В-ОЛЛ количество рт+ бластных клеток не превышало 4- 1058, SBA+ , SJA+, HPL+ клеток - 2-5/6. При 0Л1 Т-клеточно- го происхождения рецепторы к РКА были эксцрессированы на 70-80% бластов, HFL - на 50%, SJA - на 20%. По полученным данным, определение рецепторов к лекти- нам, подобно тесту М-розеткообразования, может быть исполь­ зовано для дифференциальной диагностики В-ХЛЛ и ВЗЛ лимфо- цитарного типа в стадии лейкемизации. В первом случае в пе­ риферической крови обнаруживается 3-20% РЫА+ лимфоцитов, количество SBA+ , ЬСЬ* и HPL+ клеток составляет не бо­ лее 2-5%, во втором - 50-90% клеток содержат рецепторы PNA, 40% SJA и 30% - LCL . При одной из редких разновидностей хронических лимфо- пролиферативннх заболеваний, волосатоклеточном лейкозе, в крови и селезенке обнаруживалось столь же высокое содержа­ ние РЫА+ клеток - 70-83%. Содержание I£L+ клеток состав­ ляло 2-15%, SBA* - 8%, HPL+ - 8-25%. Эти данные служат еще одним подтверждением возникновения ВО из B-клеток на относительно поздних стадиях дифференцировки. Анализ представленных материалов свидетельствует о перспективности изучения рецепторов лектинов для познания основных закономерностей ди$ференцировки лимфоидных клеток и изменений, происходящих в процессе злокачественной транс­ формации. В практическом плане важным представляется более широкое использование набора лектинов, наряду с энзимоци- тохимическими и иммуноцитохимичестши маркерами, в качестве вспомогательных критериев для уточненной диагностики раз­ личных форм и вариантов гемобластозов. Л и т е р а т у р а : I. Барышников A.Ü., Тупицнн H.H..Крыжанов М.А. и др.// Докл. АН СССР. - 1985. - » 3. - С. 753-759. 169 22 2. Глузман Д.®., Бебешко В.Г., Надгорная В.А. и др. Эмбриональное кроветворение и гемобластозы у детей. - Киев: Наукова думка, 1988. - 200 с. 3. Пинчук В.Г., Сидоренко С.П., Ветрова Е.П. и др. // Экспериментальная онкология. - 1986. - 8, 6. - С. 41-46. 4. Филатов A.B., Бачурин П.С., Королев А.Г. и др. // Биотехнология. - 1987. - 3, 6. - С. 756-762. 5. Хомутовский O.A., Луцик М.Д., Передерей 0.$. Элект­ ронная гистохимия рецепторов клеточных мембран.- Киев: Нау­ кова думка, 1986. - 168 с. 6. Hau S.M., Ree Н.Х. // J. Hiatochea. Cytochem» - 1983. - Vol. 31. - N 4. - P. 538-546. 7. Osmond D.G. // Eur. J. Immunol.- 1984.- Vol. 14. - P. 495-502. 8. Raedler A., Raedler E. // J, Cancer Rea. Clin. On­ col. - 1985. - Vol. 109. - И 1. - P. 245-251. 9. Raedler A., Raedler E., Becker N. et al. // Immuno­ logy. - 1982. - Vol. 46. - N 2. - P. 321-327. 10. Richard I., Boumeell L., Coppin H„ et al. // J. Im­ munol. - 1981. -Vol, 127. - N 1. - P. 252-255. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ЛЕКТИНЫ В ОПВДЕШЕНИИ АКТИВНОСТИ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ А.Д.Михайлов Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР, г. Москва В последнее десятилетие повышается интерес к изучению гликозилтрансфераз как потенциальных маркеров ряда злокаче­ ственных опухолей, поскольку эти ферменты тесно связаны с синтезом многих гликопротеинов, уровень которых повышен у онкологических больных. Речь идет об опухолеассоциированных антигенах гликопротеиновой црироды - таких как раковоэмбрио- нальнык антиген, антигены Ca-I25, CA-I9-9, CA-I5-3; а также так называемых гликопротеинах "острой фазы" - орозоэдукоиде, альфа-1-антитрипсине, альфа-1-химотрипсине и других: все они содержат аспарагин-связанные олигосахаридные цепи раз­ личной степени разветвленности с более или менее высоким 170 содержанием маннозы. В нашей лаборатории модифицирован метод определения сиалилтрансферазы (ЕС.2.4.99.1) и фукозилтрансферазы (ЕС. 2.4.1.68) с использованием иммобилизованных лектинов. В ос­ нову метода положен тот факт, что сыворотка крови человека как при патологии, так и в норме содержит некоторое коли­ чество свободных сиалил- и фукозилтрансферазы, однако,в ней практически не обнаруживаются фосфонуклеотидные производные фукозы (гуанозиндифосфофукоза, ГДФ-Фук) и сиаловой кислоты (цитидиныонофосфосиаловая к-та, ЦМФ-Сиал), являюшеся суб­ стратами указанных ферментов. Такое положение делает мало­ вероятным экстракдеточное фукозилирование и сиалирование гликопротеинов и косвенно приводит к тому, что сыворотка крови относительно богата гликопротеинами с терминальной структурой их углеводных цепей Gal i-»4GlcNAc 1 -* . Такие гликопротеины могут служить как акцептором фукозы,присоеди­ няемой. фукозилтрансферазой к GlciiAc связью I -> 3, так и акцептором сиаловой кислоты, присоединяемой сиалилтрансфе- разой к Gal связью 1-> 6. Понятно, что внесение в сыворот­ ку крови экзогенного меченого радиоактивным -изотопом ГДФ- Фук (или ЩФ^Сиал) приведет к формированию меченого гли- копротеина в количестве, пропорциональном активности фер­ мента образца и времени реакции. Время инкубации реакцион­ ной смеси подбирается таким образом, чтобы избежать насыще­ ния акцепторных сайтов и в то же время получать значимое количество продукта реакции. Методика проведения анализа довольно проста: 200 мкл образца разбавляются I мл буферного раствора и к смеси до­ бавляется избыток меченого углеродом-14 ГДФ-Фук (или ЦМФ- Сиал). После инкубации реакция останавливается насыщенным раствором динатриевой соли ЭДТА, которая удаляет из реак­ ционной среды ионы марганца, необходимые для функционирова­ ния фермента. После остановки реакции в смесь вводят 0,5 мл суспендированного агарозного геля с ковалентно иммобилизо­ ванными лектинами, специфичными к альфа- <3 -маннозе Canava- lia ensLformis либо Pisum sativum. Маннозосодержащие гликопротеины, в том числе продукты энзиматического мече- ния, связываются с гелем, который после этого несколько раз 171 22* промывается и радиометрируется на гамма-счетчике. Наши данные показали, что при иммобилизации на снвг - активированной агарозе в соотношении 3 мг на I мл геля ко­ эффициент корреляции при их использовании в измерении знзк- матической активности сиалидтрансферазы по данным тестиро­ вания 48 проб составил 0.92; при измерении активности фуко­ зилтрансферазы в тех же образцах - 0.89. Таким образом.мож­ но сделать вывод об отсутствии влияния типа лектина на ре­ зультаты измерений этим методом при одинаковой моносахарид- ной специфичности лектинов. В сравнении с известными методами разработанный на­ ми способ является наиболее технологически доступным и имеет высокую аналитическую чувствительность - около 0,4 нмоль/мл/ч для обеих трансфераз. Метод прошел предвари­ тельную клиническую апробацию - исследована сыворотка крови 48 человек: 8 больных раком легкого, 5 - незлокачественными заболеваниями этого органа, 17 детей с острым лимфобластным лейкозом, 7 больных раком яичников и II здоровых лиц. Пока­ зано, что уровень фукозилтрансферазы показан преимуществен­ но у больных эпителиальными злокачественными опухолями (у II из 15 пациентов). Тест на сиалилтрансферазу, по имеющим­ ся данным, не оказался специфичным, что ставит под сомнение его диагностическую значимость для всех типов злокачествен­ ных опухолей. ПОНИЖЕННОЕ СРОДСТВО АЛЫА-2-Ь1АКР0ГЛ0БУЛША ПЛАЗМЫ КРОВИ К ЖГОГЕМАГГЛНШНИНУ ПШ РАКЕ ШУДКА Е.П.Смородин, О.А.Куртенков Институт экспериментальной и клинической медицины МЗ Эстонской ССР, г. Таллинн Известно, что при онкологических заболеваниях в орга­ низме нарушен характер гликозилирования„ что приводит к по­ явлению в крови и на раковых клетках гликоконъюгатов с из­ мененной углеводной структурой /3, 10, 15/. Подобные струк­ туры могут быть распознаны и изучены с применением монокло- 172 нальных антител /9/ и лектинов /6, 7, 15/.Исследование гли- копротеидов по связыванию с лектинаыи дает ценную информа­ цию о микрогетерогенности и является перспективным методом диагностики различных заболеваний /12/. В настоящей работе исследовали связывание с лектинами альфа-2-ыакроглобулина («уо крови здоровых людей и больных раком желудка. МЕТОДИКА выделяли из свачей плазмы крови по ранее описанным методам /I, 2/. Перекрестный лектин-имадуноэлектрофорез про­ водили по методике, описанной Bog-Hansen Т.О., 1973 /4/. В качестве лектина использовали фитогемагглютинин (ФГА-П), ("Difco СЖ). Пробы анализировали алектроиммунодиффузи- ей по методу Лорелла /14/ и оценивали связывание^2^ с ФГА и лектинами гемолимфы Ltmulus polyphemus /3/, (гемолимфа любезно предоставлена доктором Е. Cohen, Roswell Park Memo­ rial institute, Buffalo, N.T., USA). Определяли также ан- типротеазную активность препаратов и анализировали ме­ тодом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсуль- фатом натрия /V. Препараты «fgM анализировали также по подвижности в градиенте полиакриламидного геля и исследова­ ли микрогетерогенность по заряду методом изоэлектрофокуси­ рования /3/. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделенные аффинной хроматографией препараты ^ плаз­ мы крови здоровых людей (п=4) и больных раком желудка (п=4) исследовали методом перекрестного лектин-иммуноэлектрофоре- за /5/ (рисунок I). При этом было показано, что ̂ 2М плазмы здоровых связывается с ФГА на 60,35^4,44 плазмы боль­ ных на 43,60^4,86 %, b = 2,55, Р< 0,05. При электрофорезе в первом направлении в геле с ФГА иногда разделялся на компоненты, так как были отмечены пики преципитации с анти­ сывороткой к 2"1, имеющие двойную вершину (электрофорез в перпендикулярном направлении). Эти данные свидетельствуют о характерной микрогетерогенности 2М по углеводной структу­ ре. Подобная микрогетерогенность по связыванию с конкана- валином А отмечена для орозомукоида при раке и воспалении 173 толстого кишечника /II/; компоненты орозомукоида, не связы­ вающиеся с конкаыавалином А, имеют более разветвленную структуру олигосахаридной цепи. ^ 2^ плазмы крови больных раком желудка имеет меньшее сродство к ФГА, чем об плазмы здоровых людей /3/. Анало­ гичные результаты были получены при исследовании связывания альфа-1-антитрилсина и ферритина с конкаыавалином А /15, 17/. «с 2М также связывается с лектинами беспозвоночного ы- mulus polyphemua , однако не получено достоверных различий в связывании ̂ здоровых лиц и больных раком желудка.Ана­ логичное исследование сывороток крови с водно-солевым экс­ трактом арахиса (AracMs hypogaea ) показало,что пики пре­ ципитации °^2^ с антисывороткой вариабельны. Отмечено даже увеличение размера пика в опыте (инкубация с лектином) по сравнению с контролем. Вероятно, этот артефакт связан с увеличением электрофоретической подвижности образующегося комплекса oCgM - лектин, такой комплекс может плохо вторич­ но проявляться антителами к ̂ 2гл* Такие моносахариды, как N-ацетил-О-галактозамш, О-га- лактоза и .L-фукоза при концентрациях 5* 10"^ - 5-10"^ М, не влияли на связывание с ФГА /3/. Считается,что ФГА имеет специфичность по N-ацетил-о-галактозамину, так как именно этот углевод ингибирует агглютинацию эритроцитов /18/. ^\1 связывается с ФГА, хотя и не содержит в составе олигосаха­ ридной части этого углевода /8/. Принятая специфичность ФГА условна, так как для связывания важна комплементарность уг­ леводной части гликопротеида и лектина. Так,глшгопептид эри­ троцитов человека превосходит N-ацетил« d -галактозашн по ингибированию агглютинации эритроцитов почти в 10° раз /13/. Для связывания ФГА с гликоцротеидами важна не только внеш­ няя, но и внутренняя углеводная структура, содержащая а- маннозу. Кроме того, более крупные гликопротеиды эритроци­ тов тлеют значительно большее сродство к ФГА, чем гликопеп- тиды, полученные обработкой трипсином /13/. Препараты <^$\, выделенные из плазмы крови разных лю­ дей, отличались по удельной антипротеазной активности и по связыванию с ФГА в процентах. Между этими величинами отме­ чена корреляция (рисунок 2), г =0,865, ь =4,57, Р< 0,01, 174 Для комплекса ^ 2М с трипсином получены значения связыва­ ния с ФГА и лектинами гемолимфы соответственно на 7 и 9% выше, чем для нативного < М, хотя и ^2^' и комплекс 2̂ име­ ли одинаковые пики преципитации с антителами к Это пример того, как лектин распознает структурные изменения 2М, связанные с ограниченным протеолизом. Как известно, лектины и поликлональные антитела неодинаково чувствитель­ ны к структурным изменениям гликопротеидов при денатурации /5/. Отмеченное различие по сродству °*-2М к ®А использо­ вано нами для разработки способа дифференциальной диагно­ стики рака желудка. Рак желудка выявляется в 88% (положительная реакция), у здоровых или больных незлокачественными заболеваниями желудка в 88-90% реакция отрицательная. У больных раком другой локализации положительная реакция выявляется в 69# (толстый кишечник, поджелудочная железа). Применение лектинов значительно расширяет возможности биохимических методов исследования. Прежде было показано, что °*"2М плазмы крови больных раком желудка, в отличие от о<-2М здоровых людей, тормозит бластогенез лимфоцитов на ФГА /I/. Для исследования биохимической природы этого феномена препараты 2М крови здоровых и больных анализировали по антипротеазной активности, методом электрофореза с доде- цилсульфатом натрия и в градиенте полиакриламидного геля, методом изоэлектрофокусирования, но не обнаружили досто­ верных различий /I, 3/. Однако сравнительное исследование по связыванию с ФГА выявило достоверное снижение связыва­ ния, характерное для 2М плазмы больных раком желудка. Низкие значения связывания 2̂М с ФГА характерны также для сыворотки крови беременных /16/. Характерные особенности углеводной структуры при раке и при беременности сви­ детельствуют об измененном характере гликозилирования гли­ копротеидов. Такая модификация гликопротеидов, возможно, является одним из механизмов возникновения иммунодепрессии. 175 © <3 Рис .j.П ерекрестный лектин-иммуноэлектрофорез препаратов в геле агарозы: А - контроль (электрофорез в первом направлении в геле без ФГА); Б - опыт (электрофорез в первом на­ правлении в геле с ФГА); а,б - <*^2М плазмы здорового человека; в,г - cxIpM плазмы больного раком же­ лудка E £9. с МГ 1,6 Рис. 2.Зависимость удельной li антипротеазной активности пре­ паратов ос-До от связывания с ФГА. tiß 26) 40 60 80 X 176 Л и т е р а т у р а 1. Цуртенков O.A., Смородин Е.П. // Экспериментальная онкология. - 1983. - 5, 2. - С. 55-57. 2. Смодоин Е.П. Способ выделения альфа-2-макроглобу- лина. Авт. свид. W 1090406, A6I K35/I4,21.01.82, 07.05.84. 3. Смородин Е.П., Нуртенков O.A. /У Экспериментальная онкология. - 1986. - 8, 2. - С. 42-45. 4. B^g-Hansen Т.О. // Anal. В Lochern. -1975» - Vol.56. - N 2. - P. 480-488. 5. Btfg-Hanaen . ., Bjerrum O.J.,Brogren G.H.// Anal. Biocnem, - 1977. - Vol. 81. - N 1,- P. 78-87. 6. Chapman A. J. »Gallagher J.T«,,Beardwell С.G.,Chalet 3.M.//J,Endocrinol.- 1984.- Vol.103.- N 1.- P. 111-116. 7. Cooper H.S.//Hum.Pathol.-1984.-Vol.15.-Я 10.-?.111. 8. Dunn J.Т., Spiro R.G, // J, Biol. Chem, - 1967. - Vol. 242. - N 23. - P. 5556-5563. 9.. Hakomori S,, Nudelman E., Levery 3.В.,Patterson C.M. // Biochem. Biophye. Rea. Commun. - 1983. - Vol. 113,- P. 791-798. 10. Hakomori S., Nudelman E., Levery S.B., Kannagi R. // J.Biol. Chem.- 1984. - Vol.259.- N 7. - P. 4672-4680. 11. Hansen J.-В., Jensen S.P., "Norgaard-Pedersen В., B/Sg-Haneen l.C. // Electrophoresis. - 1986. - Vol. 7. - N 4. - P. 180-183. 12. Hinnerfeldt P.R«, Albrechteen J., B/6g-Hanaen I. C. // Electrophor.'82:Adv.Meth. Biochem. and Clin.Appl. Proc. Int. Conf. Electrophor., Athens, 21-24 Apr.,1932,- Berlin, Hew York, 1983. - P. 567-576. 13. Kornfeld R., Kornfeld S. // J. Biol. Chem.- 1970,- Vol. 245. - N 10. - P. 2536-2545. 14. Laurell C.-B. // Scand.J.Clin. Lab.Invest, 1972. - Vol. 29. - Suppl. 124. - P. 21-73. 15. Restenberg I., Guizar-Vazquez J., Penaloza R. //J. Nat. Cancer Inst.-1978,- Vol.61.- N 4. - P. 961-965. 16. Ryatfep V.J., Kurtenkov O.A., Smorodin E.P. // Tu­ mor Biology. - 1985. - Vol. 6. - N 4. - P. 394. 17. Tommasi M., Liotta A., Allesaandrello, Cappelli G. // Mucl.Med. and Biol.Adv. Proc. 3rd World Congr,, Parle, 177 23 29.aug.-2.Sept,,1982.-Vol.4.-Oxford e.a.,1983.- P.3321-3323. 18. Wright R.K., Copper B.L. // Comp. Biochem. and Phy- aiol. - 1979. - Vol. В 63. - N 1.- P. 13-18. ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРА К АГГЖТИНИБУ АРАХИСА И ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА НА ФГА У ТИМОВДТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПРЕПАРАТОВ ТИМУСНЫХ Г0Ш0Н0В М.Ф.Никонова, М.Г.Мшша, А.А.Ярилин Институт иммунологии Минздрава СССР, г. Москва Т-клетки экспрессируют рецепторы к ряду лектинов, в том числе к агглютинину арахиса ( Peanut agglutinin) - PNA . В тимусе, где Т-клетки в процессе дифференцировки цриобретают поверхностные характеристики и функциональные свойства зре­ лых лимфоцитов, PNA связывается с ~ 85% незрелых тимоци- тов, локализующихся в кортикальной зоне. Характерной особен­ ностью поверхностной мембраны данных клеток является наличие терминальных остатков Д-галактозы - дисахарида Gaipi -> jGal NAс, не экранированных сиаловой кислотой /9/. Эти участки и являются рецептором для связывания РПА . В процессе имму­ нологического созревания происходит сиалирование поверхност­ ных гликопротеинов и, вследствие этого, потеря способности к связыванию PNA . Клетки тимуса, несуше рецептор к PNA, различаются не только по локализации ( PNA1" - в кортикаль­ ной зоне, а PNA" - в медуллярной), но и по степени иммуно­ логической зрелости и, следовательно, по фено типическим и функциональным особенностям. Для кортикальных тимоцитов,ха­ рактерно, в частности, большее содержание Thy - 1;2 антигена и отсутствие способности отвечать бласттрансфорлацией на ми- тоген ФГА. На медуллярных тимоцитах утрачивается рецептор к PNA , плотность Thy -1,2 антигена снижается и они приобре­ тают способность к пролиферативному ответу на ФГА. Дифференцировка тимоцитов происходит под влиянием гор­ монов тимуса. В настоящее время выделен, изучен и охаракте­ ризован целый ряд препаратов, содержащих тимусные гормоны: тимозин /7/, сывороточный тимусный фактор /5/, тимопоэтин /6/ и др. Кроме того, получены отечественные аналоги этих 178 препаратов: тимоптин /4/. тактивш /I/, тималин /2/. Действие тимусных гормонов может быть связано со сте­ пенью зрелости клеток-мишеней и направлено на различные этапы дифференцировки Т-клеток. В данной работе проводили сравнительное изучение влияния отечественных препаратов ти- муса на определенный этап созревания Т-лимфоцитов - диффе- ренцировку кортикальных тимоцитов в медуллярные. Эксперименты проводили на мышах линии СБА, у которых извлекали тимус и готовили клеточную суспензию. Тимоциты разделяли на РЛА+ и РПА~ фракции /8/ путем агглютинации с PNA (I мг/мл) и последующего наслаивания на 20% лошадиную сыворотку. Затем отобранные PNA+ клетки обрабатывали Д-га- лактозой (0,3 М) и дважды отмывали. Экспрессию рецепторов к PNA определяли с помощью иммуноферментного метода в кле­ точной суспензии с использованием конъюгата РЖ-пероксида- за /3/. Плотность мембранного Thy—1,2 антигена исследова­ ли в цитотоксическом тесте с использованием антисыворотки к Thy - 1,2 антигену и комплемента морской свинки. Функцио­ нальное созревание PNA+ тимоцитов оценивали в 72-часовом тесте бласттрансфорыации, измеряемой по включению %-тими- дина, в присутствии ФГА, взятого в субоптимальной дозе. Кратковременная, 1-часовая инкубация тимоцитов с тим- оптином при 37°С приводила к уменьшению числа РПА+ клеток до 58,1%, в то время как у тимоцитов, к которым была добав­ лена культуральная среда, процент PNA+ клеток был равен 82,8 (рисунок), что соответствует нормальному содержанию РЮ.+ клеток в тимусе /9/. Эффект тимоптина проявляется только в определенном диапазоне доз. В подобной же концен­ трации проявлялось действие тимоптина на экспрессию Thy-1,2 антигена. В то время, как при разведении антисыворотки к Thy-1,2 антигену 1:32 процент мертвых клеток в контроле и у обработанных тимоптином клеток был практически одинаков и равен, соответственно 89,0 и 91,5, при разведении антисыво­ ротки 1:64 процент выявляемых клеток, положительных по Thy- 1,2 антигену, в опыте резко падал (39,0), а в контроле уменьшался незначительно (82,0). Эти данные указывают на то, что при действии препарата в определенных концентрациях часть тимоцитов не только утрачивает рецепторы к PNA, но и 179 23* снижает экспрессию Thy -1,2 антигена, т.е. приобретает фе- нотипические признаки зрелых Т-клеток. Тималин и тактивин также вызывали фенотипическую мо­ дификацию клеток. Для тактивина активные дозы, вызывающие утрату тимоцитами способности связывать PNA, соответствуют 10" -I мкг/мл. У тималина рабочая концентрация и для ослаб­ ления экспрессии Thy-1,2 антигена и для утраты РЖ-ре- цептора составляет Ю-1 мкг/мл. Таким образом, исследуемые препараты тимусных гормо­ нов (тимоптин, тактивин, тималин) влияют на фенотипические изменения незрелых тимоцитов в зрелые. Это влияние реали­ зуется в узком диапазоне доз. Параллельно с изучением изменения фенотипа под влия­ нием тимусных гормонов проводилось исследование функцио­ нального созревания тимоцитов при участии этих факторов. Обработка тимоцитов тимоптином в дозе 10 мкг/мл приводила к приобретению рм+-клетками пролиферативной активности в ответ на действие ФГА (ИС=6,19). Доза тимоптина, уменьшен­ ная вдвое, не усиливала клеточной пролиферации. Тималин в концентрации 5 мкг/мл вызывал увеличение ФГА-стимулиро- ванной пролиферации PNA+ тимоцитов в 2,83 раза, в больших концентрациях эффект не проявлялся. В то же время тактивин оказывал стимулирующее действие в более широком диапазоне доз - I и 0,1 мкг/мл, индексы стимуляции составляли 2,50 и 3,93, соответственно. Следовательно, для того, чтобы под действием препаратов TOJMOHOB тимуса тимоциты приобрели способность к пролиферативному ответу, необходимо приме­ нять их в определенных концентрациях (таблица). Таким образом, под действием тимусных гормонов проис­ ходят изменения PNA+ тимоцитов, которые можно трактовать как проявления фенотипического и функционального созрева­ ния PNA+ тимоцитов. Для тактивина диапазон доз, вызываю­ щих исчезновение рецептора к PNA И функциональное созре­ вание клеток, совпадает. Другие препараты (тимотрошш, ти­ малин) реализуют свое действие на поверхности мембраны в более низких концентрациях, чем это необходимо для функ­ ционального созревания. Как уже упоминалось, рецептором для PNA на незрелых 160 Таблица Влияние тимоптина, тактивина и тималина на спонтанную пролиферацию PNA+ -тимоцитов и их бласттрансфорлацию в ответ на ФГА Конц., Спонтанная Пролиферац. Препарат пролиферац., под действ. ИС Р мкг/мл имц/мин ФГА, имц/мин Контроль 2 184*43 280*64 1,50 0,05 Тимоптин 5 396*94 264*50 0,67 - 0,05 10 132*1 817*84 6,19 < 0,001 Тималин 5 150*18 425*120 2,83 4 0,001 -"- 10 203*53 90*18 0,44 Л 0,05 Тактивин Ю-2 191*96 295*186 1,54 У 0,05 ГО**1 220*64 864*187 3,93 L 0,01 I 256*40 639*123 2,50 < 0,05 тимоцитах является терминальный остаток Д-галактозы, кото­ рый сиалируется в процессе созревания клеток. Вследствие этого утрачивается способность к связыванию данного лекти- на. Уменьшение под воздействием тимусных гормонов способ­ ности тимоцитов к связыванию ИГА может быть обусловлено либо сиалированием поверхностной мембраны, либо маскиров­ кой рецепторов вследствие иных перестроек структуры мем­ бран. Для выяснения этого вопроса были поставлены опыты по дополнительной обработке тимоцитов нейроаминадазой одновре­ менно и после воздействия одного из препаратов тимусных горлонов - тимоптина. Сама по себе обработка нейроаминада- зой способствует появлению рецепторов почти на всех тимо­ цитах (99,0%) по сравнению с интактным контролем (82,8%). Тимоптин снижал экспрессию pna-рецептора до 73,3%. В то же время при совместной обработке клеток тимоптином и ней- роаминадазой процент Р№+ клэток составлял 84,6, т.е. чис­ ло ША+ клеток было ниже, чем при обработке одной нейро- аминадазой.Это свидетельствует о том, что моделирующее действие тимоптина, как, возможно, и других подобных фак­ торов, на экспрессию РИА-рецептора опосредуется не через воздействие на процесс сиалирования мембранных гликопро- 181 % КЛЕТОК lOO 90 ' iO . 70 60 50 40 30 го ю К 1 I 1 "1 К т 1 "1 ю"3Ю"5 к 10г 10 5 I ю-1 го"2 тимоптин ТИМАЛИН ТАКТИЬИН Рис. Изменение экспрессии рецептора к РПА на тимоцитах под влиянием тимоптина, тималина и тактивина теинов или же не только через этот механизм. Таким образом, сравнительное изучение отечественных препаратов тимусных гормонов: тимоптина, тактивина и тима- лина показало, что все они в определенных дозах способст­ вуют фенотшпгческому (утрата РЫА-рецептора и снижение плотности Thy-1,2 антигена) и функциональному (приобрете­ ние способности отвечать пролиферацией на субоптимальную дозу ФГА) созреванию РЫА+ кортикальных тимоцитов в PNA" медуллярные. То, что мишенью для их действия является дан­ ный тип изучаемых клеток, свидетельствует о комплексности препаратов. Так, при детальном изучении влияния на диффе- ренцировку ША+ тимоцитов других препаратов (тимостиму- лш) и синтетических фрагментов тимусных гормонов нами по­ казано, что таким действием обладают отнюдь не все препа­ раты. Кроме того, фенотипические модификации не обязатель­ но сопровождаются функциональным созреванием PNA+ кле­ ток. Последнее достигается, по-видимому, действием специ­ фического сигнала определенных тимусных гормонов. Л и т е р а т у р а 1. Арион В.Я.//Итоги науки и техники. Серия:Иммуноло­ гия. - М., 1981. - Т. 9. - С. 10-50. 2. Морозов В.Е., Хавинсон В.Х., Писарев O.A.//Докл.АН СССР, 1977. - Т. 223. - Л 3. - С. 491-494. 3. Никонова М.Ф., Михна М.Г., Сорокина Н.И. и ДР- // Иммунология. - 1987. - 5. - С. 58-61. 4. Ярилин A.A., Мирошниченко И.В., Михна М.Г. и др.// Иммунология. - 1986. - Л 3. - С. 23-26. 5. Bach J.F., Dardenne M., Piean J.M. //Nature.-1977. - Vol. 266. - P. 55. 6. Goldstein G., Schlesinger G.H. // Lancet. - 1975.- Vol. 11. - N 7928. - P. 256-259. 7. Low T.L., Goldstein A.L. // Thymic Hormones and Lymphokines, 1984. - P. 21-55- 8. Reisner J., Linker-Israeli M., Sharon N. // Cell. Immunology. - 1976. - Vol. 25. - P. 129-154. 9. Sharon N. // Adv. Immunol. - 1985« - Vol. 54. - P. 215-298. 183 СЕЛЕКТИВНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ МЕТОДАМИ ЛЕКТИНОВОЙ ГИСТОХИМИИ А.Д.Луцик, Е.С.Детюк Львовский медицинский институт Применение лектинов в качестве селективных гистохими­ ческих маркеров - пример прикладного использования уникаль­ ных свойств »тих биологически активных веществ дня решения задач морфологии. В основе способности лектинов избирательно окрашивать определенные кланы клеток, а в ряде случаев дифференциро­ вать отдельные субпоцуляции в составе неразличимых по дру­ гим морфо-гистохимическим признакам клеточных элементов,ле­ жит способность каждого конкретного лектина проявлять мак­ симальное сродство к гликополимерам строго определенного отроения. В данном случае первоочередную роль, по-видимому, играют дополнительные факторы связывания - характер глико- зидной связи, конфигурация и разветвленность олигосахарид- ной цепи, влияние близлежащих к концевому моносахаридному остатку химических радикалов и функциональных групп /5/. Таким образом, если возможность присутствия одного из шести распознаваемых лектинами моносахаридных остатков в составе глнкополимеров определенной популяции клеток и его отсутст­ вие в окружающих тканевых структурах представляется весьма маловероятной, то с учетом дополнительных факторов связыва­ ния количество возможных вариантов гликоконъюгатов, диффе­ ренцируемых с помощью лектинов,резко возрастает. Соответст­ венно повышается вероятность присутствия определенной раз­ новидности глнкополимеров в одной клеточной популяции и их отсутствия у соседних. Обнаруженные нами возможности приме­ нения лектинов в качестве селективных гистохимических мар­ керов суммированы в таблице I. Способность тех или иных лектинов избирательно связы­ ваться с определенными поцуляциями клеток, как правило«мож­ но обнаружить лишь в результате эмпирических поисков, так как влияние дополнительных факторов связывания, равно как и отсутствие исчерпывающей информации относительно структуры подавляющего большинства тканевых и клеточных гликоконъгага- 184 тов, делают невозможным теоретическое прогнозирование ре­ зультатов гистохимических реакций. Анализ данных литературе показал, что используемые в настоящее время лактин-рецеп- торвые системы не предусматривают абсолютной селективности маркирование! клетки или элементы экстрацеллюлярного мат- рикса выявляются при обработке тем или иным лектинсм на фо­ не ареактивности окружающих тканевых структур отдельного органа или ткани* в целом организме, как правило. всегда на­ ходятся линии или популяции клеток, проявляющие повышенное сродство к данному лектину. Наш опыт работы с лектинами показывает, что для эффек­ тивного проведения селективного гистохимического маркирова­ ния с помощью лектинов необходим ряд предпосылок. В частно­ сти, исследуемый орган или ткань доданы отличаться разнооб­ разием составлявших структурных компонентов, включая воз­ можно большее число клеточных популяций, элементов внекле­ точного матрикса с различными гистохимическими характери­ стиками. Рецепторы лектинов должны располагаться равномерно в цитоплазме клеток, либо занимать их обширные компартмен- ты. Более четко маркируются клетки с низким ядерно-цитоплаз- матичееким соотношением, поскольку ядро и кариолемма, как правило, лишены рецепторов лектинов. Маркирование клеток только на основе выявления гликоконъюгатов в составе плаз- малв юы затруднительно в связи о недостаточной интенсивно­ стью окрашивания, а также наличием в составе плазмалеммн большинства клеток разнообразных глнкополимеров, что снижа­ ет селективность маркирования. Для воспроизведения результатов, полученных различными авторами, необходимо соблюдение оригинальных условий фикса­ ции, подготовки гистологического материала для исследова­ ния, способов метки лектинов и обработки ими срезов /Ъ/. Необходимо учитывать, что гистотопогрефия рецепторов лекти­ нов определяется генетическими факторами и зависит от вида, линии животных /13/, а у человека - от способности отдель­ ных клеточных популяций к экспрессии антигенов групп крови системы АВН. В частности, для гистохимического обнаружения антигенных детерминант групп крови человека в составе от­ дельных групп клеток используют лектины додихоса и улитки 185 24 Таблица I Селективное маркирование лектинами клеток, элементов экстрацеллюлярного матрикса человека и животных Клетки, неклеточные тканевые Видовая оч_ структуры, селективно связи- принад- Наименование ™лектина ™ _ ваюшие лектин лежность ера Эндотелиоциты аорты Человек Лектин бобовника , анагиролистного Нейрофильные сегаентоядерные Лектин арахиса, ? гравулоциты Человек лектин сои Нейроциты автономных ганглиев аорты Человек Лектин сои 4 Внутренняя эластическая мембрана артерий Человек Лектин сои 6 Эпителиоциты больших слюнных желез, продуцирующие инсули- Человек, Конканавалин А. 8 ноподобный белок крыса Тканевые базофилы Человек, Лектин арахиса, о крыса лектин сои Клетки выводных протоков поднижнечелюстной и подъязыч­ Крыса Лектин бобовника ной слюнных желез анагиролистного 8 Клетки серозных полулуний Конканавалин А., 8 подъязычной слюнной железы Крыса лектин клещевины Клетки эпителиальной выстил­ Крыса Лектин зародышей 6 ки желудка пшеницы Шеечные мукоциты собственных Крыса Лектин сои 6 желез желудка Париетальные гландулоциты Лектин зародышей 6 собственных желез желудка Крыса пшеницы Нейроциты автономных гангли­ ев поднижнечелюстной слюнной Крыса Конканавалин А 7 железы Фолликулоциты яичника Мышь Лектин сои Прозрачная оболочка овоцитов Мышь Лектин зародышей пшеницы Лютеоциты яичника Мышь Лектин арахиса, лектин бобовника анагиролистного Клетки эпителиальной выстил­ Мышь Лектин зародышей ки яйцевода пшеницы Клетки эпителиальной выстил­ Лектин бобовника ки матки и желез эндометрия Мышь анагиролистного Сперыатогенный эпителий из­ витых семенных канальцев Мышь Лектин сои (акросомы) эпителиальной выстилки (.дц™ придатка семенника Конканавалин А 166 (анти-А), изолектин бандерейн и лектин яичников рыбы вьюна (анти-В), а также утесника европейского (анти-Н) /9, 10, II, 14, 15/, Лектины позволяют не только идентифицировать отдель­ ные кланы клеток, но и выявлять субпопуляции в составе не­ различимых по другим морфо- гистохимическим признакам кле­ точных групп, а также проводить обнаружение морфологически и топографически разнородных клеток организма, выполняющих общую функцию. С помощью маркирования лектинами возможно уточнение существующих классификаций компонентов различных видов тканей, установление линейной принадлежности тех или иных клонов клеток в составе органов животных-химер /13, 16/. Следует отметить, что в ряде случаев лектины по по­ стоянству маркирования отдельных патологически измененных линий клеток превосходят даже моноклональные антитела /12/. Установлено, что рецепторы лектинов сохраняются в трупном материале в течение 24-48 ч и более, причем суще­ ствует коррелятивная зависимость между времена!, прошедшим с момента наступления смерти и редукцией связывания лекти­ нов с теми или иными гистологическими структурами. В част­ ности, показано, что связывание лектина клещевины с мио- фибриллами миокардиоцитов, элементами почечных клубочков, базальной мембраной эпидермиса крысы и человека сохраняет­ ся неизменным в течение 24 ч и редуцируется через 48 ч после наступления смерти. Связывание этого же лектина гли- кололимерами эпителиоцитов канальцев нефронов остается не­ изменным вплоть до 48 ч после наступления смерти, полная редукция связывания отмечалась только на 8-е сутки /3/. Таким образом, изменения в маркировании лектинами могут найти применение в судебно-медицинской практике в качестве дополнительных критериев при определении времени наступле­ ния смерти. Картирование структурных компонентов органов и тканей человека и экспериментальных животных может принести не­ сомненную пользу при изготовлении гистологических препара­ тов, предназначенных для учебных целей. 187 24* Л и т е р а т у р а 1. Волкова O.B., Луцик А.Д., Детюк E.G. и др. Углевод­ ные детерминанты органов репродуктивной системы мыши по данным использования лектинов различной специфичности//Арх. Луцик А.Д. 2. Дмитрук И.М. .Зербйно Д.Д. ,Луц$гк А.Д. Рецепторы лек­ тинов в переходшо-клеточных опухолях мочевого цузыр^/Вопр. онкологии. - 1987. - Т. 33. - J6 4. - С. 60-65. 3. Зеленгуров В.М., Луцик А.Д., Луцик М.Д., Петровская Н.Ю. Экспериментальное исследование посмертных изменений тканевых структур с применением левтшов клещевины обыкно­ венной // Суд. мед. эксперт. - 1979. - Т. 22. - * 4. - С. 31-34. 4. Зербйно Д.Д., Луцик А.Д., Котик А.Е. и др. Расслаи­ вающая аневризма аорты-: гистохимическое исследование с при­ менением набора лектинов различной углеводной специфичности // Арх. пат. - 1987. - Т. 49. - S 3. - С. 20-24. 5. Луцик А.Д., Детюк E.G. Применение лектинов в свето- оптичеокой гистохимии (методические аспекты) // Арх. анат. - 1987. - Т. 92. - » 6. - С. 74-89. 6. Луцик А.Д., Котик А.Е. Применение полутонких срезов для гистохимического исследования углеводсодереажих биопо­ лимеров клеток и тканей с помощью лектинов // Бюл. зкспер. биол. мед. - 1985. - Т. 100. - 12. - С. 755-758. 7. Луцик А.Д., Яшенко A.M., Детюк Е.С. Связывание лек­ тинов структурами поднижнечелюстной слюнной железы крыс в постнатальном онтогенезе при. тиреоидной патологии // Арх. анат. - 1987. - Т. 92. - * 2. - С. 40-48. 8. Луцик А.Д., Яшенко A.M., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Ре­ цепторы лектинов в слюнных железах крыс в процессе постиа- тального развития // Арх. анат. - 1986. - Т. 91. - £ 8. - С. 27-34. 9. Луцик М.Д., Луцик А.Д. Препараты лектинов для диаг­ ностики групповых антигенов крови // Тез. докл. П Всесоюан, съезда гематологов и транофузиологов. - М., 1985. - С, 308. 10. Laden S.A., Schulte В.А., Spicer S.S. Hlstocheml- cal evaluation of. secretory glycoproteins in human salivary 188 glands with, lectinhorseradish peroxidase conjugates // J. Hisbochem. Cybochem. - 1984. - Vol. 32. - N 9. - P. 965- 972. 11. Mazzuca M., Lhermibbe M., Lafibbe J.J., Rousael P. Use of lecbina for debecbion of glycoconjugabes In bhe glan­ dular cells of bhe human bronchial mucosa // J. Hisbochem. Cybochem. - 1982. - Vol. 30. - N 9. - P. 956-966. 12. Miebbinen M., Holbhöfer H., Lehbo V. et al Ulex europaeus I lecbin as a marker for bumors derived from en- dobhelial cells // Am.J.Clin.Pabh.-1983.-Vol.79.-N 1.-P.32-36. 13. Ponder B.A.G. Lectin histochemisbry // Immunocyto- chemistry. Pracbical applicabion in pathology and biology (Bds.J.M.Polak,S. van Noorden).Bristol,1983. - P. 129-142. 14. Schulte В.A., Spicer S.S. bight microscopic his bo- chemical detection of sugar residues in secretory glycopro­ teins of rodent and human tracheal glands with lectin-hor- seradish peroxidase conjugates and the galactose oxldaae- Schiff sequence //J.Histochem.Cytochem.-1983.-Vol.31 .-P.391. 15. Schulte B.A., Poon К.С., Rao К.P.P., Spicer S.S. Lectin histochemistry in human cervix // Hiafcochem.J.-1985. - Vol. 17. - N 6. - P. 627-654. 16. Yamagami Т., Hosaka M., Mori M. Classification of sceletal muscles with lectin binding // Cell. Mol. Biol. - 1985. - Vol. 31. - N 4. - P. 241-249. АВТИВИЕ7СНЫЕ СВОЙСТВА ЛЕКТИНОВ КАЛАНХОЭ А.И.Евтушенко Киевский медицинский институт В последнее время в вирусологической практике дли из­ учения взаимодействия вирусов и клеток, структуры вирусных частиц находят широкое применение лектины. Связывая угле­ водные остатки оболочек, лектины также могут инактивкровать вирусы. Связь лектина с вирусом может разрываться при вве­ дении в систему специфических ингибиторов лектинов. Антивирусной активностью обладают многие известные лектины. Так,конканавалин А и 4ГА,связывая рецепторы, бло­ кируют адсорбцию вирусов на клетках. В культуре клетоа эти 189 лектины ингибируют репродукцию вирусов простого герпеса, Сендай, осповакцины, псевдобешенства, краснухи, ECHO, вези­ кулярного стоматита, полиомиелита, орто- и ларамиксовирусы /2-6/. Целью наших исследований явилось изучение антивирусных свойств препаратов из растений рода Каланхоэ Б отношении вирусов различных таксономических групп. При сравнительном изучении 58 видов Каланхоя выявлены 8 растений, препараты которых обладают высокой вирулицидной активностью в отношении вирусов полиомиелита II типа, Кок- саки B-I, Коксаки В-6, вирусов . везикулярного стоматита, гриппа, бактериофага Т2. Экспериментально обоснован метод выделения антивирус­ ного фактора каланхоэ, включающий предварительную очистку колоночной хроматографией с использованием в качестве сор- бантов гпубодисперсного бентонита и ионно-обменной смолы ФАФ. Метод позволяет очистить препарат на 80% от балластных белков и на 30% от углеводов с сохранением исходной антиви­ русной активности. Для выделения непосредственно активного начала наиболее эффективным оказался способ, основанный на этанольноы осаждении. При этом удается не только выделить, но частично и сконцентрировать активное начало. Лектины каланхоэ обладают способностью в различной степени агглютинировать эритроциты человека,курицу, лошади, барана, кролика. Обнаружена корреляция между гемагглютинирушеЗ и анти­ вирусной активностью каланхоз. Такая зависимость прослежи­ вается практически для всех видов каланхоэ. Корреляции со­ храняется на этапах очистки и выделения антивирусном нача­ ла,когда препараты освобождаются от многих балластная ве­ ществ . По имеющимся в литературе данным, содержание лектинов в растениях подвержено изменениям в течение года.Максжаль- ное их количество накапливается в период наиболее интенсив­ ного развития того вегетативного органа (семена, корни, ко­ ра и т.д.), в котором они содержатся /I/. Как показали спе­ циально проведенные эксперименты и анализ данных, получен­ ных при изучении вирулицидных свойств, для каланхоэ также 190 свойственны колебания антивирусной активности на протяжении года. Наблюдаются два пика антивирусной активности - весен­ ний и летне-осенний. Максимумы активности совпадают с нача­ лом бутонизации и периодом наиболее интенсивного роста ка­ ланхоэ. Механизм антивирус го действия лектинов состоит в конкурентном связывании вирусных рецепторов.При этом вирус­ ные частицы теряют свою инфекционность и склеиваются (ви- рулицидное действие). Вирусостатическая активность лектинов проявляется в основном на ранних этапах вирусной репродук­ ции и объясняется связыванием клеточных рецепторов, необхо­ димых для прикрепления вирусов. Лектины могут и блокировать участки клеточной мембраны, участвующие в выходе вирусов из клетки, что выражается в ингибиции поздних этапов вирусной репродукции /3, 6/. При изучении механизма антивирусного действия лектинов каланхоэ с использованием электронной микроскопии показано, что непосредственно инактивируншее действие препаратов со­ провождается склеиванием вирусных частиц, изменением их морфологии, однако,разрушения вирусов не происходит. Другое проявление антивирусной активности каланхоэ состоит в TOJ>- моженкй адсорбции вирусов на клетках. При предварительной обработке культур клеток препаратами каланхоэ вирусы вообще теряют способность адсорбироваться на таких клетках. Выра­ женный профилактический эффект проявляют каланхоэ и при экспериментальной гриппозной инфекции на уровне целостного организма. Л и т е р а т у р а 1. Boyd W. The lectins: their present status // Vox. Sanguinis. - 1963. -Vol. 8. -P. 1-32. 2. Cartwrignt B. Effect of concanavalin A on vesicular stomatitis virus maturation. // J.Gen.Virol.-1977.-P.249. 3. I bo M., Barron A. Enhancement by phy tohaemagglu tinin of inactivation of herpes simplex virus by concanavalin A. // J. Gen. Virol. - 1976. - Vol. 33. - P. 259-266. 4. Stitz L., Reinacher M., Becht H. Studies on the in­ hibitory effects of lectins on myxo-virus release // J.Oen, 191 Virol. - 1977. - Vol. 34. - P. 523-530. 5. Takehara M. Effect of plan lectins on polykaryocube formation by vesicular stomatitis virus in BHK-21 cells. // Microbiol, and Immunol. - 1979. - Vol. 23. - p. 921-925. 6. Urade M., Sato M., Yoshida H., Sirasuma K., Miyara- ki 'Т., Yamaooto N. Effect of concanavalin A on the infecti- vity of rubella virus and its variants. // Arch. Virol. - 1978. - Vol. 56. - P. 359-363. ОБНАРУЖЕНИЕ ИНСУЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ И НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ НЕЙРОЫАСТОМЫ CI300 N18 Н.М.Гулая, Е.С.Гаврилюк, М.Д.Луцик, О.Ф.Передерей Институт биохимии ш. А.В.Палладина АН УССР, Киев Вопрос о наличии и распределении инсулиповых рецепто­ ров на поверхности нервных клеток долгое время оставался не выясненным. В последние годы было показано, что в различных отделах нервной системы имеются специфические рецепторы для связывания инсулина. Описаны некоторые характеристики этих рецепторов /4, 6/. Большинство исследований посвящено их изучению в мембранах, выделенных из различных отделов моз­ га. Работ, посвяшенных изучению инсулиновых рецепторов в культивируемых нервных клетках, немного /2, 7/. Цель настоящей работы состояла в выявлении, идентифи­ кации и характеристике инсулиновых рецепторов на мембранах клеток нейробластомы CI300 N18, адаптированных к среде Игла. Для морфологического выявления инсулиновых рецепторов на поверхности клеток в работе впервые использован препарат стабильного комплекса инсулина с коллоидным золотом, кото­ рое является весьма удобной меткой в электронной цитохимии. Одновременно с помощью меченного коллоидным золотом овому- коида выявляли гликопротеины, связывающие агглютинин заро­ дышей пшеницы ( WGA). Агглютинин зародышей пшенжщ исполь­ зован в связи с тем, что помимо других гликопротеинов он 192 обладает высоким сродством к инсулгаовнм рецепторам /3/. Электронномикроскопические исследования инсулиновых рецепторов клеток нейробластомы проводили, используя комп­ лекс инсулин - коллоидное золото, полученный по ранее опи­ санному для других белков методу /I/. Коллоидное золото стабилизировали инсулином при pH 6,0-6,5, добавляя на каж­ дые 10 мл 0,01%-ного раствора коллоидного золота 60 мкг хроматографически чистого инсулина. Рецепторы агглютинина (wGA ) на мембране выявляли непрямым методе«, обрабатывая клетки растворам нативного агглютинина (20 мкг/мл) в тече­ ние 30 мин, а затем после отмывания от несвязанного агглю­ тинина раствором комплекса овомукоид-коллоидное золото.Аг­ глютинин пшеницы и комплекс овомукоида с коллоидным золо­ том получены описанным ранее способом /1/. Реакцию связывания меченных коллоидным золотом комп­ лексов проводили во флаконах Карреля на отмытых забуферен- ным физраствором и кратковременно префиксированных 0,1%- ным глютаровым альдегида! клетках. Время инкубации с комп­ лексом инсулин-коллоидное золото составляло I час при 4°С. Для доказательства специфичности связывания проводили кон­ трольные эксперименты в присутствии намеченного инсулина. Дальнейшая обработка клеток для электронномикроскопическо- го исследования осуществлялась общепринятым способом Л/. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме УМТП-4 и просматривали в электронном микроскопе IE0I (Япония). В результате электронно-цитохимического исследования инсулиновых рецепторов с помощью комплексов инсулина с коллоидным золотом установлено, что данный лиганд не про­ никает через целые плазматические мембраны неповрежденных клеток.Комплексы меченого инсулина располагаются исключи­ тельно в области кликокаликса на расстоянии 12 нм от по­ верхности плазматических мембран.Гранулы коллоидного золо­ та распределяются на поверхности клеток неравномерно,соби­ раясь иногда в группы из двух и более частиц. Подобное не­ равномерное распределение гликопротеиновых рецепторов на поверхности клеток нейробластомы отмечается также при ис­ пользовании в качестве лиганда агглютинина ( WGA). Возмож­ ности и целесообразность применения WGA. В данных экспери­ 193 25 ментах основаны на том, что в молекуле иноулинового рецеп­ тора имеются углеводные детерминанты, с которыми связыва­ ется данный агглютинин /3/. Следует отметить, что предложенный метод маркирования инсулина коллоидным золотом менее трудоемок, чем описанный в литературе способ получения конъюгатов инсулина с ферри- тином /5/. Частицы коллоидного золота, по сравнению с дру­ гими электронно-плотными метками, в частности ферритином, более удобны для наблюдения как в просвечивающей, так и в сканирующей микроскопии.Высокая электронная плотность зна­ чительно облегчает количественный анализ меток на микрофо­ тографиях. Специфичность связанного меченного коллоидным золотом инсулина с инсулиновым рецептором доказывается в контроль­ ных экспериментах при избытке немеченого инсулина. В этих случаях метка на поверхности клеток выявляется только в следовых количествах. Количественный анализ полученных данных свидетельст­ вует о том, что связывание инсулина, маркированного кол­ лоидным золотом, на поверхности дифференцированных клеток увеличивается почти в 10 раз (0,7^0,1 и 6,83±1,3 гранул на 1000 ни длины мембраны на срезе недифференцированной и дифференцированной клетки). Результаты, полученные с использованием WGA , анало­ гичны данным, полученным с конъюгатом инсулин-коллоидное золото. Однако количество гранул на поверхности клеток бы­ ло в три раза выше. Это объясняется тем, что кроме инсули­ новых рецепторов WGA связывается с рядом других глико- протеинов. Полученные результаты свидетельствуют, что число и распределение инсулиновых рецепторов зависят от функцио­ нального состояния клеток. Экспрессия рецепторов на мем­ бране увеличивается почти в 10 раз в результате клеточной дифференцировки. 194 Л и т е р а т у р а 1. Хомутовский O.A., Луцик М.Д., Передерей О.Ф.//Элек­ тронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. - Киев: Наунова думка, 1986. - 168 с. 2. Ciaraldi Т., Robbins R., Leidy J.W. et ai. // Endo­ crinology. - 1985. - Vol. 116. - N 6. - P. 2179-2185. 3. Cuatrecasas P. // J. Biol. Chem. - 1973. - Vol.248. - N 1. - P. 3528-3554. 4. Hendricks S.A., Agardh C.D., Taylor S., Roth J. // J. Neurochem. - 1984. - Vol. 43. - N 5. - P. 1302-1309. 5. Ja re t b L., Smith R.M. // Proc. Hat. Acad. Sei. USA. - 1975. - Vol. 72. - N 9. - p. 3526-3530. 6. Lowe W.J., Lekoith D. // Endocrinology. - 1986. - N 4. - P. 1669-1677. 7. Rinehart С.А., Chen K.Y. // Biochim.et biophya. ac­ ta. - 1984» - Vol. 802. - N 3. - P. 515-523. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ СДВИГИ ЛЕКТШОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ДИФШВДШУЩКСЯ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ CI300 О.А.Хомутовский, О.Ф.Передерей Институт биохимии им. A.B. Палладина АН УССР, Киев Результаты многих исследователей свидетельствуют о том, что в процессе дифференциации клеток изменяется состав, структура и метаболизм основных компонентов гликокаликса - гликопротеинов и гликолипидов /6/. Общеизвестно, что именно эти компоненты гликокаликса осуществляют роцепторную функ­ цию плазматических мембран. В настоящей работе изучение ре- цепторной функции плазматических мембран клеток нейроблас­ томы CI300 проводилось с помощью лектинов, которые, как из­ вестно, обладают специфической тропностью к сахарным детер­ минантам гликопротеинов, гликолипидов и гликозаминоглика- нов. Методика использования лектинов для этой цели описана в нашей предыдущей работе /V- В работе использовали лектины трех утлеводоспецифиче- ских групп: галактозоспецифической ( ROA), N-ацетил-D -га- лактозоспецифической ( HPL, SBA , LBA ) и К-ацетил- D-глю­ козам иноспецифической ( WGA). Наличие связывания было обна­ ружено для всех вышеназванных лектинов как в случае недиф- 195 25* ференцированных, так и в случае дифференцированных клеток. В то же время, количество связанных электроноплотных конъю- гатов лектинов на поверхности дифференцированных клеток значительно отличалось от такового на поверхности недиффе­ ренцированных клеток (таблица). Так, количество конъюгатов KCA-Au, SBA-AU и WGA-Au снижалось в 1,7, 20 и 1,8 раза, НРЪ-Au и LBA-Au увеличивалось в 2 и 1,8 раза. Кроме того, для трех конъюгатов лектинов - RCA-AU , SBA-Au И WGA-AU изменялся характер расположения на поверхности клеток ней­ робластомы после их дифференциации. При интерпретации полученных данных необходимо, по-ви- димому, учитывать следующие моменты: I) возможность экрани­ рования углеводных детерминант гликоконъюгатов сиаловыми кислотами; 2) жидкостно-кристаллическое состояние бислоя.от которого зависит конфорыация и подвижность мембранных ре­ цепторов; 3) возможность стерического взаимодействия между частицами маркера. В настоящее время совершенно очевидно Л/, что связы­ вание некоторых лектинов, в частности SBA, PNA, RCA, с углеводными детерминантами клеточной поверхности в большой мере зависит от степени сиалирования этих детерминант. А именно, по мере сиалирования терминальных остатков олигоса- харидов наблюдается потеря сродства к ним вплоть до полного отсутствия связывания. Поэтому обнаруженное нами снижение связывания SBA С поверхностью дифференцированных клеток нейробластомы еще не дает права говорить об уменьшении чис­ ла соответствующих рецепторных гликоконъюгатов. Скорее все­ го факт снижения связывания SBA объясняется тем,что в про­ цессе созревания клеток происходит сиалирование их поверх­ ностных гликопротеинов /3/. В частности, именно на этом ос­ новано использование SBA и PNA ДЛЯ выявления главным об­ разом незрелых клеток /3/. Что касается RCA , то связывание этого лектина также зависит от степени сиалирования олигосахарщшых единиц, хо­ тя и в меньшей мере /2/. В то же время, согласно данным Mä­ her и Moiday /5/, RCA связывается почти исключительно с одним гликопротеином плазматической мембраны клеток ней­ робластомы, а именно,с белком М.в. 30 ООО, с которым в свою 196 Таблица Количество конъюгатов лектинов на поверхности недифференцированных и дифференцированных клеток нейробластомы CI300 ( м±ш ) Конъюгат Углеводная спед^ичнооть лектина лектина м«;Щг ДИЯД метки R CA —А И два А -/1-4/связанных ос— л п П+О ЛЛ о a П£Ч Q ОХ татка галактозы C4,u-d,yu- HPL-AU невосстановленный •£ - N - Т9 о+п до ус; ц±т яо* ацетил-в-галактозамин хс,о-и,<±» йо.з-А.оз SBA"AU inm ~аЦвТ1Ц1"Р-галактоэ- 50,0±2,30 2,5±0,26х LBA—Au 5^.—N —ацетил—D —галактоз— 2 6—0 20 4 3—0 3*5^ WGA-А И терминальные невосстанов­ ленные N—адеТИЛГЛЮКОЗ— Ol гх£д q то л+т сХ амин- или N-ацетилнейро- »' минован кислота х - различия достоверны, Р<0,05-0,001 очередь связывается и WGA , тропность которого не снижа­ ется при сиалировании олигосахаридов. Однако нами обнару­ жено (таблица), что количество связанных конъюгатов WGA-AU с поверхностью клеток нейробластомы снижается после их диф­ ференцировки. Принимая во внимание изложенное, можно пред­ положить , что при дифференцировке клеток нейробластомы уменьшается количество рецепторных полипептидов, с которыми одновременно связываются как RCA , так и WGA . Лектины KPL и LBA по углеводной специфичности очень близки между собой, причем их связывание с олигосахаридами не ингибируется сиаловыми кислотами /I/. На основании этого можно предположить, что число рецепторных гликопротеинов, имевших в качестве углеводной детерминанты ОС - N -ацетил D - галактозамин,в процессе дифференцировки клеток нейробласто­ мы увеличивается. Следует учитывать, что результаты выявления лектиновнх рецепторов методом электронной цитохимии в значительной сте­ 197 пени зависят от стерических взаимодействий как между час- типами маркера, так и между молекулой рецептора и частицей маркера /7/. Сила этих взаимодействий зависит от удаления сахарной детергананты от поверхности плазматической мем­ браны, а также от размера частиц маркера. В заключение следует сказать, что наличие лектиновых рецепторов на нейтральных клетках было отмечено рядом ав­ торов /5, 8, 4/. Интересно, что во всех исследованиях от­ мечается накопление участков связывания на пролифврирующих участках аксональных отростков. Более того, Littacuo и сотр. /4/ показали,что при дифференцировке в нейритах кле­ ток нейробластомы ряда линий обнаруживается в несколько раз больше фукозосодержааего гликопротеина, чем в телах недифференцированных клеток. На основании этого авторы предположили, что лектиновые рецепторы могут принимать не­ посредственное участие в формировании аксонов и образова­ нии синапсов. Для подтвередения этого предположения необ­ ходимы дальнейшие исследрвания с использованием как можно большего арсенала лектинов узкой специфичности, причем не только цитохимическими, но и биохимическими методами.. Л и т е р а т у р а , I. Хомутовский O.A., Луцик М.Д., Передерей О.Ф.Элект­ ронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. - Киев: Наукова думка, 1986. - 168 с. 2. Adair W., Kornfeld S. // J. Biol. Chem. - 19?4. Vol. 249. - N 5. - P. 4696-4704. 3. Dumonfc F., Nardelli J. // Immunology. - 1979.-Vol- 37. - N 1. - P. 217-224. 4. Litfcauer U.Z., Giovanni M.Y. // J. Biol. Cheffi. 1980. - Vol. 255. - N 11. - P. 5^8-5453- 5. Maher P., Molday E. // Biochem. efc biophys. acta.- 1981. - Vol. 647. - N 2. - P. 259-269. 6. Monsigny M., Kieda С., Roche A.-C. // Biol. Cell.- 1983. - Vol. 47. - К 2. - P. 95-110. 7. Norisberger M., Taelnine-Vonlanfchen M. // Lectins: biology, biochemistry, clinical biochemistry. - Berlin,New York: Gruyter. - 1983. - Vol. 3* - P. 189-197. 198 8. Kaedler A., Raedler E. // J. Cancer Res.Clin.Oncol. - 1985. - Vol. 109. - N 1. -P. 245-251. ЛЕКТИН0П0Д0ЕН0Е ДЕЙСТВИЕ ХОЛЕНОГО ТОКСИНА Е.И.Асташкин, А.М.Сурин, А.С.Гуковская, И.С.Николаева, А.В.Лазарев ВНИИ биотехнологии, г. Москва В-субъединицы холерного токсина (В-ХТ), ответственные за связывание с поверхностью клетки, селективно взаимодей­ ствуют с ганглиозидом йщ-, образуя прочные комплексы 10 - Ю~10М). При этом одна В-субъединица связывается с одной молекулой <3щ, а в молекуле токсина присутствуют 5 В-субъединиц. Таким образом, холерный токсин, благодаря 5 В-ХТ, полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к лектинам: он избирательно узнает специфическую последова­ тельность углеводов, характерную только для Ощ, и полива­ лентно связывается о GMj, Благодаря последнему свойству, токсин способен образовывать на плазматической мембране "шапочки", состоящие из комплексов В-ХТ - Ощ. В 1985 г. было обнаружено митогенное действие В-ХТ на тимоцитах крыс /2/, позже воспроизведенное на ЗТЗ клетках мышей /3/. Известно, что такие растительные лектины.как фи- тогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А) запускают пролиферацию Т-лимфоцитов человека и животных. Митогенный эффект этих лектинов связывают с увеличением внутриклеточ­ ной концентрации свободных ионов Са2+ ([Ca2+J1 ). В связи с этим цель нашей работы заключалась в том. чтобы выяснить, способен ли В-ХТ i изменять уровень [Ca +]. в тимоцитах крыс. Уровень [ Ca2*]5 в тимоцитах крыс Вистар определяли с помощью флуоресцентного индикатора Квин-2 на флуориметре Хитачи-Ф-4000 по методу Talen и соавт. /4J. Опыты прово­ дили в териостатируемой кювете при 37°с, суспензию клеток (10® клеток/мл среды Хенкса) перемешивали с помощью магнит­ ной мешалки. Добавление В-ХТ к суспензии тимоцитов крыс (1-2 мкг/мл) приводило к увеличению флуоресценции квина. Был зарегистрн- 199 ровен аддитивный эффект В-ХТ о Кон А (рис. I) и В-ХГ с <$ГА, что указывает на независимый характер действия В-ХТ и стан­ дартных митогенов. Такие же результаты были получены в ра­ боте Dixon и соавт. Л/ на тимоцитах крыс Спрэг-Доули и Вистар, обработанных В-ХГ и Кон-А. Влияние В-ХТ на Са2+ пропадало в бескальциевой сре­ де, содеркащей I мМ ЗГТА, т.е. при действии В-ХТ ионы Ca , по-видимому, "поступают" в клетки только из инкубационной среды. Однако ингибиторное действие ЗГТА было зарегистриро­ вано в средв, содержащей 1,3 мМ Са2+ и только 0,1 мМ ЗГТА, которая в данной концентрации не может связать весь кальций инкубационной среды. Изучение взаимодействия В-ХТ с &щ в растворе по смещению собственной флуоресценции В-ХТ в голу­ бую область показало, что ЗГТА в концентрации 0,1-1,0 мМ не влияет на этот процесс. Одной из важнейших характеристик ионного канала явля­ ется его специфичность. Если действие В-ХТ на Са2+ t об­ условлено образованием кальциевого канала через плазматиче­ скую мембрану тимоцитов, то интересно было бы проследить за влиянием на этот "канал" других двухвалентных катионов, в частности ионов Мп2+ . Оказалось, что Мп2+ в концентрации 0,1 мМ полностью подавляет эффект В-ХТ (рисунок 2),при этом Мп2+ не влияет на взаимодействие В-ХТ с в растворе. "Канал", образующийся при взаимодействии с тимоцитами В-ОСТ был "высокоспец^ичен" для ионов Са2+, т.к. ионы Мп2+ че­ рез этот "канал" не проходили в отличие от того, что наблю­ дается при обработке тимоцитов на фоне 0,1 мМ мп2+ ионо- мицином, когда флуоресценция квина в клетке резко падает до уровня собственной флуоресценции клеток (рисунок 2). Нако­ нец, ингибиторное действие Ми2+ в отношении В-ХТ может быть связано с тем, что мп2+ гасит флуоресценцию квина в инку­ бационной среде, в которую он выходит из клеток, на который и влияет В-ХТ. Для проверки этого предположения было изуче­ но действие В-ХТ после предварительной его инкубации с из­ бытком бщ на клетки, прокрашенные квином. Увеличение флу­ оресценции клеток в ответ на добавление В-ХТ, связанного с G сохранялось. Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемое увеличение флуоресценции квина в суспензии ти­ моцитов, возможно, не обусловлено действием самих В-ХГ на 200 200 Кон А 100 50 Кон А 100 50 400 Кон А (5") 200 100 400 Кон А 200 100 4 мнн Рис. Влияние конканавалина А (Кон А ) , В-субъединиц холерного токсина (В-СТ) и холерного токсина (CT) на концентрацию свободных ионов Ca в тимоцитах крысы, рассчитанную по флуоресцен­ ции Квин-2 201 26 MnCI Иономицин Кон-А Иономицин Кон А В-СТ . I I 4 мин Рис.2. Изменения флуоресценции тимоцитов крысы, нагруженных Са-индикатором Квин-2, под влиянием тушителя флуоресценции МпС12 , В-СТ Кон А и ионофора иономицина. 202 Квин-2 В-СТ Квин-2 да 1 "ПГ~ 4 мин Рис. 3. Влияние В-СТ и ВДГА на флуоресценцию Квин-2 кислоты в инкубационной среде без клеток 203 2 6 * мембраны клеток. В состав коммерческого препарата, кроме В-ХТ, входят также I мМ ЭДТА, 3 мМ азида натрия и 200 мМ хлорида натрия. Очевидно, что действующим началом является один из этих компонентов. Чтобы избавиться от ЭДГА и азида натрия, был проведен диализ коммерческого препарата В-ХТ через амиконовые фильтры. В-субъединицы холерного токсина после диализа в концентрации 1-2 мкг/мл не влияли на флуо­ ресценцию тимоцитов, меченных квином. При этом В-ХТ после диализа эффективно связывались о Ощ в растворе. Учитывая эти результаты, в ряде опытов было изучено влияние исход­ ного препарата В-ХТ на клетки, предварительно обработанные препаратом В-ХТ после диализа. В этих опытах исходный В-ХТ увеличивал флуоресценцию клеток, несмотря на то, что все молекулы &щ мембран тимоцитов были, очевидно, уже связа­ ны диализованным В-ХТ. Это erne раз подтверждает предполо­ жение, что наблюдаемый эффект не обусловлен мембранотроп- ныы действием В-ХТ. Чтобы окончательно убедиться в этом, было изучено влияние В-ХТ на флуоресценцию квин кислоты, добавленной к инкубационной среде без клеток.И в этом слу­ чае В-ХТ увеличивал флуоресценцию квин кислоты. Последую­ щее добавление ЗГТА на фоне В-ХТ не влияло на флуоресцен­ цию раствора. Первоначальная обработка раствора квин кис­ лоты ЗГТА сопровождалась эффектом, идентичным действию В- ХТ, последующая добавка В-ХТ также не влияла на флуоре­ сценцию (рисунок 3.). Эти данные свидетельствуют об отсутствии влияния В-ХТ на [са2+Ь » а наблюдаемые изменения, по-видимому, обус­ ловлены связыванием следов тяжелых ионов ЭДТА, присутству­ ющей в коммерческих препаратах В-ХТ, которые гасят флуо­ ресценцию квина в инкубационной среде. Таким образом, на основании представленных данных, мы приходим к выводу, что митогенный эффект В-субъединиц хо­ лерного токсина на тимоциты крыс невозможно объяснить уве­ личением внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция. 204 Л и т е р а т у р а 1. Dixon S.J., Stewart D., Grinstein S., Spiegel S. // J. Cell. Biol. - 1987. - Vol. 105. - P. 1155-1161. 2. Spiegel S., Fishman P.H., Weber R.S. // Science. - 1985. - Vol. 230. - P. 1285-1287. 3. Spiegel S., Fishman P.H. // Proc. Natl. Acad. ScL.- 1987. - Vol. 84. - P. 141-145. 4. Tsien R.Y., Pozzan Т., Rink T.J. // J. Cell Biol. - 1982. - Vol. 94. - P. 325-334. МИТОГЕННАЯ И МУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ФУК080СПЕЦИ®ЧН(ЯК) ЛЕКТИНА АЗОСПИШЛЛ Ю.В.Итальянская, В.Е.Никитина, Н.П.Панина, С.К.Кураксина Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР, Центральная научно-исследовательская лаборатория Саратовского медицинского института В последние годы лектинн находят все большее примене­ ние в практике медико-биологических исследований в качестве реагентов диагностических тестов, а также, ву ряде случаев, в качестве лекарственных препаратов. Широкое использование лектинов (в основном, растительных) в медицине обусловлено уникальными возможностями этих белков как регуляторов мета­ болических процессов /2/. Одним из наиболее ярких биологи­ ческих эффектов, цроявляемых лектинами, является стимуляция роста и пролиферации покоящихся лимфоцитов /4, 6/.Это свой­ ство впервые обнаружено у ФГА фасоли и определено как мито- генная активность. Активация покоящихся лимфоцитов лектинами - удобная модель для изучения реакции лимфоцитов на специфические ан­ тигены, поэтому исследованию названного феномена уделяется значительное внимание. Реакция бластной трансформации лим­ фоцитов широко применяется в экспериментальной медицине, клинической диагностике. Однако вопрос о механизмах мито- генной стимуляции окончательно не выяснен. Предсказать ми- 205 тогенную активность косвенно, по структуре и физико-химиче­ ским свойствам лектинов, в настоящее время не представляет­ ся возможным. Единственным критерием является эксперимен­ тальное испытание бластогенного аффекта. В наших исследованиях изучалась митогенная активность фуковоспецифачного лектина почвенных азотфиксирующих бак­ терий Azospi.ri.llum brasilense Sp7. Использовали лимфоци­ ты периферической крови человека 0(1) группы, которые выде­ лят в градиенте плотности фиколла/3/. Инкубацию с раство­ ром лектина (50 мкг/мл) проводили в течение 90 часов. Мор­ фологический учет результатов эксперимента проводили в маз­ ках, фиксированных метанолом и окрашенных по Романовскому- Гимзе. Полученные экспериментальные данные показывают,что бо­ лее трети всех живых лимфоцитов после 80 часов контакта с лектином трансформировались в типичные бласты. В некоторых из этих клеток были отчетливо видны фигуры митоза. Около четверти всех клеток представляли собой переходную форму - так называйте большие лимфоциты с признаками трансформации в бласты. Результаты количественного учета бластогенного эффекта лектина азосшрилл представлены в таблице I. Таблица I Митогенная активность фукозоспецифичного лектина азосшрилл в культуре лимфоцитов человека Условия Время Малые и .зФФавт— эксперимента культи­ средние вирования, лимфоциты типич­ большие митозы, ные лимфо- % бЛ|СТЫ, циты Бактериаль­ ный лектин 90 42,0 35,0 23,0 3,0 Контроль 90 98,6 0,6 0,8 - Таким образом, установлена достаточно выраженная блас- тная трансформация человеческих лимфоцитов под влиянием фу- козоспецафичного лектина азоспирилл, хотя метод морфологи­ ческого учета реакции бласттрансформации дает несколько за­ ниженный процент измененных клеток, т.к. в результате деле­ ния типичных бластов образуются клетки, которзые учитываются 206 как малые лимфоциты. При выявлении новых лектинов, прежде чем оценить воз­ можность их применения в качестве реагентов в медико-биоло­ гических исследованиях, необходимо выяснить, не оказывают ли они повреждающего (например, генотоксического) действия на животные клетки. В настоящее время прочное место в сис­ темах оценки генотоксичноети новых биологически активных препаратов занимают краткосрочные тесты, основанные на ре­ гистрации повреждений генетического аппарата клетки /5/. Мутагенная активность фукозоопецифичного лектина A.bra­ silense Spy оценивалась с помощью одного из онтогенетиче­ ских методов - кариологического анализа. Кабота выполнена на личинках 4-го возраста chironomus plumogus. Анализиро­ валось состояние структуры полигенных хромос см клеток слюн­ ных желез на цитологических давленных препаратах, окрашен­ ных ацетоорсеином с последующей дифференцировкой в молочной кислоте /1/. Живые личинки, а также изолированные слюнные железы хирономид, экспонировали в растворах бактериального лектина различной концентрации (500 мкг/мл, 50 мкг/мл, 10 мкг/мл, I мкг/мл). Время экспозиции 20 часов. Результаты исследования структурного состояния пол&- тенных хромосом хирономид после экспозиции в растворах лек­ тина азоспирилл показали, что во всех вариантах опыта хро­ мосомы имели четкий рисунок дисков, соответствующий нор­ мальному. Не отмечалось изменения длины хромосом. Хотя име­ лась тенденция к сжатию хромосом после инкубации в исходном растворе лектина (500 мкг/мл), однако различия с контролем были статистически недостоверны (таблица 2). Не отмечено грубых деструктивных изменений хромосом таких, как деспира- лизация до состояния плоской ленты, грануляция диенов, уши- рение междисков. Однако низкие концентрации бактериального лектина (10 и I мкг/мл) все же вызывали слабые изменения в структуре хромосом. Отмечалась некоторая индукция цуффинго- вой активности в I и III хромосомах, формирование заметного гетерохроматинового участка в центромерном районе II хромо­ сомы, асимметрия колец Бальбиани в гомологах 1У хромосомы. Высокие концентрации лектина таких изменений практически не вызывали. 207 Таблица 2 Длина хромосом клеток слюнных желез хирономид после экспозиции в растворах лектина азоспирилл (h=25) Концентра*- jteBft.žPOMggSMxJUat. ция лекти­ на. мет/мл I 2 3 4 500 122,015,7 114,314,2 78,5±3,I 39,ll2,9 50 138,3±7,3 120,116,9 II3,8±4,7 50,3l4,6 10 I35,4tn,I 102,418,1 39,9l7,6 I 151,819,3 140,4*8,2 131,116,5 63,6i2,7 Контроль 145,4*8,9 I29,8l6,6 53,III,8 р > 0,05 ß> 0,05 р 70,05 р> 0,05 Л и т е р а т у р а 1. Анкулова Е.Д.//Онтогенез. - 1987. - Л 5. - С. 469- 477. 2. Лахтин В.М.// Биотехнология. - 1986j-J* 6. -С.66-79. 3. Хейфец Л.Б., Абалакин В.А.// Лабораторное дело. - 1973. - й 10. - С. 579-581. 4. Edelman G. // Control of proliferation in animal cells / Eda Clarkson В., Baserga E. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1974. - P. 357-377- 5. Guide to ahort-term for detecting mitogenic and car­ cinogenic chemicals. Geneva:World Health Organization,1985. - 205 P. 6. Larason E., Countinho A. // Nature. 1979." Vol.280. - P. 239-241. ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ И СТИМУЛИЕУЩЕЕ ГЕМ0П033 ДЕЙСТВИЕ ЛЕКТИНОВ ИЗ КУКУРУЗНЫХ РЫЛЕЦ Н.А.Петруша Институт проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР, г. Киев Лектины представляют собой гетерополимеры и обладают способностью связываться с различными углеводами клеточной 208 H OОD > CD ос ос I 9н поверхности, вызывая их агглютинацию. Обнаружено, что ре- цепторные гликоцротеиди для одного И того же лектина в нормальных и злокачественно трансформированных клетках не идентичны. Показано также, что опухолевые клетки содержат большее число рецепторов для лектинов, снабжены большим количеством микроворсинок и имеют более обширную поверх­ ность для контактов /3/. Злокачественная трансформация клеток сопровождается повышением уровня связывания лектинами клеточных мембран пораженного органа (печень, поджелудочная железа, почки, слизистая желудка и др.). При этом возрастает синтез моле­ кул-рецепторов для лектинов, появляются оцухолеспецифиче- ские гликопротеидн на поверхности клетки, изменяются ха­ рактер и интенсивность процессов гликозилиравания. В процессе реверсии культивируемых клеток остеосарко- мы человека, индуцированной высокополярными соединениями - диметилсульфоксидом и дшетилфораамидом, отмечено снижение агглютинации опухолевых клеток в присутствии конканавалина А. После удаления этих индукторов реверсии клетки остео- саркомы возвращались в исходное состояние, проявляя высо­ кую степень агглютинации /I/. В литературе имеются данные о том, что лектин (фито- токсич/Ф) не оказывает токсического влияния на организм и повышает содержание гемоглобина, число эритроцитов, эози- нофилов и ретикулоцитов, а также уменьшает лейкопению /7/. При перевивке клеток аецитной карциномы Иосида, пред­ варительно обработанных лектинами и РНК-азой.опухоли у жи­ вотных не возникают, все животные выживают /6/. Комбинации селективно цитотоксических и имщиопотен- циирйпошзх свойств лектина омелы имеет реваюаее значение для терапевтического действия препаратов омелы /4/. Введение лектина вызывает увеличение числа лейкоцитов з периферической крови как у контрольных животных, так и у мышей-опухоленосителей, но у последних в большей степени, чем в контроле. Предполагается, что лежтины оказывают дво­ якое действие - стимулируют защитные механизмы организма и разрушают опухолевые клетки /5/. Лектины из кукурузных рилец, используемые нами в ре- 209 27 боте, получали по стандартной методике: дробное этанольное фракционирование, высаливание сульфатом аммония о последую­ щим диализом и лиофильной сушкой /2/. Обшетоксическое и противоощгхолевое действие лектинов изучалось на животных с перевивными оцухслями. Было исполь­ зовано два штамма опухолей - саркома 45 и карцинома Герена, Штаммы опухолей перевивали подкожно взвесью опухолевой тка­ ни в изотоническом растворе хлорида натрия. На 3-4-й день после перевавки животных начинали лечение. Курс лечения со­ стоял обычно из 10 инъекций, которые проводили подкожно в противоположный от опухоли бок животного. Противоопухолевое действие оценивали через 24 часа или через 5-6 суток после прекращения инъекций для выявления возможного последействия и выражали в процентах торможения роста оцухолей. Опытам по изучению антибластической активности предшествовали иссле­ дования по определению острой токсичности, которые проводи­ ли при однократном введении в брюшную полость. Учет резуль­ татов проводили в течение двух недель. Полулетальные дозы вычисляли методом интерполяции по Беренсу. В случае приме­ нения смертельных доз гибель животных наступала либо непо­ средственно после введения, либо в ближайшие дни. Отмеча­ лась адинамия, анорексия, диарея, нейтрофилез, лимфспения. Существенных изменений количества эритроцитов и гемоглобина не отмечено. Препараты растворяли ex tempore. В опыт обычно брали 2-3 образца для сравнения полученных результатов с данными контрольной группы, а также групп животных, леченных раз­ личными образцами- Для первичного отбора препаратов лечеб­ ная доза составляла V5 от ЛДс^. При хорошей переносимости в дальнейших опытах дозу увеличивали. Изучено 6 образцов лектинов: I фракция (образцы 2иЗ), 2 фракция (образцы I, 4, 5), 3 фракция (образец 6), из ко­ торых 2, 4 и 5 оказались малоактивными в противоопухолевом отношении (2-47% торможения роста оцухолей), I, 3 и 6 зна­ чительно ингибпровали рост вышеуказанных штаммов (до 74- 93%). Незначительное противоопухолевое действие на саркому 45 и карциному Герена оказывают 4- и 5-е образцы лектина. 210 Торможение роста оцухолей колеблется в пределах 15-37, не превышая 47% (4-й образец в дозе 30 мг/кг при 10-кратном воздействии на саркому 45). Значительно больший терапевтический эффект наблюдает­ ся при действии на саркому 45 первого образца лектина: в дозе 30 мг/кг при ежедневном введении в течение ю дней достоверно тормозит рост данного штамма на 74$. В опытах на штамме карциномы Герена- при применении указанного режима введения антибластический эффект выражен слабее - 49%. Противоопухолевую активность проявил второй образец лектина в отношении как карциномы Герена,так и саркомы 45, причем доза препаратов в этих случаях не имела решающего значения. Так, при введении лектина в дозе 20 мг/кг рост саркомы 45 тормозился на 47%, с увеличением дозы в 2,5 ра­ за процент торможения увеличивался только до 60%. Третий образец в дозе 50-60 мг/кг оказал незначитель­ ное противоопухолевое действие на карциному Герена - 39%, саркома 45 оказалась более чувствительной, в этих же до­ зах ингибирование роста опухоли достигало 60-66%. Наиболь­ шую ингибирующую активность проявил шестой образец лекти­ на: в дозе 60 мг/кг при девятикратном введении в брюшную полость торможение роста саркомы 45 достигало 93%. В этой же дозе карциному Герена шестой образец подавлял на 60%, при увеличении дозы до 120 мг/кг эффекта не отмечено. В целом следует отметить, что антибластическая актив- кост:> вое:: образцов лектина за исключением 5, наиболее варааена з отношении опухолей соединительнотканного проис­ хождения (саркома 45): Образцы: I - 74%, 2 - 60%, 3 - 66%, 4 - 47%, 6 - 93%. Как известно, применение большинства противоопухоле­ вых препаратов в онкологической клинике ограничивается их токсичностью, действием на быстро пролв$ерирующие нормаль­ ные ткани, в первую очередь на кроветворение. Нами отмече­ но весьма важное свойство лектинов повышать количество лейкоцитов периферической крови у животных-оцухоленооите- лей при проведении химиотерапевтического воздействия про­ тивоопухолевыми препаратами.При применении противооцухоже- 211 27* вого препарата тиоТЭФ совместно с лектинами,выделенными из кукурузных рылец,у животных наступает нормализация перифе­ рической крови. Так, при десятикратном введении тиоТЭфа в дозе 2,5 мг/кг крысам с перевивной карциномой Герена коли­ чество лейкоцитов снижается на 65% и достигает 3,5 Г/л, в то время как при сочетанном применении тиоТЗва в той же дозе и 3-го образца лектина число лейкоцитов находилось в пределах нормы 9,5-10 Г/л. Число лейкоцитов в контроле при этом достигало 22,5 Г/л. Результаты работы являются основанию! для продолжения исследований по поиску новых лектинов как противоопухолевых препаратов. Л и т е р а т у р а : 1. Вядро М.М. // Экспер. онкология. - 1985, 7 . - ü 2,- С. 46-48. 2. Голынская Е.Л. и др. // Молекул, биол. - 1980,в.27. - С. 4454. 3. Дуцик М.Д., Панасюк E.H., Луцж А.Д. //Лектины. - Львов, 1981. 4. Hartmut F.//Oncol.- 1986.-Vol.43.-Suppi.- P.23-24. 5. Robinson В.,Mekorl Т.// J.Med.Sel.-1971. - P.83-89. 6. Rovefca D., Gota F. // Boi. soe. ifcal. biol. sperim. 1968. - Vol. 44. - H 20. - P. 1678-1679. 7. Ponrone A., Sacuefis С.// Minerva pediafc. - 1971. - Vol. 23. - N 6. - P. 234-240. ЛЕКТИНЫ КАК ВОЗМОЖНОЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ НАЧАЛО У НЕКОТОШХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ Е.Л.Голынская, Н.Ф.Погорелая, В.И.Макаренко Киевский государственный университет им.Т.Г.Шевченко Выявление новых источников лектинов в отечественной флоре - важная задача в научном и практическом отношении. Актуальной представляется возможность получения набора лек­ тинов, обладающих в совокупности широким спектром углевод­ ной специфичности. В Киевском госуниверситете поиски новых источников лектинов проводили среди лекарственных растений.Исследовали 212 более 300 видов, из которых свнше 80 видов содержали веще­ ства, обладающие способностью агглютинировать эритроциты некоторых животных и птиц, а также эритроциты человека си­ стемы ABG. Выпадение в осадок при этанольном фракционировании,де­ натурация при продолжительна кипячении, потеря гемагглюти- ниругаей способности при обработке протеолитическими анти­ генами свидетельствуют о белковой природе этих веществ и дают основание отнести их к "классическим лектинам". Проведено изучение характера взаимодействия эритроци­ тов доноров четырех основных групп крови в системе АВО с лектинами 24 лекарственных растений. Пектины выделяли при помощи этанольного ступенчатого фракционирования водно-со- левых экстрактов лекарственных растений. Реакцию эритроаг- глютинации цри самопроизвольном оседании эритроцитов прово­ дили в иммунологических планшетах .Степень агглютинации оце­ нивали по пятибалльной шкале, принятой в иммунологической практике. Установлено, что эритроциты четырех групп крови систе­ мы АВО реагировали с лектинами двух лекарственных растений с аналогичной активностью. Лектины 14 видов лекарственных растений (29 вариантов опыта из 96) взаимодействовали не­ одинаково интенсивно с эритроцитами различной групповой принадлежности, либо проявляли сходную активность относи­ тельно эритроцитов двух из четырех изученных груш (вероят­ ность 80 и более процентов), таблица I. Максимальная активность реакции отмечена для эритроци­ тов группы 0, минимальная - для эритроцитов группы А. По­ следние по способности взаимодействовать с лектинами лекар­ ственных растений уступают эритроцитам остальных групп.Эри­ троциты группы 0 превосходят эритроциты остальных групп по интенсивности реакции взаимодействия с лектинами 9 растений и уступают им по активности реакции о лектинами двух расте­ ний из 14. Напротив, эритроциты группы А уступают эритроци­ там остальных групп по интенсивности взаимодействия с лек­ тинами 9 растений и превышают их по активности реакции с лектинами трех растений из 14. Соотношение числа растений, с лектинами которых эритроциты группы В превосходят, либо 213 Таблица I Достоверность различий по суммарной интенсивности агглютинации эритроцитов доноров различной групповой принадлежности с лектинаш отдельных видов лекарственных растений ( Е j) Код С -j-, условные балла Вероят­ растения ность, группа м± группа *0,5 t крови и ш крови М-Я1 3 О 11,650,40 А 10 1*0,58 2,13 96.7 7 О 3,4*0,61 А I 8Q±+0n ,4л а6 2о ,п0а9 96,3 14 О 1,8*0,50 А О 8*0,23 1,82 93,1 2 О 5.6*1,11 А 3 7*0.97 1.29 80.3 9 о 6,0*0,65 В 7*0,43 1,67 90,5 II С 1,5*0,51 В 5*0,23 1,79 92.8 2 о 5.6*1.11 6*1.00 1.34 82:0 й 5,6-1.11 AB 2 7*1,19 1,78 92,5 3 11,6-0,40 AB 10 7*0,41 1,57 88,4 II 1.5±0,51 AB 0 6*0,31 1,56 88,1 1 13,8*0,54 AB II 9*1,24 1,41 84,2 в 15,9*0,73 AB 14 4*0,79 1,40 83,9 14 1,8*0,50 AB i 0*0,30 R 1,36 82,9 1.3*0.68 AB 0 4*0,20 ..L27 ТО. А 13 8,9*0,95 0 4*0,36 1,48 86,1 13 A id »9*0,95 В I 2*0,29 91.3 9 A 6, 1*0,72 В 4 7*0,43 1,67 90-5 A I Ä,2§- В О 5*0.23 1.53 314. 13 A 2, 9*0,95 AB 2*0,42 1,61 £59,3 II A I. 7^0.75 AB 0 6*3,32 Ж 14 ,5*0,31 0 8-0,23 — sdi) 93,8 6 с ,0*0,84 Ä 15 3*0,57 1,56 £6,1 12 JL a,60. А 0 2-0,15 Jill, .85,6 16 AB 17, 4*1,23 О 15 40,85 1.34 82 "o 16 AB 17, 4*1,23 А 14 7*0,83 1,82 935 x 16 AB 17, til ,23 В 15 5*0,85 1,27 79 ,.6 6 AB 17 ,1*1,00 А 15 3*0,57 1,56 88,1 15 AB 14, 9*1,24 А 12 9*0,92 1,30 80,6 15 AB 14, 9*1,24 В 12 8*0,99 I„ 32 81,3 уступают по активности реакции эритроцитам иной принадлеж- ности, составляет 4:6, а для эритроцитов группы AB - 3:8. Можно было ожидать, что эритроциты группы 0 и группы А, для которых в целом зарегистрирована максимальная и ми­ нимальная активность относительно лектинов лекарственных 214 растений, будут противостоять друт ддупу и по интенсивности реакции эритроагглютинации с лектинами отдельных видов. Од­ нако различия по характеру взаимодействия эритроцитов раз­ личной групповой принадлежности с лектинами лекарственных растений отличаются более сложными зависимостями. В максимальном числе случаев интенсивность реакции эритроцитов группы 0 не совпадает с таковой для эритроцитов группы AB (8 растений из 14). Только в однем случае харав- тер реакции эритроцитов этих двух групп с лектинами лекар­ ственных растений аналогичен по направленности. Эритроциты группы 0 несходны по активности с эритроци­ тами группы А относительно лектинов 5 растений из 14.Из них в 4 случаях преимущество на стороне эритроцитов группы 0, в одном - на стороне эритроцитов группы А, еше в двух случаях активность реакции с лектинами для эритроцитов группы А и группы 0 сходна и достоверно выше таковой для эритроцитов группы В и группы AB. В наименьшем числе случаев различают­ ся по способности взаимодействовать с лектинами лекарствен­ ных растений эритроциты группы 0 и группы В; в 3 случаях их активность сходна и в 3 - контрастна по направленности. Относительно эритроцитов группы А противоположную по интенсивности взаимодействия с лектинами лекарственных рас­ тений позицию занимают эритроциты группы В: в 6 вариантах из 14, когда эритроциты группы А взаимодействуют с лектина­ ми определенных растений с наивысшей активностью, реакция эритроцитов группы В выражена в минимальной степени, и на­ оборот. Несходны по активности с эритроцитами группы А также и эритроциты группы AB. В двух случаях - преимущество на сто­ роне эритроцитов группы А, в 3 - на стороне эритроцитов группы AB. В трех вариантах обе группы уступают по активно­ сти эритроцитам иной принадлежности. Наибольшее сходство по характеру взаимодействия с лея- тинами установлено для эритроцитов группы В и AB: в четырех случаях (из 14) их реакция совпадает, в двух - контрастна. Установлено, что эритроциты различной групповой при­ надлежности проявляют достоверно повышенную способность взаимодействовать о лектинами одного лекарственного расте- 215 нин и достоверно пониженную - с лектинами другого, однотип­ ного с первым по фармакологическим свойствам. Интенсивность реакции агглютинации коррелирует с коли­ чеством связываемого лектина, которое, в свою очередь, за­ висит от числа рецепторов на поверхности мембраны эритроци­ та и их сродства к лективу. Представляется обоснованным заключение, что максималь­ ная активность взаимодействия эритроцитов доноров опреде­ ленных групп крови с лектинами отдельных лекарственных рас­ тений, которая достоверно превышает таковую для эритроцитов иной групповой принадлежности, свидетельствует о потребно­ сти организма в лектинах определенного типа. В организме человека имеются эндогенные лектины, син­ тез которых контролируется генетически, и экзогенные лекти­ ны, поступающие с пищевыми продуктами. Мы допускаем,что на­ личие определенного запаса лектинов различной специфичности необходимо для поддержания нормальной жизнедеятельности роста и воспроизведения организма. В свою очередь, измене­ ния нормального уровня лектинов вследствие генетических причин, обеднения лицевой базы либо развития патологичес­ кого процесса может оказать глубокое влияние на жизнеспо­ собность организма, как это известно для иных биологически активных соединений, например, витаминов, гормонов и др. В качестве физиологически активных соединений лектины не имеют аналогов. Парные взаимодействия рецептор-лектин являются сигналом, который лежит в основе формирования мно­ гих разнонаправленных процессов Б биологических системах. Большое число фактов свидетельствует, что лектины являются мощными биологическими стимуляторами, активизируюаими за~ щитные силы организма. Поэтову представляется перспективным целенаправленное использование лекарственных растений, со~ деркаших лектины, для поддержания и усиления физиологиче­ ских функций организма человека с целью профилактики. С указанной целью авторы рекомендуют использовать 16 видов лектинсодеряаших лекарственных растений в соответст­ вии с обнаруженным к ним сродством эритроцитов доноров че­ тырех основных групп крови. Специфичность и высокая биологическая активность лек- 216 тинов создают также некоторые новые возможности и в фитоте­ рапии, в частности, возможности подбора активных лектинов за счет лекарственных растений в соответствии с групповой принадлежностью эритроцитов и реактивностью организма боль­ ного. ЛЕКТИНЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ В ИММУН0ДЙА1Н0СТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ А.А.Осьмак, Е.Л.Голынская, В.И.Макаренко, Л.Р.Сокирко Госпиталь Ä 408, г. Киев Киевский госуниверситет им. Т.Г.Шевченко Известно, что малигнизация связана с существенными из­ менениями состава и структур! мембранных гликопротеинов. В ходе процесса превращения нормальных клеток в опухолевые меняется способность клеточных мембран связывать лектины /2, 4-9/. Нами исследована способность форменных элементов крови взаимодействовать с лектинами в ходе реакции гемагглютина- ции в норме и при развитии злокачественных новообразований. В качестве тест-объекта с этой целью впервые использовали нативные эритроциты периферической крови человека.Ранее для решения сходной задачи исследовали иммунокомпетентные клет­ ки: моноциты, лмфоциты. Эритроциты - один из наиболее доступных источников нор­ мальных изолированных клеток, который используют при изуче­ нии характера взаимодействия лектинов с рецепторами мембран. Рецепторы на мембранах эритроцитов тождествены таковым на мембранах лимфоцитов. В отличие от лимфоцитов, эритроциты у данного человека представлены однородной популяцией, срок жизни эритроцитов многократно превышает таковой для лимфо­ цитов. Агглютинация эритроцитов обычно совпадает со связы­ ванием лектина, а интенсивность этого процесса сопряжёна с количеством связываемого лектина, которое, в свою очередь, зависит от числа рецепторов на мембране и щ сродства к лектину. Реакции, основанные на агглютинации эритроцитов, весь­ ма чувствительны и специфичны. Использование эритроагглюти- 217 28 нации позволяет сохранить природную специфичность и свой­ ства рецепторов для лектинов на мембранах эритроцитов и существенно уменьшить вероятность артефактов. В качестве иммунодиагностических препаратов использо­ вали набор лектинов, выделенных из 24 лекарственных расте­ ний, ранее в этом отношении не изученных. Лектины осаждали из водносолевых экстрактов растений ступенчатым этанольным фракционированием. При выполнении работы ставилась задача наиболее полного извлечения совокупности лектинов, синте­ зируемых лекарственными растениями (суммарные лектины). Реакцию эритроагглютинации при самопроизвольном осе­ дании эритроцитов в иммунологических планшетах выполняли по известному способу. Степень агглютинации оценивали ви­ зуально прямым определением в каждом из 8 разведений ис­ ходного раствора по пятибалльной шкале, принятой в иммуно­ логической практике (в условных, баллах) Л/. Для сравнительной оценки характера взаимодействия эритроцитов доноров и онкологических больных с лектинами лекарственных растений разработана система показателей (таблица I). Основным контролируемым параметром определена суммарная интенсивность реакции эритроагглютинации.Резуль­ таты экспериментов обрабатывали методами вариационной ста­ тистики. Исследовали 76 доноров четырех основных групп крови в систоле АВО и свыше 50 онкологических больных с заболева­ ниями желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы,лег­ ких. Показано, что активность взаимодействия эритроцитов доноров различной групповой принадлежности с лектинами ле­ карственных растений различна. Максимальная активность ре­ акции отмечена для эритроцитов группы 0, минимальная - для эритроцитов группы А. Последние по способности взаимодей­ ствовать с лектинами лекарственных растений уступают эри­ троцитам остальных груш. Эти данные привлекают внимание в связи с тем, что в литературе имеются строгие доказатель­ ства наличия связи между группой крови А и некоторыми он­ кологическими заболеваниями /3/. Установлено, что по интенсивности взаимодействия с 218 Таблица I Показатели сравнительной оценки интенсивности реакции агглютинации эритроцитов доноров и больных с лектинами лекарственных растений Показатель и его условное обозна- Сущность показателя S8SB8 Совокупность Общее количество растений, использу- иоследованннх емнх в эксперименте для выделения растений N лектинов Совокупность Количество растений, лектиных которое активных оказались активными относительно эри- растений п троцитов донора или больного Совокупность Количество растений, лектины которых неактивных оказались неактивными относительно растений О эритроцитов донора или больного Совокупность Количество растений, экстракты кото- гемолитических рых вызывали гемолиз эритроцитов до- раотений Л нора или больного Видовая Сумма чисел условных баллов, оценива- интенсивность ююих интенсивность агглютинации ищ№- агглютинации .... видуальных эритроцитов с лектинами одного вида лекарственных растений при всех разведениях Суммарная Сумма чисел условных баллов, оценнва- интенсивность - ющих интенсивность реакции агглютина- агглютинации .... ̂ Н ции эритроцитов донора или больного с лектинами всех исследованных растений Титр Наибольшее разведение раствора, где агглютинации .... Т еще наблюдается агглютинирующей эф­ фект и которое выражается степенью разведения раствора Суммарный Сумма степеней, оценивающих титр ре- титр - акции агглютинации эритроцитов донора агглютинации ....т или больного с лектинами всех иссле­ дованных растений Суммарная интенсивность агглютинации, соотнесенная ко всей совокупности ис- 2. H/N следованных растений Суммарный титр агглютинации, соотне­ сенный ко всей совокупности исследо- ^ T/N ванных растений Суммарная интенсивность агглютинации, соотнесенная к совокупности активных N/n растений Суммарный титр агглютинации, соотне­ сенный к совокупности активных раст»- J5 Т/п ний 219 2 8 * лектинами лекарственных растений эритроциты онкологических больных статистически достоверно уступают эритроцитам до­ норов всех групп. При использовании критерия знаков для ранжирования рядов доноров и онкологических больных по признаку "суммарная интенсивность агглютинации" не отмече­ но ни одного случая превышения абсолютного значения вари­ ант для ряда онкологических больных соответствующих им по ранту вариант для ряда доноров. Средние арифметические по указанному признаку для вариационных рядов доноров всех групп и вариационных рядов онкологических больных досто­ верно различаются между собой. Доверительные границы для средних арифметических генеральных совокупностей доноров четырех групп и онкологических больных по контролируемому параметру не совпадают (таблица 2). Суммарная интенсивность агглютинации эритроцитов он­ кологических больных при взаимодействии с лектинами лекар­ ственных растений из предложенного набора снижается на 30- 60 и более процентов в сравнении с таковой для эритроцитов доноров. При заболевании не онкологического, а воспали­ тельного характера, указанные различия между донорами и больными не регистрируются. Различия по суммарной интенсивности эритроагглютина­ ции между донорами и онкологическими больными определяются в первую очередь тем, что эритроциты онкологических боль­ ных взаимодействуют с лектинами достоверно меньшего числа лекарственных растений из предложенного набора, а интен­ сивность реакции в тех случаях, где она еще сохраняется, также падает. Обнаружены . растения, с лектинами которых снижение активности взаимодействия эритроцитов онкологиче­ ских больных особенно значительно и отмечается у подавля­ ющего числа больных. По ряду других растений различия меж­ ду больными и донорами носят градуальный либо взаимоисклю­ чающий характер. Все изложенное позволяет прийти к заключению, что при развитии злокачественной опухоли в организме больного оп­ ределенный тип ц/или определенное число рецепторов для лектинов на мембранах эритроцитов блокируется, что и обус­ ловливает снижение активности их взаимодействия с лектина­ ми лекарственных растений. 220 Таблица 2 Статистические показатели для вариационных рядов доноров различных групп крови и онкологических больных по признаку суммарная интенсивность агглютинации эритроцитов при зэажодействии с лектинами лекарственных растений (в условных баллах) варианты оверит г ран.для 3 Ilm М ё m ср.гене­t05 ральной совокупи. Доноры групп крови 0 25 140-289 192 39,8 8,0 176-208 3 19 125-248 188 33,9 7,8 173-203 AB II 158-256 189 31,2 9,4 171-207 А 21 122-256 174 36,8 8,0 158-190 Онкологиче­ ские больные Опыт I 12 53-161 118 35,5 10,3 4,3 98-138 Опыт 2 12 78-175 128 26,6 7,7 4,5 II3-I43 Опыт 3 9 78-150 117 23,3 7,8 5,1 102-132 Примечание: коэффициент Стьюдента (^QR) рассчитан для онкологических больных и доноров группы А с минимальным значением признака. Исследование природы ингибиторов, взаимодействующих с рецепторами для лектинов на мембранах эритроцитов и, по-ви­ димому, также на мембранах иммунокомпетентных клеток в ходе процесса малигнизации, представляет большой теоретический и практический интерес. Л и т е р а т у р а : 1. Хомутовский O.A., Луцик М.Д., Передерей 0.5. Элект­ ронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. - Киев: Нау- кова думка, 1986. - С. I-I66. 2. Boldb D.H., Nelson М.О. // Cancer. - 1983- - Tol.51. - N 11. - P. 2085-2089. 221 3. Clarke с.А. Группы крови и заболевания У/ Штерн К. Основы генетики человека. - М.: Медицина, 1965. - С. 597- 627. 4. Koch В., Regnafc W., Schedel J., Hermanek H.,Leibold W.,Kalden J.R.// Immunobiol.-1983.-Vol. 164.-N 2.-P. 99-109, 5. Nicolson G.L.// Biochim,, Biophys.Acta.-1976.-P.5?-1CB. 6. Smiegel W.H., Beadier E., Readier A. // J.Clin.Chem. Clln.Bioch.em. - 1982. - Vol. 20. - N 3. - P. 131. 7. Speckart S.F., Boldfc D.H., MacDermofcfc R.P. // Blood. - 1978. - Vol. 52. - P. 681-695, 8. Sfcoddart R.W. // Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc. - 1979. - Vol. 54. - P. 199-235. 9. Tauber R., Richter L., Park C., Reuter W. //J. Clin. Chem., Clin. Biochem. - 1982. - Vol. 20. - N 3. - P. 132. ПНЖНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКТИНОВ ДИН ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РАСТВОРИМЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ИЗ МОЗГА ЖИВОТНЫХ М.А.Грудень НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина АМН СССР, Москва В настоящее время с целью изучения гликопротеинов моз­ га, участвующих и обеспечивающих реализацию ряда важнейших межклеточных и внутриклеточных процессов (например, процес­ сов адгезии клеток, рецепции и "узнавания" макромолекул, межклеточных взаимодействий и др.) актуальным является про­ блема получения данных белков в очищенном виде. Для ее ре­ шения перспективным является достаточно новый подход; а именно, использование нового типа аффинных сорбентов - им­ мобилизованная лектинов /2/. Преимущества данного подхода очевидны и многообразны; так, учитывая известный факт, что удаление углеводной компоненты у большинства биологически активных гликоконъюгатов существенно не влияет на их актив­ ность (тем самым не участвуя в формировании активных цент­ ров), аффинная хроматография гликопротеинов на иммобилизо­ ванных лектинах перспективна с точки зрения сохранения фун­ кций выделяемых белков. Промышленных препаратов иммобилизо­ ванных лектинов известно немного /I, 4/, подходящим матрик- сом для иммобилизации лектинов могут служить модифицирован- 222 нал сефароза, сфероны, пористые стекла, тойперл гель, сило- хромы. Получение иммобилизованных лектинов повысит их ста­ бильность, обеспечит возможность многократного использова­ ния, расширит круг применения в хроматографических процеду­ рах /3/. Целью настоящей работы явилось получение иммобилизо­ ванных на аминосилохроме конканавалина А из Canavaiia еп- siformes /2/ и лектина из Phytolacca americana /4/, ис­ следование их сорбционной способности по отношению к глико- протеинам мозга быка, применение в качестве аффинных сор­ бентов для выделения и очистки данных белков. В качестве матрикса для иммобилизации использовали мо­ дифицированный £ -аминопропилтриэтоксисиланоы силохром,ко­ торый по своим физико-химическим свойствам может быть срав­ нен с другими макропористыми кремнеземами, например, макро­ пористыми стеклами. Силохром обладает достаточной механиче­ ской прочностью, химической инертностью к большинству рас­ творителей, регулируемой структурой пор; они не подвергают­ ся биологическим воздействиям, доступны и дешевы. Реакция присоединения лектинов к аминосилохрому протекала в присут­ ствии растворимого метил-п-толуолсульфоната- N-циклогексил- N'-(2/4-р-морфолиноэтил)/карбодиимида (соотношение лектиц/ КДИ-1/100 при pH 5,0-5,5). Проведенное сравнение различных образцов силохрома с размером пор от 2500 А до 350 А и удельной поверхностью от 25 до 130 м^/г с количеством при­ витых аминогрупп от 220 до 280 мкэкв/г показало, что на всех образцах аминосилохромов происходит примерно одинако­ вая сорбция при иммобилизации лектинов и в изученных преде­ лах насыщения лектинами нет зависимости от удельной поверх­ ности, в связи с этим работали с аминосилохромом G-I20.Про­ цесс иммобилизации лектинов на аминосилохроме зависел от времени реакции (практически через 45-60 минут он стабили­ зировался) и от pH среды. Выход иммобилизованных лектинов составил через 3 часа иммобилизации для 1-28,7 мг/г носите­ ля, для 11-34 мг/г носителя. На иммобилизованных препаратах лектинов показано, что сорбция грубой фракции гликопротеи- нов мозга составляет 10-12 мг/г носителя. Полученные сор­ бенты использовали для выделения и очистки растворимых кис­ 223 лых и щелочных гликопротешов мозга быка, который гомогени­ зируют в 0,01 М Трис-HCI буфере pH 7,5 с добавлением 0,1 М NaCI и 0,025 М ЗДГА, центрифугируют при 21 000g , суперна- тант подвергают аминообменной хроматографии на аминосило­ хроме С-80, несвязавшиеся с сорбентом белки наносят на КМ- сефарозу 4В. Десорбированные I М наС1 белки мозга с обеих колонок с ионообменными сорбентами диализуют в присутствии I мЧ CaCL,. После диализа кислые и щелочные белки подверга­ ют аффинной хроматографии на конканавалине А-аминосилохроме, либо на лектине /4/ -аминосилохроме. Несвязавшиеся с лек- тшом белки оплывают 0,1 М Трис-HCI буфером pH 7,5, а био- специфически взаимодействушие с сорбентами гликопротеины в обоих случаях десорбируют 0,3 МоС -Д-метилглюкозидом. От - Д-метилглюкозида оевобозвдаются ультрафильтрацией через фильтр PSSM. Далее кислые и щелочные гликопротеины про­ пускают через колонки с иммобилизованными на СМВг-сефа- розе 63 антителами к кислым и щелочным гликспротеинам пече­ ни быка, собирают фракцию мозгоспецифических гликопротеинов, которые дополнительно пропускают через колонку с антителами к тубулину, иммобилизованными на CNBr -сефарозе 6В (содер­ жание антител порядка 3-5 мг/мл геля сефарозы 6В), Дополни­ тельно с целью получения растворимых гликопротеинов, обла­ дающих сродством к мозгоспацифическим белкам S 100 прово­ дили аффинную хроматографию выделенных гликопротеинов на иммобилизованных на СЩ,/сефарозе 6В белков S 100, ранее полученных нами в лаборатории,десорбцию гликопротеинов про­ водили 20 мМ ЭДГА при pH 2,0, после чего подвергали вх диа­ лизу против 0,01 М Трис-HCI буфера pH 7,0 и анализировали. Иммуноферментным анализом показана тканеспецифичность ж ви~ донеспецифичность гликопротеинов, проведен анализ углевод­ ных остатков, содержащихся в них, показана положительная реакция с красителем алциановым синим и реактивом Шиффа.Ме­ тодами электрофореза при pH 8,3 показана гомогенность пре­ паратов, а электрофорезом в присутствии 1% додецилсульфата натрия установлен их молекулярный вес и субъединичный сос­ тав, получены изо электрические точки методом изоэлектрофо- кусирования в тонком слое феррагеля (6%) в интервале pH 3,5-9 (25? амфолины). Выход растворимых гликопротеинов соо~ 224 тавил 0,15% от теоретически возможного. Таблица I Физико-химические свойства кислых и щелочных растворимых гликопротеинов мозга быка, полученных на иммобилизованном конканавалине А Наименование Молекулярная масса Изоэлектри_ Сродство к глжопротеина Дчный состав ческая точка субъе Hiß £Cj 25 3,49 + HIß 100 3,70 + Ш3 rj/Q 25 3,70 + ГП^ ß2 4,32 — И4 32 30 4,32 — 25 200 5,25 + ГП5 25 120 5,25 — ш6,ю 350 6»10 liir? 20 200 7,20 — ГП9 100 9,40 — ГПд 4q 80 9,40 + Таким образом, с помощью аффинной хроматографии на им­ мобилизованных растительных лектинах возможно получение растворимых кислых и щелочных гликопротеинов мозга, имеющих в своем составе остатки маннозы и глюкозы,а при использова­ нии дополнительных стадий выделения - получение мозгоспеци- фических видонеспецифических гликопротеинов с четкими физи­ ко-химическими свойствами. Полученные данные являются пер­ вичной информацией, необходимой для дальнейшего изучения биологической роли данных гликопротеинов. Необходимо отме­ тить, что многие органоспецифические гликопротеины имеют важное значение для процессов,связанных с дифференцировкой, формированием и поддержанием межклеточных специализирован­ ных контактов,а также выполняющих целый ряд внутриклеточных функций. Показано, что в сыворотках крови больных шизофре­ нией выявляются аутоантитела к растворимым кислым гликопро- теинам мозга, что дает основания думать о необходимости дальнейшего их изучения в норме и патологии. 225 2 9 Л и т е р а т у р а 1. Лахтин В.М.//Лектины в исследовании белков и угле­ водов. Итоги науки и техникщ//Еиотехнология. - Т. 2. - М • ВИНИТИ, 1987. 2. Дуцик М.Д., Панасюк H.H., Луцик А.Д.//Лектжы, Ки­ ев: Вища школа, 1981. - С. II4-II8. 3. Anderson D.I., Walter H.A. // J. Chromatogr,-1986. - Vol. 376. - 1 1. - P. 69-85. 4. Olason U., Mabtiasson В. // J. Chromatogr. - 1986. - Vol. 370. - N 1. - P. 29-37. РЕГУЛИЕУНЩЕ СВОЙСТВА МОНОНУКЛЕАРОВ У БОЛЫШХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕВ1АТИТ0М М.Н.Болдырева, Л.П.Алексеев, Е.С.Феденко Институт иммунологии МЗ СССР, г. Москва Атонический дерматит - аллергическое заболевание, в патогенезе которого нарушение иммунорегуляции имеет большое значение. Предполагают, что при данном заболевании имеется дефицит супрессорной активности, который приводит к усиле­ нию неконтролируемой выработки IgE. Гиперпродукция 1дЕ, вероятно, может быть связана не только с функциональной не­ достаточностью супрессорных клеток, но и с усилением актив­ ности контрасупрессорных клеток,впервые описанных в 1979 г. С.С.Гамбаровым /I/, а затем, независимо от него, в 1981 г. Gershon /4/. Значение контрасупрессии в патогенезе ауто­ иммунных заболеваний экспериментально подтверждено рядом авторов. Поскольку в литературе отсутствуют сведения об изучении контрасупрессии у лиц, страдающих аллергическими заболеваниями, нам представилось исследовать супрессорщпо и контрасупрессорную активность у больных атоническим дер­ матитом. Было обследовано 37 больных атоническим дерматитом в стадии обострения в возрасте от 14 до 40 лет (21 женщина, 16 мужчин). Контролем служили 41 здоровый донор в возрасте от 13 до 50 лет (35 женщин, 6 мужчин). Для определения регулирующей активности клеток, сти- 226 мутированных конканавалином А (Кон А), использовали метод двойной бластной транофоршщи Shou /5/ в модификации С.С.Гаыбарова (рисунок!). Метод определения контрасупрессор- ной активности основан на отмене супрессии, опосредованной Кон А-стимулированными клетками, свежавыделенными (Инт-Кл), добавленными в тест-кулыуру (ФГА-Кл) одновременно с супрвс- сорными клетками (Кон А-Кл) в соотношении 1:1:1 (рисунок I). Контраоупрессивй считали результат > 1,0. Результаты, подученные нами (таблица I), свидетельст­ вуют о том, что уровень оупрессорной активности Кон-А-сти- мулированных клеток в модели, предложенной С.С.Гамбаровым несколько ниже, чем при использовании метода Shou /5/,что, вероятно, связано с тем, что в примененной нами методике в качестве тест-клеток использовались мононуклеары, стимули­ рованные фитогемагглютинином (ФГА-Кл) в течение 48 часов (рисунок I), что по-видимому, снижает чувствительность кле­ ток к супрессируюшему воздействию Кон - А-стимулированных клеток.Кроме того,оказалось, что уровень оупрессорной ак­ тивности Кон-А-стимулированных клеток у больных атоничес­ ким дерматитом и здоровых доноров практически не различался (таблица I), из чего, однако, не следует, что супрессорные свойства сравниваемых клеток в самом деле одинаковы, по­ скольку клетки тест-системы после 48-часовой инкубации с $ГА могут находиться в разном функциональном состоянии у больных атомическим дерматитом и здоровых доноров. Клетки, инкубированные в течение 48 часов без митогена (рисунок I), при добавлении их в тест-систему, У здоровых доноров в большинстве случаев не изменяли уровень включения радиоактивной метки в клетки тест-системы.У больных же ато­ ническим дерматитом в 76% случаев (19 из 25) по сравнению с 49% (24 из 49) у доноров(р< 0,05)такие клетки увеличивали включение метки в клетки тест-системы (таблица I). Таким образом, пока неизвестно, связано ли отсутствие различий в оупрессорной активности Кон - А-стимудированных клеток между больными и здоровыми донорами с недостатками новой модели или оно отражает восстановление оупрессорной активности клеток у больных в результате действия митогенов. Однако,преимуществом данной модели является то,что она дает 227 29* Таблица I Сулрессорная и кон трасуi rpecс о рная активность у больных атоническим дерматитом ^он А №Кон А №Сп КСКон А Больные 0,77*0,28 1,15*0,29 1,24*0,43*** доноры"6 0,56*0,03 0,78*0,35 1,03*0,32 0,97*0,36 Примечание: ИТ 0̂Н д - значение взято из литерат.источника 3. зеве Р< 0,001 возможность изучать регулирующее действие свеяевыделенных клеток на супрессорную систолу, исключая прямое действие митог'енов на эти клетки. По нашим данным, отмена супресси- рутоего действия Кон А-стимулированных клеток на тест-сис­ тему (контрасупрессия), была выражена в разной степени у больных атоническим дерматитом и здоровых доноров (табли­ ца I). Если у больных контрасупрессорная активность свежо- выделенных клеток выявлялась в 75,7% (28 из 37), то у здо­ ровых доноров только в 41,6# (25 из 60) р< 0,001. Для исключения возможности стимулирующего действия на свежевыделенные клетки растворимых факторов, образующихся при совместной инкубации клеток супрессорной системы,их по­ мещали на 16-20 часов в супернатант, образующийся в резуль­ тате 16-ти часовой инкубации клеток супрессорной системы. Как видно из таблицы 2, величина включения радиоактивной метки в интактные клетки после инкубации в супернатанте не увеличивалась. Таким образом, источником контрасупрессорной активности у больных атоническим дерматитом, по-видимому, являются свежевыделенные клетки. 228 КонА(20мкг/юг) $ГА(1Смкг/ш) Среда 48 часов при 37°С, 5% СО. КокА-Юг Сл-Юг штоыипян С митомицин С Г :*н - М К Д X Н 6-20 часов при 37°С, Ъ% CQg срм срм срм / UP.. . (КонА-К^-ЛгА-Кл)-КонА-Кя" \ ЬкА= \ /' туп; / (КЬнАмм+ФФГГАА--ККлл-»и-иннгг--ККяя))--иинт-Кя ИР-йп=Л CСп-nК^^-А-ИKл)i-Сг*ьК^1 -ЮБзЬинА' ({Кон А-КЛ-ФГА-К»!) ф-ла I. Рис. I. Схема проведения эксперимента 229 Таблица 2 Влияние супернатанта стимулированных культур на свежевыделенные клетки Инт-Кл Супреосорная Контрасупрессор- Инт-Кл в супернатан- срм сума ная о-ыа те от супрессорной ...дли sm fcjflsu. .sm 887 57169 66785 622 541 50II2 61490 758 342 73109 85448 909 316 I8174 20049 140 2318 36676 50340 702 Л и т е р а т у р а : 1. Гамбаров С.С.//Биол.ж.Армении. - 1979. - Т. 32. - *8. - С. 7. 2. Гамбаров G.G., Шахсуваров A.B., Адамян Н.В. и др./У Экспер. и клин, медицина. - 1986. - Т. 23. - J6 3. - С. 274. 3. Яздовский В.В., Алексеев Л.П., Ульянова Л.И. и др. У/ Препараты и методы лечения и диагностики аллергии. - М., 1985. - С. 41. 4. Gerahon R.K., Eardley D.D., Durum S. et al.//J,Exp. Med. - 1981. - Vol. 153. - P. 1533. 5. Shou L., Schwartz S.A., Good R.A. // J. Exp. Med. - 1976. - Vol. 14-3. - P. 1100. ВЛИЯНИЕ ПЕКТИНА ABACH IS HYPOGBAE (РИА) НА ЦИТАДГВЗИЮ И 1ШАГЕЗШШНАЩЮ ЛАКТОБАЦШШ И КИШЕЧНЫХ ПАПОЧЕК В.И.Брилис, М.Э.Микельсаар, Р.Х.Касесалу, Э.И.Тюри, М.М.Утт, А.А.Ленцнер Тартуский государственный университет Специфическая ассоциация микроорганизма с клеткой мак­ роорганизма (цитадгезия), осуществляемая путем взаимодейст­ вия бактериальных адгезинов с рецепторами клеток макроорга­ низма, необходима для приживления и сохранения его в микро­ биотопе. У некоторых бактерий адгезинн выполняют узнавание 230 рецепторов по типу углевод-белкового связывания, характер­ ного для лектинов /3, 5/. Указанный тип связывания имеет место у ряда патогенных микробов, например, у некоторых стрептококков /6, 9/, ки­ шечных палочек /7/, кандид/14/. Поэтому,на наш взгляд,мож-- но рассматривать возможность использования лектинов с ле­ чебно-профилактической целью в качестве ингибиторов цитад- гезии. Таково же мнение H.L.KO и др. /II/. Лектиноподобным взаимодействием могут обладать и неко­ торые представители микрофлоры организма, в частности, лак- тобациллы /8, 9, 15/, бактероиды /13/. Поступая в организм с пищей, лектины микробного, животного или растительного происхождения могут приводить и в выраженным сдвигам в мик­ роэкологии, что было показано J.G. вanwell и др. /4/,путем введения крысам лектина EHA. Исследование взаимодействия лектинов с микроорганизма­ ми может дать ценную информацию об углеводном составе кле­ точных поверхностей, об их функциональном значении.)" стреп­ тококков группы В, например, показано, что их лектины спо­ собны подавлять фагоцитоз /10, 12, 16/. Задачей настоящего исследования было изучение взаимо­ действия растительного лектина Arachis hypogeae ( РИА ) с лактобациллами из нормальной микрофлоры человека и живот­ ных, а также с уропатогенными штаммами кишечных палочек на модели гемагглютинации и адгезии микробов к эритроцитам. М а т е р и а л ы и м е т о д ы . В р а б о т е и с п о л ь ­ зовано 20 штаммов микроорганизмов, среди которых 6 штаммов ОТНОСИЛИСЬ К Lactobacillus acidophilus, по ОДНОМУ — L. sa- livarius, L.casei и Ь» plantarum, 2 - L. brevia, 4- L. fermenbum, ОДИН — L.buchneri , ВЫД&Л6ННЫХ ОТ ЛЮД6Й,ПОРОСЯТ и крыс, а также 4 штамма .escherichia coli, изолированных от урологических больных. Лактобациллы выращивали в среде MFC—I в течение двух суток, а кишечные палочки - в течение суток на скошенном МПА. Цитадгезию определяли по методике В.И. Бриллиса и др. /I, 2/ с применением формалинизированных эритроцитов чело­ века 0/1 группы крови Bh (+). Гемагглвтинацию изучали пос­ ле 24-часового отстаивания взвеси при комнатной температуре. 231 Использовали дентин арахиса. - РNA, производства коопе­ ратива "Д1агностикум" (Львов). Опыты ставили при концентра­ циях препарата 5 мг/мл и 25 мг/мл; время воздействия 30 мин при 37°С. Опыты выполняли в трех вариантах: при первом - предварительно лектином обрабатывали тест-культуры микроор­ ганизмов; при втором - предварительно с РНА помещаки эри­ троциты; при третьем - PNA добавляли в готовую систему "микроб-эритроцит". При первых двух вариантах после преин- кубации клеток их отмывали от остатков лектина центрифуги­ рованием (лактобациллы - 1500 od/мин, кишечные палочки - 3000 об/мин, эритроциты - 500 об/мин). Перед каждым опытом дополнительно изучали аутоаггрега- цию тест-культур. П о л у ч е н н ы е р е з у л ь т а т ы , и х о б ­ суждение. В ходе проведенных исследований показано, что лектин арахиса РНА может оказывать существенное влия­ ние на цитадгезию и в некоторой степени изменять гемагглю- тинируицую способность изученных микроорганизмов (таблица). По характеру изменения цитадгезш под действием лект»- на все изученные микроорганизмы подразделялись на две груп­ пы. Первую составили микробы, адгезивностъ которых в значи­ тельной степени снижалась, причем при концентрации РЖ 25 мг/мл больше, нежели при 5 мг/мл. В ней оказались все взятые В опыт штаммы L.fermenfcuui, L.casei, L.planbarum, L« buchneri, а также штаммы L.acidophilus Лр L. brevis 1-6 и два низкоадгезивных штамма Е.coli 6290 и 6306. У штаммов второй группы адгезивность повышалась, при­ чем при 5 мг/мл в большей степени, чем при 25 мг/мл, д осо­ бенно после предварительной обработки лектином микробов.Это имело место у 5 из 6 взятых в опыт штаммов ъ. acidophilus, У L.salivarius Л^, у L.brevis Лд, а также у двух сред- неадгезивных штаммов Е.coli „ Как в первом, так и во вто­ ром случае определенной зависимости изменений от происхож­ дения штамма, а у лактобацилл и от степени адгезивнооти6 не наблюдалось. Влияние лектина арахиса на гемагглютинацию микроорга­ низмов было менее выраженным, чем на цитадгезию. У большик- ства тест-микробов гемагглютинируюшая активность под дейст­ 232 вием рм не изменялась. Это касается как штаммов имевших, так и не имевших указанных свойств. В этой группе оказалось 5 ИЗ 6 штаммов L.acidophilus , Вбе изученные L.saUvai-iua, L.casei, L.plantarum, E.coli , а также штаммы L.fermentum, Лю И L.brevis Лд. Независимо от результатов контроля, гемагглютинация у остальных 6 штаммов в некоторой степени изменилась: она все­ гда отсутствовала после обработки лектином микробов и всегда отмечалась в большей или меньшей степени после цреинкубации эритроцитов. Если подавление гемагглютинации штамма L.fer­ mentum Дд можно объяснить участием в механизме связывания со стороны микроба остатков D-галактозы или о-галактозами- на, которые блокируются лектином, то аналогичная реакция других штаммов требует дальнейшего изучения. Неоднотипное во многом влияние PNA на цитадгезию и гемагглютинацию лактобацилл еще раз подтверждает наши преды­ дущие наблюдения, свидетельствующие об отсутствии прямой за­ висимости мевду указанными свойствами /I/. Гемагглютинация лактобацилл находится в прямой зависимости от их аггрегиру- гаей активности, ибо при наличии гемагглютинации у указанных микробов во всех случаях отмечалась и аутоаггрегация. В отличие от лактобацилл у кишечных палочек известна прямая зависимость между гемагглютинацией и адгезией. Поэто­ му отсутствие подавления гемагглютинируюиих и адгезивных свойств лектином у штаммов E.coli 6305 и 6332 говорит в пользу отсутствия у них специфичных FNA углеводных остатков. В отличие от последних, у ряда штампов лактобацилл и у штаммов E.coli 6290 и 6306 цитадгезия существенно снижа- лась после прибавления лектина арахиса. Это свидетельствует о блокировании адгезии через D-галактоз- или D-галактозами- новые остатки. На наш взгляд, в этом типе связывания возмож­ ны два варианта. Первый - между гликопротеидами гликофорина А эритроцита и остатками D -галактозы или D-галактозамина тейхоевых кислот микроорганизма, а второй - между гликопро­ теидами микробов и соответствующими остатками ганглиозидов эритроцита. Отдельного рассмотрения требуют случаи повышения под действием РНА адгезивности микроорганизмов. Очевидно у них 233 30 Таблица Цитадгезия и гемагглютинация тест-микробов после воздействия лектина арахиса Адге- Аггре- Изменение СПА , после воздействия РКА Штамм зив- гация [ мд) ГА ность с 1 II КОНТ­"I—п—Ш 25 25 5 111 25 РА 5 25 5 25 5 26 I группа L. acidophilus L1 с + -2—1,~5 й -2о9л,56$* О -42, + + + + + L. caael 1-25 С — Г7,6* 2,7- -64, L. plantarum 7-19 С — -42,1* -35,9g -61, L. fermentum L9 н + 35,1* -22,4 -49, + - + + + + L. fermentum L10 С + 5,1 38:§| 2,7„ -33, + + + + + + L. fermentum L12 с — -31,4* 51,Cg -33, - + + - - L. fermentum 1-20 с — -29;?* -25,8* -45, L. brevis 1-6 с — -61,% -Г7,6* - + + - - L. buchnerl 1-7 н — о'8 -51,9g -32,6* - + + - - E. coli 6306 н — 13,3 -68,9g -14,3 E. coll 6290 н 10,7 -71,4* 4,3 II группа L. acidophilus L2 с + 83,9g 41,9g 35,5* 33,9* 10,8 -14,5 + + + + + L. acidophilus L3 с + 55,7* за 32,8g -8,2 -6,6 + + + + + L. acidophilus L5 с — 107,4g 19.7 21 ̂3* L. acidophilus 4'f Ь6 с + 91 ,8g 46,2* 3,8„ -37j3* + + L. acidophilus L? н — 52,2? 10,9 56,5* 73,9g 32:1* 1.0.,.9 „ + + L. salivarius L10 с +-Н 88,95 18,5 29,6? 100,О* 92;6g '4-8',т1** + + + L. brevis L8 н + 52,а* -16,О, 108,? 20,0* 56,ОЕ -20,О* + + + E. coli 6332 с — 40,2? 23,1* 14,6 0,9 35,2g 10,3- + + + E. coli 6305 с — 26,0* 1,0 4,4 14.8 57,1* 84,6* + Примечание: ч - штамм изолирован от человека, п - от поросят, к - от крыс, с - средняя степень, н - низкая степень адгездивности. СüПhАa - среднидй _пок^аззааттеелльь_ ааддггееззивностиг.| ГгдА ^^гемаг- ие?№ ti$nffip?3ž â=ÄSemi,ie •Až,ssmmow^ принципиально другой механизм прикрепления, а роль лектина сводится к связыванию поверхностных структур клеток, в оп­ ределенной степени препятствующих осуществлению цитадге- зии. Поэтому после воздействия лектина арахиса как бы рас­ крываются ответственные за адгезию структуры.Если это так, то в ряде случаев по этой причине результаты цитадгезии in vitro могут значительно отличаться от таковых in vivo . В ы в о д ы. I. Лектин арахиса pna оказывает выра­ женное влияние на цитадгезию лактобацилл и кишечных пало­ чек. 2. Указанный лектин в некоторой степени изменяет гем- агглютинирующую активность некоторых штаммов лактобацилл. 3. Влияние FNA на цитадгезию зависит от концентрации лек­ тина, но не зависит от происхождения, а у лактобацилл и от степени адгезивности штамма. 4. По характеру изменения цитадгезии под действием лектина арахиса у изученных штам­ мов лактобацилл и кишечных палочек выявляются по крайней мере два отличных друг от друга механизма соединения адге- зинов с рецепторами, один из которых специфичен механизму связывания лектина арахиса. Л и т е р а т у р а : 1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. /Д. микробиол. - 1982. - J6 9. - С. 75-78. 2. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. // Лаб. дело. - 1986. - Я 4. - С. 210-212. 3. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция бимолекул. - М., 1985. 4. Banwell J.G., Howard R., Cooper D. et ai.// Appi. Environ. Microbiol. - 1985. - Vol, 50. - P. 68-80. 5. Beachey E.H. // J. Infect. Dis. - 1981.-Vol. 143.- P. 325-345. 6. Beuth J., Ко H.L., Uhlenbruch G. et ai. // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol. б. - P. 591-593. 7. Edhdat I., Sharon N. // Biol. Cell. - 1984. - Vol. 51. - P. 259-266. 8. Fuller R., Brooker B.E. // Am. J. Clin. Hutr.-1974. - Vol. 27. - P. 1305-1З12. 9. Hämada S., Gill K., Slade H.D. // Infect. Immun. - 235 3 0 * - 1977. - Vol. 18. - P. 708-716. 10. Holm S.E., Bergholm A.-M., Wagner B. et al. // J. Med. Microbiol. - 1985. - Vol. 19. - P. 317-32). 11. Ко H.L., Beuth J., Solter J. et al. // Infection. - 1987. - Vol. 15. - P. 237-240. 12. Motlova J., Wagner M., Jelinkova J. // J. Med. Mic­ robiol. - 1986. - Vol. 22. - P. 101-105. 13. Eogemond V., Guinet R.M. // Infect. Immun. - 1986.- Vol. 53. - P. 99-102. 14. Sandin R.L., Rogers A.b., Patterson R.J. et al. // Infect. Immun. - 1982. - Vol. 35« - P« 79-85» 15. Savage D.C. // Nahrung. - 1987. - Bd. 31. - S. 383- 395. 16. Wagner M., Bergholm A.M., Wagner B. et al. // Bac­ teria and the Host. - Prague, 1986. - P. 279-281. 17. Wagner M., Wagner В., Gunther E. // Proc. VtllSi In­ ternat. Symp. on Straptococci and Bbrept. Dis. — Reedbooke, 1982. - P. 70-71. 236 С О Д Е P I А Н И Е Стр. Любимова Н.В., Салькова Е.Г. Фитолектины во взаимо­ отношениях растений и патогенных микроорганизмов 3 Луцик М.Д., Кусень С.И. Лектины в исследовании структуры углеводных цепей гликопро­ теинов 10 Носенко Л.В., Ковалевская 1.М. Значение лектин-уг- леводных взаимосвязей в формировании бактериально-растительных симбиоти- ческих систем 17 Никитина В.Е., Итальянская Ю.В..Карпунина Л.В., Кураксина С.К., Пономарева Е.Г., Федорова Л.С., Позднякова Л.И. Изучение биологической роли гемаг- глютиниыов (лектинов) почвенных азот- фиксируюших бактерий 25 Лупашин В.В., Циоменко A.B., Кулаев И.С. Действие конканавалина А на секрецию фермен­ тов у клеток дрожжей aaccbaromyces öerevieiae 31 Линевич Л.И. Роль лектинов в формировании живых систем разных уровней организации 39 Кравцов Г.М., Граевская Е.Э., Дулин И.О., Гончаренко E.H., Кудряшов Ю.Б. Механизм действия конканавалина А на тучные клетки 43 Саенко Е.Л., Басевич В.В. Лектиноподобный харак­ тер взаимодействия церулоплазмина че­ ловека со специфическим эритроцитар- ньм рецептором 48 Юрченко О.В., Ветрова Е.П., Хомутовский O.A., Луцик 1.Д., Иередерей 0.*. Ультраструктурное рас­ пределение пектиновых рецепторов на поверхности лимфоидных клеток 52 Рябинина И.Д., Мирошниченко И.В., Ярилин A.A. Роль мембранных рецепторов для лектинов в преодолении гематотимического барье­ ра предшественниками Т-лимфоцитов 56 Любимова Н.В., Шувалова Е.П., Лахтин В.М.. Давлетяина М.Л. Роль лектина во взаимодействии плазмалеммы клеток клубней картофеля с клеточно-поверхностными метаболи­ тами возбудителя фитофтороза 62 Варбанец Л.Д. Взаимодействие лектина из картофеля 237 Стр. с гликополимерами согупеbacterium se- pedonicum Pseudomonas solanacearum 73 Громова Б.Б.-О. Взаимоотношения в системе возбуди­ тель фитофтороза-картофель на уровне лектинов 76 Ямалеев A.M., Ямалеева A.A., Ветрова З.В. Иммунохи- мический анализ лектинов пшеницы 81 Галкин М.А. Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на некоторые физиологшеские па­ раметры ассоциативного азотфиксирую- щего микроорганизма azospirillum bra- eilense 85 Крапивина Л.И. Исследование содержания изоформ лек­ тина пшеницы в беккроссных линиях сорта Саратовская 29 и моносомных ли­ ниях сорта Саратовская 46 91 Зайцева Ф.Б., Петров В.М., Липкин В.М. Использова­ ние агглютинина из зародышей пшеницы (АЗП) для выделения аденилатциклазы (АД) из коры головного мозга быка 94 Голынская Е.Л., Корвацкая Е.Б. Лектины генеративных органов и их роль в распознавании при взаимодействии пыльцы и пестика 97 Ильченко К.В. Лектин пыльцы табака: секреторное вы­ деление в процессе роста пыльцевых трубок и его регуляция 102 Жесткова И.М., Молотковский Ю.Г. Влияние лектина из семян сои на структуру и энерготранс- формируюшие реакции хлоропластов 108 Носенко Л.В., Пацева М.А., Лахтин В.М. Использова­ ние конканавалина А для изучения по­ лисахаридов клубеньковых бактерий го­ роха из Кругова Е.Д., Маличенко С.М., Стадник М.В., Назаренко Н.И., Старненков Е.П. Исследование лекти­ нов люпина с целью выяснения их учас­ тия в системе бобовые растения - клу­ беньковые бактерии 118 Подгорский B.C., Коваленко Э.А. Физиологические ас­ пекты регуляции биосинтеза лектинов бактерии рода bacillus 122 Еулин И.Б., Щеголев С.С. Принципы количественной оценки агглютинации клеток под дейст­ вием лектинов на основе метода спект- ротурбидиметрии 126 Самородов В.Н., Поспелов С.В. Лектины как регуляторы завязывания плодов и эмбриогенеза у груши при разных формах опыления 132 238 Стр. Сахаров И.Ю., Лахтин В.М. Применение иммобилизован­ ных лектинов для выделения и изучения изоферментов щелочной фосфатазы тюле­ ня 134 Скибо Г.Г., Коваль Л.М., Луцик М.Д., Кононенко Н.И. Меченые лектины в изучении поверхнос­ ти развивающихся нервных клеток 139 Гордеева Л.В., Богданов A.A. (мл.). Лектины, иммоби­ лизованные на поверхности липосом. Различия в связывании нормальными и трансформированными клетками 142 Граевская Е.Э., Кравцов Г.М., Ломакин H.H., Гончаренко E.H. Взаимосвязь транспорта ионов кальция и высвобождения гистамина из тучных клеток при действии конканавалина А .. 147 Павлова И.Н. Могут ли ферменты, превращающие угле­ водные субстраты, быть лектинамит 151 Купцова E.G., Пронина H.A., Семененко Е.Е. Скрининг различных видов одноклеточных водо­ рослей на содержание лектинов и их внутриклеточная локализация 154 Комарова Э.Н., Выскребенцева Э.И., Миляева Э.Л., Алексидзе Г.Я. Влияние фотопериодической индукции на изменение лектиновой активности в стеблевых апексах растений при пере­ ходе к цветению 159 Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Луцик М.Д. Лектины как гистохимические реагенты в изуче­ нии злокачественно трансформированных клеток лимфоидной ткани 165 Михайлов А.Д. Иммобилизованные лектины ь определе­ нии активности гликозилтрансфераз 170 Смородин Е.П., Куртенков O.A. Пониженное сродство альфа-2-макроглобулина плазмы крови к фитогемагглютинину при раке желудка ... 172 Никонова M.S., Михна М.Г., Яридин А.А.Изменение экс­ прессии рецептора к агглютинину ара­ хиса и пролиферативного ответа на «ГА у тимоцитов под действием препаратов тимусных гормонов 178 Луцик А.Д., Детшк E.G. Селективное выявление клеточ­ ных клонов методами лектиновой гисто­ химии 184 Евтушенко А.И. Антивирусные свойства лектинов калан­ хоэ 189 Гулая Н.М., Гаврилюк Е.С., Луцик М.Д..Передерей С.Ф. Обнаружение инсулиновых рецепторов в дифференцированных и недифферениирр- ванных клетках нейробластомы С1300Ы8.. 192 239 Стр. Хохдгтовекий O.A., Передерей О.Ф. Количественные сдви­ ги лектиновых рецепторов на поверхнос­ ти дифференцирующихся клеток нейро- бластомы CI30Ö Г.... 195 Асташкин Е.И., Сурин A.M., Гуковская A.C., Николаева И.С., Лазарев A.B. Лектиноподобное действие холерного токсина 199 Итальянская D.B., Никитина В.Е., Панина Н.П., Кураксина С.К. Митогенная и мутагенная активность фу- козоспецифичного лектина азоспирилл .... 205 Петрутаа H.A. Противоопухолевое и стимулирующее ге- мопозз. Действие лектинов из кукуруз­ ных рылец 208 Голынская Е.Л., Погорелая Н.$., Макаренко В.И. Лекти­ ны как возможное фармакологически ак­ тивное начало у некоторых лекарствен­ ных растений 212 Осьмак A.A., Голынская Е.Л., Макаренко В.И., Сокирко Л.Р. Лектины лекарственных растений в имму­ нодиагностике и прогнозировании 217 Грудень М.А. Применение иммобилизованных лектинов для вцделения и очистки растворимых гликопротеинов из мозга животных 222 Болдырева М.Н., Алексеев Л.П., Феденко Е.С. Регулиру­ ющие свойства мононуклеаров у больных атоническим дерматитом 226 Брилис В.И., Микельсаар М.Э.. Касесалу Р.Х., Тюри Э.И., Утт М.М., Ленцнер A.A. Влияние лектина araohie hypogeae (PNA) на цитадгезию и гемагглютинацию лактобацилл и кишеч­ ных палочек 230