TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT BIOTEHNOLOOGIA ÕPPETOOL Kati Hiieleek DNA koopiaarvu muutused primaarse munasarjade puudulikkusega naistel Magistritöö Juhendaja prof. Ants Kurg, Ph.D TARTU 2013 Sisukord LÜHENDID JA MÕISTED ..................................................................................................... 4 SISSEJUHATUS ...................................................................................................................... 6 1 KIRJANDUSE ÜLEVAADE ........................................................................................... 7 1.1. Primaarne munasarjade puudulikkus ........................................................................... 7 1.1.1 POI tagajärjed ....................................................................................................... 7 1.1.2 Mehhanismid, mis viivad munarakkude reservi enneaegse kahjustumiseni ........ 8 1.1.3 POI diagnostika .................................................................................................... 9 1.1.4 POI etioloogia ...................................................................................................... 9 1.2 POI geneetilised põhjused ......................................................................................... 10 1.2.1 X-kromosoomi defektid ..................................................................................... 10 1.2.1.1 Turneri sündroom ........................................................................................... 10 1.2.1.2 X-kromosoomi trisoomia ................................................................................ 11 1.2.1.3 X-kromosoomi ümberkorraldused ja POI ...................................................... 11 1.2.2 POI-ga seotud geenid X-kromosoomil ............................................................... 12 1.2.2.1 FMR1 geen ..................................................................................................... 12 1.2.2.2 BMP-15 ........................................................................................................... 13 1.2.2.3 Teised potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid X-kromosoomil ............... 15 1.2.3 POI-ga seotud geenid autosoomidel ................................................................... 16 1.2.3.1 GDF-9 ............................................................................................................. 16 1.2.3.2 FOXL2 ............................................................................................................ 16 1.2.3.3 Folliikuleid stimuleeriv hormoon ja luteiniseeriv hormoon ........................... 17 1.2.3.4 Inhibiin ............................................................................................................ 17 1.2.3.5 Teised potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid autosoomidel ................... 18 1.2.3.6 Ülegenoomsed uuringud ................................................................................. 19 1.3 Metaboolsed haigused POI tekkepõhjusena – galaktoseemia ................................... 19 1.4 Autoimmuunhaigused POI tekkepõhjusena .............................................................. 20 1.5 Iatrogeensed POI tekkepõhjused ............................................................................... 21 1.6 Viirushaigused POI tekkepõhjusena .......................................................................... 22 1.7 Toksiinid ja muud keskkonna ning elustiili faktorid POI tekkepõhjusena ................ 22 2 EKSPERIMENTAALNE OSA ...................................................................................... 24 2.1 Materjal ja metoodika ................................................................................................ 25 2 2.1.1 Uuritud patsientide fenotüübid ........................................................................... 25 2.1.2 Mikrokiibianalüüs .............................................................................................. 26 2.1.2.1 Genotüpiseerimistulemuste analüüs ............................................................... 26 2.1.3 Tulemuste kinnitamine reaalaja kvantitatiivsel PCR meetodil .......................... 27 2.1.4 LOH alades leitud POI-ga seotud geenide sekveneerimine ............................... 28 2.1.4.1 Polümeraasi ahelreaktsioon ............................................................................ 28 2.1.4.2 Sekveneerimine .............................................................................................. 29 2.1.4.3 Andmete analüüs ............................................................................................ 29 2.2 Tulemused ................................................................................................................. 30 2.2.1 Genotüpiseerimistulemused ............................................................................... 30 2.2.1.1 Koopiaarvu variatsioonid ............................................................................... 30 2.2.1.2 Heterosügootsuse kaotanud alad .................................................................... 32 2.2.2 Sekveneerimistulemused .................................................................................... 32 ARUTELU ........................................................................................................................... 33 KOKKUVÕTE .................................................................................................................... 39 SUMMARY ......................................................................................................................... 40 TÄNUAVALDUSED .......................................................................................................... 41 KASUTATUD KIRJANDUS ............................................................................................. 42 LISAD .................................................................................................................................. 48 3 LÜHENDID JA MÕISTED AFC Antraalfolliikulite arv (antral follicle count) Ahr Aromaatne süsivesinikretseptor (aromatic hydrocarbon receptor) AMH Anti-Mülleri hormoon BMP-15 Luu morfogeneesi valk 15 (bone morphogenetic protein 15) BPES Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus sündroom BRCA1 Rinnavähigeen 1 (breast cancer gene) CNV Koopiaarvu variatsioon (copy number variation) DACH2 Dachshund homoloog 2 DGV Genoomsete ümberkorralduste variantide andmebaas (Database of Genomic Variants) FMR1 Fragiilse X-i vaimse arengu mahajäävuse geen 1 (The Fragile X mental retardation 1 gene) FMRP FMR valk (FMR protein) FSH Folliikule stimuleeriv hormoon FSHR FSH-retseptor FXPOI Fragiilse X-seoseline primaarne munasarja puudulikkus (fragile X- related primary ovarian insufficiency) GALT Galaktoos-1-fosfaaturidüültransferaas GDF-9 Kasvu diferentseerumise faktor 9 (growth differentiation factor 9) HMM Peidetud Markovi mudel (Hidden Markov model) INHA Inhibiin-α subühiku geen LH Luteiniseeriv hormoon LHR LH-retseptor LOH Heterosügootsuse kaotanud ala (loss of heterozygosity) MSH5 MutS homoloog 5 OMIM Inimese Pärilike Haiguste andmebaas (Online Mendelian Inheritance in ® Man ) 4 POF Enneaegne munasarjade võimetus (premature ovarian failure) POI Primaarne munasarjade puudulikkus (primary ovarian insufficiency) RT-qPCR Reaalaja kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (real-time quantitative polymerase chain reaction) SCA-POI Steroidrakkude autoimmuunsusest tulenev POI (steroid cell autoimmunity primary ovarian insufficiency) SNP Ühenukleotiidne polümorfism (single-nucleotide polymorphism) STS Steroid sulfataasi geen TS Turneri sündroom VCD 4-vinüültsüklohekseen diepoksiid (4-vinylcyclohexene diepoxide) ZFX X-linked zinc finger geen 5 SISSEJUHATUS Naiste viljatus on oluline sotsiaalprobleem ja tervisehäda. Naise viljatuse üks peamisi põhjusi on primaarne munasarjade puudulikkus (primary ovarian insufficiency; POI), mis on saamas üha enam huvipakkuvaks uurimisteemaks oma kõrge haigusjuhtumite arvu ja efektiivse ravi puudumise tõttu. POI tekkepõhjused on väga heterogeensed, olles seotud nii geneetiliste põhjuste, vähiravi kui ka metaboolsete, viiruslike ja autoimmuunsete haigustega. Ligi veerand POI vormidest on iatrogeensed, seotud nii radio- ja kemoteraapia aga ka vaagnaluu operatsioonidega, kuid pea pooltel haigusjuhtumitel on täpne etioloogia endiselt teadmata. On võimalik, et mitmel neist on geneetiline põhjus, mida toetab ka haiguse sage esinemine perekondades. Traditsiooniline karüotüpiseerimine on olnud peamine analüüsimeetod POI patsientidel genoomsete ümberkorralduste detekteerimiseks, kuid antud tehnoloogiaga pole võimalik tuvastada alla 10 Mb suurusi genoomseid aberratsioone. Viimastel aastatel on üha enam hakatud kasutama POI patsientidel submikroskoopiliste koopiaarvu muutuste tuvastamiseks kõrge resolutsiooniga DNA mikrokiibi tehnoloogiaid. Antud meetodite abil on leitud mitmeid POI seoselisi koopiaarvu variatsioone ning kandidaatgeene. Käesoleva magistritöö eesmärgiks oli anda kirjandusel põhinev ülevaade primaarse munasarjade puudulikkuse olemusest ja selle peamistest tekkepõhjustest. Töö praktilise osa eesmärgiks oli kromosomaalse mikrokiibianalüüsi abil tuvastada primaarse munasarjade puudulikkuse diagnoosiga patsientidel haigusseoselisi koopiaarvu variatsioone ning vastavates piirkondades esinevaid POI seoselisi kandidaatgeene. 6 1 KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1. Primaarne munasarjade puudulikkus Loomulik menopaus algab naistel keskmiselt 50-aastaselt, kuid ligi 9,7%-l naistest algab menopaus enne 45. eluaastat (tegu varajase menopausiga), 1%-l enne 40.eluaastat ja 0,1%-l enne 30.eluaastat (tegu enneaegse menopausiga). POI-d defineeritakse klassikaliselt kui neli kuud või enam kestvat amenorröad (menstruatsiooni puudumine alaliselt või ajutiselt) alla 40- aastastel naistel koos seerumi folliikule stimuleeriva hormooni (FSH) tõusuga menopausi tasemele (tavaliselt üle 40 IU/L, saaduna vähemalt ühekuuliste vahedega) ning östradiooli taseme langusega alla 50 pg/mL, mis viitab hüpoöstrogenismile. Sõltuvalt POI kujunemise elueast naisel jagatakse haigusjuhtum primaarseks amenorröaks, kui naisel pole menstruatsioon alanud enne 16-18.eluaastat, ja sekundaarseks amenorröaks, kui menstruatsioon on naisel alanud õiges vanuses, kuid katkeb hiljem neljaks või enamaks kuuks (Persani et al., 2010). POI on varasemas teaduskirjanduses laialdaselt kasutusel olnud ka enneaegse munasarjade võimetuse (premature ovarian failure; POF) nimel all, kuid võttes arvesse tõendid POI pika ja varieeruva kliinilise pildi kohta, on pakutud välja primaarne munasarjade puudulikkuse termin, et teaduslikult täpsemalt kirjeldada kulgu munasarjade funktsiooni peatumiseni (Welt, 2008). 1.1.1 POI tagajärjed POI tekitab kahte tüüpi tagajärgi. Üks neist on enneaegne hüpoöstrogenism, mis omakorda põhjustab mitmete östrogeeni sihtmärk-kudede enneaegset vananemist ning tuues seega kaasa osteoporoosi, kardiovaskulaarsete ja neurodegeneratiivsete haiguste riski tõusu. Teine tagajärg on viljatus. Hüpoöstrogenismi saab praegusel ajal ravida hormoonasendusraviga kuni füsioloogilise menopausi kujunemiseani. Vastupidiselt, pole aga viljakust võimalik taastada peale POI diagnoosi ja sageli ei suudeta haigust diagnoosida varajases faasis, kui kliinilised tunnused puuduvad (Persani et al., 2010). Kuid pea 50%-l POI patsientidel, kel esinevad menopausile sarnased kliinilised näitajad, on täheldatud siiski muutuvat ja ettearvamatut munasarjade funktsiooni ning u 5-10% on suutnud rasestuda (Jin et al., 2012). 7 1.1.2 Mehhanismid, mis viivad munarakkude reservi enneaegse kahjustumiseni Arenevas munasarjas on embrüogeneesi ajal olemas umbes 7 miljonit primordiaalset folliikulit. Suurem osa neist folliikulitest läheb kaotsi sünnieelses ja -järgses elus atreesia (folliikulite degenereerumine ja reabsorbeerumine) abil ning ainult 400-500 neist ovuleeruvad enne füsioloogilist menopausi. Võimalikud mehhanismid POI tekkeks võivad olla seega a) algsete primordiaalsete folliikulite hulga vähenemine, b) kiirenenud folliikulite atreesia või c) primordiaalsete folliikulite häiritud küpsemine ja munasarjast vabanemine (joonis 1) (Persani et al., 2010). Joonis 1 Folliikulite areng, küpsemine ja POI võimalikud tekkemehhanismid (A) Folliikulite dünaamika ja füsioloogiline follikulogeneesi protsessi illustratsioon. (B) POI võimalikud tekkemehhanismid võivad mõjutada follikulogeneesi eri etappe (Persani et al., 2010). 8 1.1.3 POI diagnostika POI tähtsus üha kasvab, kuna naised rasestuvad üha enam 30ndates ja 40ndates eluaastates. Seetõttu on sellealase teadustöö eesmärgiks kindlaks teha markerid, mis suudaks ette ennustada enneaegset menstruatsiooni peatumist ja seetõttu lubada POI riskiga naistel planeerida varajasemat rasestumist. Biokeemilised markerid, nagu FSH, östradiool, inhibiin B ja anti-Mülleri hormoon (AMH), on praegu peamiselt kasutusel kinnitamaks POI diagnoosi, millele viitab menstruatsiooni ebaregulaarsus. POI etteennustamine sõltub seetõttu suuresti haiguse patogeneesi paremast tundmisest ja uute kandidaatgeenide, antikehade ning usaldusväärsete biomarkerite avastamisest ja valideerimisest (Jin et al., 2012; Persani et al., 2010). 1.1.4 POI etioloogia POI etioloogilised põhjused on väga heterogeensed ja võivad olla, kas a) geneetilised, sealhulgas aberratsioonid nii X-kromosoomil kui ka autosoomidel ja samuti mutatsioonid vastavates kromosoomides paiknevates geenides või nende regulatoorsetes alades, b) munasarjade autoimmuunsed kahjustused, c) metaboolsed haigused, d) viirusinfektsioonid, e) iatrogeensed faktorid, nagu radio- ja kemoteraapia ning ka vaagnaluu operatsioon või f) toksiinid ja muud elustiili ning keskkonna faktorid (Goswami and Conway, 2005; Jin et al., 2012). Umbes 25% kõigist POI vormidest võib klassifitseerida iatrogeenseteks ning on seotud vähiraviga, kuid rohkem kui 50% juhtumitest on idiopaatilised ja seega on POI tekkepõhjus endiselt suuresti teadmata (Persani et al., 2010). On võimalik, et suurel osal idiopaatilistel POI juhtudel on geneetiline põhjus, mida toetab ka haiguse sage esinemine perekondades (Cordts et al., 2011). Ligikaudu 10-15%-l POI juhtumitest on positiivne perekondlik seos. Samuti on mitmetel geenidel leitud seos perekondliku POI-ga (Jin et al., 2012). Davis jt uurisid 41 perekondlikku POI juhtumit ja leidsid selge geneetilise seose 11 juhtumi puhul. Ülejäänud 30 perekonna liikmetel ilmnes ülekaal uuritud naiste seas, mis võib viidata X-kromosoomi defektide olulisusele POI perekondlikes juhtudes (Davis et al., 2000). 9 1.2 POI geneetilised põhjused Geneetilisi põhjusi peetakse peamisteks menopausi iga määravateks faktoriteks ning samuti 7%-l POI tekkepõhjusteks. Kromosomaalsed aberratsioonid on peamiselt seotud X- kromosoomiga, kuid üha enam leitakse seoseid ka autosoomidega. Kuigi on leitud mitmeid POI-ga seotud geene, mille rolli patogeneesi tekkel mõistetakse, siis nende täpne geneetiline mehhanism jääb sageli siiski selgusetuks. Üldiselt võivad need aberratsioonid kahjustada meioosi väiksema geenidoosi ja mittespetsiifiliste kromosomaalsete defektide kaudu, vähendades niiviisi primordiaalsete folliikulite reservi ja kiirendades folliikulite atreesiat (Jin et al., 2012). 1.2.1 X-kromosoomi defektid POI üheks tekkepõhjuseks peetakse X-kromosoomil suuri aberratsioone tekitavaid defekte, nende hulgas ühe X-kromosoomi täielik deletsioon (Turneri sündroom), X-kromosoomi trisoomia, X-kromosoomi osalised deletsioonid või X:autosoomi translokatsioonid (Cordts et al., 2011). 1.2.1.1 Turneri sündroom Turneri sündroom (TS) esineb 1:2500 vastsündinud tüdrukul ja seda kirjeldatakse tsütogeneetiliselt kui X-kromosoomi monosoomiat (45,X) (Cordts et al., 2011). Umbes 50%-l juhtudest esineb täielik ühe X-kromosoomi kaotus, samas ülejäänutel TS patsientidel võib olla tegu X-kromosoomi mosaiiksuse (u 25%) või struktuuriliste muutustega (u 25%), mis toob kaasa n-ö pehmema fenotüübi (Bharath et al., 2010). TS-iga naiste kliinilised tunnused on gonaadide degenereerumine koos primaarse amenorröaga, seksuaalne alaareng, nahavolt kaelal, küünarliigese hüperekstentsioon ja lühike kasv (Cordts et al., 2011). 45,X karüotüübiga naistel esineb ootsüütide kaotus meioosi profaasi varajases staadiumis, tuues endaga kaasa juba lapseeas gonaadide degenereerumise ja primaarse amenorröa koos kõrgendatud FSH tasemega. Siiski, spontaanset menstruatsiooni algust ja rasedust on esinenud mitte ainult mosaiikse karüotüübiga patsientidel, vaid ka mittemosaiikse 45,X 10 karüotüübiga naistel (Persani et al., 2010). TS-i fenotüüp võib olla tekkinud mitme mehhanismi poolt, nende seas X-kromosoomi defektne paardumine meioosi käigus, kuid kõige põhjendatum neist on X-seoseliste geenide haplopuudulikkus (geenid, mis ei osale X- kromosoomi inaktivatsioonis ja mida vajatakse munasarjade funktsiooni tagamiseks kahes koopias) (Zinn et al., 1998). Kahekordse doosi vajalikkust teatud X-liitelistel geenidel võib tõestada tähelepanek, et 30-40%-l mosaiikse karüotüübiga TS-iga patsientidel kujuneb välja täielik spontaanne puberteet ja samuti sageli on neil FSH-i tase palju madalam võrreldes 45,X karüotüübiga patsientidel (Persani et al., 2010). 1.2.1.2 X-kromosoomi trisoomia X-kromosoomi trisoomia (47,XXX) puhul on tegu sugukromosoomi aneuploidiaga, mis esineb 1:1000 vastsündinud tüdrukul, kuid arvatakse, et seda diagnoositakse vaid u 10%-l juhtudest (Tartaglia et al., 2010). Seda haigusjuhtumit kirjeldati esmalt 1959.aastal 35-aastasel naisel, kel olid normaalsed intellektuaalsed võimed, kuid esines sekundaarne ammenorröa 19.eluaastast (Jacobs et al., 1959). Peale algset avastust on kirjeldatud vaid paarsada juhtumit, kus fenotüübiline varieeruvus on olnud suur. Kuigi mittemosaiiksed 47,XXX karüotüübid on kõige sagedasemad, siis u 10%-l juhtudest on leitud mosaiiksust erinevates kombinatsioonides, nagu 46,XX/47,XXX ja 47,XXX/48,XXXX, või kombinatsioonis TS-i rakuliinidega, nagu 45,X/47,XXX ja 45,X/46,XX/47,XXX (Tartaglia et al., 2010). Kuigi enamikel juhtudel meditsiinilisi probleeme ei esine, siis X-kromosoomi trisoomia puhul on täheldatud urogenitaalsüsteemi häireid, seal hulgas munasarjade ja emaka väärarenguid (Lin et al., 1993). Mitmetel X-kromosoomi trisoomiaga naistel on kirjeldatud POI-d, kuid suuremat uuringut POI levimuse kohta 47,XXX noorukite ja täiskasvanute seas ei ole läbi viidud (Tartaglia et al., 2010). Goswami jt viisid läbi 52 POI patsiendi geneetilise skriiningu ja leidsid 2 patsienti X-kromosoomi trisoomiaga ning järeldasid, et 3,8%-l POI patsientidest esineb 47,XXX karüotüüp (Goswami et al., 2003). 1.2.1.3 X-kromosoomi ümberkorraldused ja POI Tasakaalustatud X:autosoom translokatsioonidega POI patsientide tsütogeneetilised ja molekulaarsed analüüsid viisid X-kromosoomi pikal õlal Xq13.3–q27 munasarjade arenguks, 11 funktsiooniks ja säilumiseks n-ö kriitilise regiooni avastamiseni (Rizzolio et al., 2006). Peaaegu kõiki selles regioonis asuvaid terminaalseid deletsioone on seostatud primaarse amenorröaga ja munasarjade häirega. See piirkond on jagatud kahte funktsionaalselt erinevasse osasse: Xq13.3-q21.1, mis kannab nime POF-2, ja Xq21.3-q27, mis kannab nime POF-1. Tasakaalustatud translokatsioonide korral asub enamik murdepunkte POF-2 regioonis, kuid samas POF-1 regioonis (täpsemalt Xq25-26) olevate murdepunktidega patsientidel kaasneb sageli sekundaarne amenorröa (Jin et al., 2012). Munasarjade defekti põhjustavad mehhanismid võivad sõltuda kriitilise regiooni Xq suurusest, millega piirnevates geenides toimunud ümberkorraldused võivad põhjustada positsiooni efekti või otsest lookuse katkestust. Positsiooni efekt on mehhanism, mille puhul deleteerub või translokeerub regulatoorne domään genoomi teise piirkonda, mis võib endaga kaasa tuua muutusi geenide transkriptsioonis (Persani et al., 2010). On välja pakutud hüpotees, et aktiivse X-kromosoomi epigeneetilised ümberkorraldused võivad põhjustada positsiooni efekti autosomaalsete geenide promootoritele tasakaalustatud translokatsioonide kaudu (Persani et al., 2010). Rizzolio jt näitasid, et Xq13-q21 heterokromatiini ümberkorraldused surusid alla munasarjas ekspresseeritud geene folliikulite ja munaraku arengu ajal, viidates X-liitelise POI epigeneetiliste põhjuste võimalikkusele (Rizzolio et al., 2009). On välja pakutud idee, et mõned translokatsioonid rikuvad X- kromosoomi struktuuri, tuues kaasa defektse meiootilise paardumise ja idurakkude kiirendatud apoptoosi meioosi kontrollpunktides, mis võib viia POI tekkele (Persani et al., 2010). 1.2.2 POI-ga seotud geenid X-kromosoomil 1.2.2.1 FMR1 geen Fragiilse X-i vaimse arengu mahajäämuse geen 1 (The Fragile X mental retardation 1 gene; FMR1) asub Xq27.3 (Goswami and Conway, 2005). FMR1 mutatsioon võib tekitada polümorfse CGG-korduste arvu suurenemise 5’ mittetransleeritavas alas. See korduste ala võib muutuda ebastabiilseks pikkuse suurenemisel põlvkonnast põlvkonda. Vastavalt korduste arvule jagatakse alleelid 4 klassi: normaalne (26-34 kordust), keskmine (35-54 kordust), premutatsioon (55-199 kordust) ja täismutatsioon (üle 200 korduse) (Gleicher et al., 2012). Täismutatsiooni korral geen vaigistatakse metüleerides, mis toob kaasa FMR valgu (FMR 12 protein; FMRP) ekspressiooni puudumise ja intellektipuude kujunemise. FMR1 geeni premutatsioon, eriti u 80-99 kordust, on kõige sagedasem spontaanse 46,XX POI geneetiline põhjus. Kujunevat POI-d nimetatakse fragiilse X-i seoseline primaarne munasarja puudulikkus (fragile X-related primary ovarian insufficiency; FXPOI). Premutatsiooniga alleele ei metüleerita ja neilt suureneb FMR1 transkriptsioon, kuid väheneb FMRP tase. Premutatsioon esineb u 7%-l sporaadilise POI ja u 21%-l perekondliku POI-ga juhtumil, see on märgatavalt suurem arv, võrreldes üldpopulatsiooniga. Premutatsiooniga naistel täheldatakse sageli munasarjade funktsiooni vähenemist erinevas raskusastmes sõltuvalt CGG-korduste arvust ja keskkonnafaktoritest. Täismutatsiooni ei seostata POI-ga. Suurenenud korduste arv võib mängida rolli POI patogeneesis mRNA transkripti taseme tõusu kaudu. Hetkel töötatakse välja FMR1 premutatsiooni detekteerimisvõimaluse kasutamist rutiinse biomarkerina, mille abil tuvastada potentsiaalseid POI patsiente (Jin et al., 2012). 1.2.2.2 BMP-15 Luu morfogeneesi valk 15 (bone morphogenetic protein 15; BMP-15) ja kasvu diferentseerumise faktor 9 (growth differentiation factor 9; GDF-9) on pea kõigi folliikulogeneesi etappide ajal folliikulites esinevad kasvufaktorid. Nad jagavad kattuvat primaarstruktuuri ja aegruumilist ekspressioonimustrit munasarjas. Nende kahe valgu rollid folliikulite kasvus ja arengus võivad olla kooperatiivsed, kuid nad omavad liigile omaseid granuloosaraku vastuseid. GDF-9 asub autosoomil 5q31.1 alas, kuid BMP-15 geen jääb X- kromosoomi väikse õla POI kriitilisse regiooni Xp11.2 (Jin et al., 2012). BMP-15 on ootsüüdispetsiifiline kasvu- ja diferentsioonifaktor, mis stimuleerib follikulogeneesi ja granuloosarakkude kasvu. On näidatud, et BMP-15 knock-out isastel hiirtel esineb normaalne viljakus, kuid emaste viljakus on langenud ning väiksem on ka pesakonna suurus (Jin et al., 2012; Yan et al., 2001). Esimene POI-ga seotud BMP-15 mutatsioon avastati kahel õel, kel oli normaalne karüotüüp, kuid esines hüpergonadotroopne munasarjade puudulikkus munasarjade düsgeneesi tõttu. See mutatsioon oli A-G transitsioon BMP-15 geeni 704. aluspaaril, mis tekitas mittekonserveerunud asenduse p.Y235C (joonis 2). Tegu oli heterosügootse dominantnegatiivse mutatsiooniga, mille tütred pärisid tervelt isalt. Antud mutatsioon põhjustas valgu valet protsessimist, mistõttu mutantne BMP-15 antagoniseeris metsiktüüpi 13 valgu stimulatoorset aktiivsust ja selle kaudu vähendas granuloosarakkude proliferatsiooni (Di Pasquale et al., 2004). Hiljem on leitud mitu uut mutatsiooni BMP-15 geenis USA, Euroopa, Põhja-Aafrika, India, Hiina ja Aasia POI patsientide hulgas (joonis 2). Peaaegu kõigi puhul oli tegu heterosügootsete missense mutatsioonidega. Need asusid BMP-15 valgu proregiooni kodeerivas geeni järjestuses, mis on oluline valgu protsessimises ja bioaktiivsete dimeeride sekretsioonis. Antud missense mutatsioonidega rekombinantseid produkte uuriti ja leiti, et mutatsioonidega vektorid tootsid muutunud hulgal BMP-15 valmis valku võrreldes metsiktüübiga, viidates valgu kahjustunud protsessimisele. Kasutades BMP tundlikku lutsiferaasi reporteranalüüsi inimese granuloosarakkude liinil, näidati nende mutatsioonidega kaasnevat märkimisväärset bioloogilise efekti vähenemist. Defektsete mutantide ja võrdsel hulgal metsiktüüpi BMP-15 cDNA-ga läbi viidud kotransfektsiooni katsega ei suudetud täiesti taastada normaalset transkriptsioonilist aktiivsust. Kuna ka Western-blot analüüsil tuvastati, et bioaktiivse valgu tootmine on vähenenud, siis arvati, et antud heterosügootsed missense mutatsioonid võivad põhjustada BMP-15 geeni haplopuudulikkust. Kõigi leitud mutatsioonide hulgas põhjustas üks (p.E211X) enneaegset stoppkoodonit proregioonis, mis tõi kaasa valmis BMP-15 valgu täieliku puudumise (Persani et al., 2010; Rossetti et al., 2009). Esimene valmis valku kodeerivas BMP-15 regioonis leitud missense asendus (p.R329C) võib kahjustada valgu õiget voltumist ja muuta seeläbi BMP-15 valgu struktuuri, kuid selle tõestuseks on vaja teha lisakatseid (Wang et al., 2010). Erinevate lambatõugude uurimisel on avastatud BMP-15 geenis mitmeid punktmutatsioone, mis võivad mõjutada ovulatsiooni varieeruvust. BMP-15 ja/või GDF-9 eellasvalkude häiritud posttranslatsiooniline protsessimine vähendab valmis valkude hulka ja seda seostatakse suurenenud ovulatsiooni ning pesakonna hulgaga. Seetõttu, need mutatsioonid võivad naistel reproduktiivea teatud varajases faasis enne POI diagnoosi põhjustada kiirenenud ovulatsiooni ja viljakust, suurendades disügootsete kaksikute võimalikkust, kuid samas hilisemas eas põhjustada POI-d enneaegse munasarjade reservi vähenemise tõttu (Inagaki and Shimasaki, 2010; Jin et al., 2012) 14 Joonis 2. POI patsientidel tuvastatud BMP-15 geeni variandid (Persani et al., 2010). Eri värvi kastid näitavad võimalikke variantidega seotud bioloogilisi mehhanisme, mida Di Pasquale ja Rossetti töörühmad in vitro testisid (Di Pasquale et al., 2004; Rossetti et al., 2009). Kahel ilma ümbritseva kastita variandil ei tuvastatud funktsionaalset defekti ja neid peaks arvatavasti pidama missense mutatsioonideks puuduva või mõõduka bioloogilise efektiga. Esimese valmis valgus leitud mutatsiooni bioloogiline mõju on hetkel teadmata. 1.2.2.3 Teised potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid X-kromosoomil Potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid X-kromosoomi pikal õlal on a) Diaphanous homoloog 2 (DIAPH2), mida on seostatud tsütoskeletiga ja osalusega oogeneesis; b) Dachshund homoloog 2 (DACH2); c) POF1B, mis asub POF-2 distaalosas Xq21 ja mida seostatakse rakujagunemisel olulist rolli omava mittelihaselise müosiiniga; d) X-inaktiveeriv geen (XIST), mis asub Xq13 ja mida seostatakse munasarjade arenguks oluliste geenide haplopuudulikkusega; e) X-propüülaminopeptidaas 2 (XPNPEP2), mis asub kriitilises regioonis Xq25; f) FSH primaarse vastuse homoloog 1 (FSHPRH1), mis asub Xq22 ja mida ekspresseeritakse arnevas munasarjas (Jin et al., 2012). 15 1.2.3 POI-ga seotud geenid autosoomidel 1.2.3.1 GDF-9 GDF-9 on ootsüütide poolt sekreteeritav kasvufaktor, mis mõjutab ootsüütide, granuloosa- ja teekarakkude diferentseerumist. GDF-9 geen asub 5.kromosoomil (5q31.1). On näidatud, et GDF-9 knock-out hiirtel isaste fertiilsus ei ole häiritud, samas emased on viljatud (Dong et al., 1996). Neil emastel hiirtel olid palju väiksemad munasarjad võrreldes metsiktüübiga, kuna arvatavasti olid neil granuloosarakud kaotanud oma mitootilise võime ja folliikulite kasv oli blokeeritud primaarses ühe kihi folliikuli staadiumis (Otsuka et al., 2011). GDF-9 geeni kodeerivas regioonis on lammastel avastatud mitmeid ühenukleotiidseid polümorfisme (single-nucleotide polymorphism; SNP), millest p.S77F ja p.S109R homosügootseid variante seostatakse emaste lammaste steriilsusega (Hanrahan et al., 2004; Nicol et al., 2009). Palmer jt leidisd 6 uut GDF-9 varianti disügootsete kaksikute emadel. GDF-9 geeni variandid olid palju rohkem levinud disügootsete kaksikute emade kui kontrollrühma seas, viidates GDF-9 variantide seosele polüovulatsiooniga. Samuti on leitud seost POI ja kaksikute saamise vahel. Nimelt, on leitud, et disügootsete kaksikute emadel saabub menopaus palju varem kui monosügootsete kaksikute emadel (Palmer et al., 2006). 1.2.3.2 FOXL2 Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus sündroom (BPES) on autosomaaldominantne haigus, mida põhjustab FOXL2 geeni mutatsioon. BPES-i iseloomustatakse silmalau kompleksse väärarenguga. Sõltuvalt POI esinemisest jagatakse BPES-i kaheks. Esimest tüüpi BPES-iga kaasneb POI. FOXL2 geen paikneb 3q22-23 (Goswami and Conway, 2005). Pisarska jt näitasid, et FOXL2 on koekspresseeritud LATS1-ga hiire munasarja väikeste ja keskmiste folliikulite granuloosarakkudes. LATS1 fosforüleerib FOXL2 seriinijääkidel ja toetab selle kaudu FOXL2 represeerivat aktiivsust StAR promootorile, mis osaleb granuloosarakkude diferentseerumises. Mutantne FOXL2 või tema ebaõige reguleerimine LATS1 poolt võib kaasa tuua valel tasemel granuloosarakkude diferentseerumise ja folliikulite maturatsiooni, mis võib olla POI põhjuseks (Pisarska et al., 2010). 16 1.2.3.3 Folliikuleid stimuleeriv hormoon ja luteiniseeriv hormoon FSH ja luteiniseeriva hormooni (LH) rada hüpotalamuse-hüpofüüsi-munasarja telje osana on kesksel kohal munasarjade normaalses funktsioonis. FSH-β asub 11p13 ja selle geeni mutatsiooni on täheldatud kahel primaarse amenorröaga naisel (Matthews et al., 1993). FSH- retseptor (FSHR) on ülioluline munasarja folliikulite värbamises ja nende küpsemises. FSHR geen asub 2p21-p16. C566T (p.Ala189Val) missense mutatsioon leiti mitme Soome pere primaarse või sekundaarse amenorröaga 46,XX naisel, kuid samas see mutatsioon näib olevat haruldane mujal (Aittomaki et al., 1995). Kuuel POI patsiendil on avastatud üheksa erinevat nn funktsiooni kaotavat mutatsiooni ja samuti on leitud FSHR mutatsioone, mida on seostatud resistantse munasarja sündroomiga (Bachelot et al., 2009; Goswami and Conway, 2005). POI-ga naistel on leitud sagedamini LH-β subühiku variante kui kontrollrühmal ning LH-β homosügootne mutatsioon leiti sekundaarse amenorröaga naisel ja tema kahel hüpogonadismiga vennal (Lofrano-Porto et al., 2007). LH-retseptor (LHR) on oluline folliikulite ovulatsiooniks. LHR geen asub 2p21, mis on FSHR lookuse lähedal (Simpson, 2008). LHR mutatsioonid võivad põhjustada 46,XX naistel gonaadide degenereerumist või POI-d. Latronico jt uurisid 46,XY väliste naissuguorganitega pseudohermafrodiidi ja tema viljatu ning ebraregulaarse menstruatsiooniga õe DNA-d. Neil esines gonaadide LH resistentsus, mille põhjuseks võis olla mõlemal LHR geenis leidunud deletsioon, mis viis Leu- 608 ja Val-609 deleteerumiseni. Selle tulemusena oli suurem osa mutantsest retseptorist intratsellulaarselt säilinud. See väike osa mutantsest retseptorist, mida ekspresseeriti rakupinnale, sidus hormoone normaalselt, kuid oli võimetu aktiveerima endaga seotud G- valku (Latronico et al., 1998). 1.2.3.4 Inhibiin Inhibiinil on kahekordne mõju FSH sekretsioonile hüpofüüsi ja gametogeneesi kaudu. On leitud tugev seos POI ja inhibiin-α subühiku geeni (INHA) variantide vahel, nagu näiteks G769A missense mutatsiooni esinemine India ja Uus-Meremaa naispopulatsioonis. INHA G769A mutatsiooni esinemissagedus on 0-11% erinevates populatsioonides. See mutatsioon toob kaasa normaalse dimeerse inhibiin A ja B tootmise, kuid põhjustab inhibiin B häiritud bioaktiivsust, mis võib olla seotud POI kujunemisega (Chand et al., 2010; Goswami and Conway, 2005). Madalat seerumi inhibiin B taset on seostatud reproduktiivse vananemise, 17 väheneva munarakkude reservi ja POI-ga. Arvatakse, et kui preantraalsete folliikulite arv väheneb teatud piirini, siis kaasneb sellega inhibiin B taseme langus, mis toob kaasa monotroopse FSH taseme tõusu, mis omakorda kiirendab folliikulite vähenemist ja menopausi saabumist (Petraglia et al., 1998; Soules et al., 1998). 1.2.3.5 Teised potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid autosoomidel Tabel 1 võtab kokku teised võimalikud POI tekkega seotud geenid naistel. Nende geenide kasutamiseks POI geneetilises diagnostikas on vaja läbi viia aga lisauuringud. Tabel 1 Potentsiaalsed POI tekkega seotud geenid ja nende kromosomaalsed asukohad 1 (Jin et al., 2012 järgi, http://www.omim.org/ ). Geeni nimi Asukoht kromosoomil Fragiilse X-i vaimse arengu mahajäämuse geen 2 (FMR2) Xq28 Vastsündinu munasarja homeobox geen (NOBOX) 7q35 Faktor iduliinis-α (FIGLα) 2p13.3 Forkhead box O3 (FOXO3) 6q21 Östrogeeni retseptor 1 geen (ESR1) 6q25.1 Östrogeeni retseptor 2 geen (ESR2) 14q23.2-q23.3 Tuuma retseptori alaperekond 5 (NR5A1/SF1) 9q33.3 Eukarüootne initsiatsiooni faktor 2B2, 4 ja 5 (EIF2B2, EIF4 ja 14q24.3, 2p23.3, 3q27 EIF5) NOG geen 17q22 17-hüdroksülaas (CYP-17) 10q24.32 Wilmsi kasvaja supressorgeen-1 (WT1) 11p13 Ataxia telangiectasia mutated (ATM) 11q22.3 Mitokondriaalse DNA polümeraas-γ geen (POLG) 15q25 Konneksiin 37 (CX37) 1p34.3 CYP-19 15q21.2 G-valk seoseline retseptor 3 (GPR3) 1p36.11 LIM homeobox geen 8 (LHX8) 1p31.1 NANOS3 19p13.13 18 1.2.3.6 Ülegenoomsed uuringud Schuh-Huerta jt viisid läbi ülegenoomse uuringu munasarjade reservi kohta 25-45.aastaste regulaarse menstruatsiooniga ja reproduktiivselt normaalsete naiste seas. Uuringus osales 232 Euroopa päritolu ja 200 Afro-Ameerika naist, olles seega suurim teadustöö selles vallas. Teadlased analüüsisid üle genoomi FSH ja AMH-ga seotud geneetilisi variante ja avastasid mitu olulist SNP-d müeloid seotud diferentseerumismarkerilaadse (myeloid-associated differentiation marker-like; MYADML) geeni seest ja lähedalt. Neid variante seostati FSH tasemetega. Samuti leidsid nad mitu AMH ja FSH-ga seotud varianti samas genoomses regioonis 12p13.1-p13.2 ja 13q12.13, mis võib olla oluline piirkond munasarjade reservi mõjutavate alleelide jaoks. Ükski variant ei olnud ühegi teadaoleva munasarjadega seotud geeni sees või läheduses, seega uurimus pakkus välja häid kandidaatgeene POI geneetiliste põhjuste väljaselgitamiseks (Schuh-Huerta et al., 2012). 1.3 Metaboolsed haigused POI tekkepõhjusena – galaktoseemia Klassikaline galaktoseemia on kaasasündinud autosoomretsessiivselt päranduv ainevahetushaigus, mis on põhjustatud 9. kromosoomis (9p13.3) paikneva galaktoos-1- fosfaaturidüültransferaasi (GALT) geeni defektist ja sellest tuleneva GALT-valgu puudulikkusest. Tõsisemad fenotüübid võivad põhjustada surmavat toksilist sündroomi ning kognitiivseid ja motoorseid häireid. 17-67% galaktoseemiat põdevatest naistest esineb POI ja uuringud näitavad, et klassikaline galaktoseemia põhjustab eri inimestel eri tasemel munasarjade häireid, kuid pea kõigil GALT geeni homosügootse mutatsiooniga naistel kujuneb POI varem või hiljem nende elus. FSH tase hakkab klassikalist galaktoseemiat põdevatel tüdrukutel sageli tõusma väga noores eas 4-kuuselt kuni 4-aastaselt. On näidatud, et vastsündinu munasarjad on normaalse morfoloogia ja follikulogeneesiga, kuid noortel naistel on primordiaalsete folliikulite arv suuresti vähenenud ja neil puuduvad küpsed folliikulid (Jin et al., 2012; Rubio-Gozalbo et al., 2010). Folliikulite arenguhäire mehhanismid ja ajastus on endiselt ebaselge. On välja pakutud, et galaktoosi ja tema toksiliste metaboliitide kuhjumine peale sündi (kuna loote toksilised metaboliidid peaksid olema kiiresti eemaldatud ema ensüümide poolt) tekitab munasarjadele otsesi kahjustusi. Samuti kaasneb sellega glükoproteiinide ja –lipiidide hüpoglükosüleerimine, 19 oksüdatiivne stress ja apoptoosi aktiveerumine, mis omakorda võivad põhjustada FSH valetalitlust. Valet FSH glükosüleerimist on peetud põhiliseks POI tekkepõhjuseks galaktoseemiaga naistel. Gubbels jt võrdlesid FSH isovormide mustreid viie loomuliku menoupausijärgse naise, viie galaktoseemiat põdeva ja ühe primaarse glükosüleerimisshäirega patsiendi vahel ning leidsid, et hüpoglükosülatsioonist tingitud vähemhappelised seerumi FSH isovormid ei ole märkimisväärselt seotud POI kujunemisega. Samuti võivad põhjuseks olla autoimmuunsusmehhanismid, kuid ühtegi antikeha ei ole siiani leitud (Forges et al., 2006; Goswami and Conway, 2005; Gubbels et al., 2011). 1.4 Autoimmuunhaigused POI tekkepõhjusena Uuring 357 POI patsiendiga näitas, et 14,3% haigusjuhtumitest on kliiniliselt või bioloogiliselt seotud autoimmuunsusega (Bachelot et al., 2009). Autoimmuunhaiguste esinemine POI põhjusena on teistes uuringutes hinnatud 10 kuni 55%-ni (Goswami and Conway, 2005). POI-d seostatakse mitmete autoimmuunhaiguste ja –sündroomidega, nagu Addisoni tõbi, polüglandulaarne autoimmuunsündroom, kuiva silma sündroom, myasthenia gravis, reumatoidartriit ja süsteemne erütematoosne luupus (Jin et al., 2012). Bakalov jt viisid läbi uuringu 266 spontaanse POI-ga 46,XX naise seas ja leidsid seose histoloogiliselt kinnitatud autoimmuunse munasarjapõletiku ja neerupealiste koore antikehade vahel. Umbes 4%-l spontaanse POI-ga patsientidest esineb steroide tootvate rakkude antigeenide vastast autoimmuunsust (Bakalov et al., 2005). Autoimmuunset munasarjapõletikku kirjeldatakse kui ühetuumsete rakkude selektiivset infiltratsiooni antraalfolliikuli teekarakkude kihti. Steroidrakkude autoimmuunsusest tulenev primaarne munasarjade puudulikkus (steroid cell autoimmunity primary ovarian insufficiency; SCA-POI) on põhjustatud teekarakkude hävimisest autoimmuunsüsteemi poolt, mis toob kaasa inhibiini kontsentratsiooni tõusu. Samas on täheldatud ⅔-l SCA-POI-ga naistest normaalset seerumi AMH taset, mis tähendab, et neil patsientidel säilub ka teatud hulga funktsioneerivaid folliikuleid (La Marca et al., 2010). Mitmed munasarja autoimmuunsusmehhanismid võivad põhjustada POI-d ja immunoloogilise tolerantsi häirumise võivad esile kutsuda nii geneetilised kui ka keskkonnafaktorid. Samas, munasarja antikehade patogeensuse tähtsus ja spetsiifilisus on siiski küsitav, seetõttu 20 autoimmuunsusest tingitud POI diagnoosimine on endiselt raske ülesanne. Võimalikud autoimmuunkahjustusi põhjustavad munasarjadega mitteseotud antikehad POI kujunemises on steroide tootvate rakkude, zona pellucida 3. epitoobi ja 3β-hüdroksüsteroiddehüdrogenaasi (3β-HSD) autoantikehad ning antitüroid-, antiparatüroid-, FSHR ja LHR vastased antikehad (Bakalov et al., 2005; Goswami and Conway, 2005). 1.5 Iatrogeensed POI tekkepõhjused Potentsiaalsed elupäästvad ravimeetodid, nagu kemo- ja radioteraapia, on väga mitmete POI juhtumite põhjuseks. Kemo- ja radioteraapia efekt sõltub ravimitüübist, radiatsioonivälja asukohast, doosist ja patsiendi vanusest (Goswami and Conway, 2005). Alküüliv ühend tsüklofosfamiid (cyclophosphamide; CYC) on rakutsükli mittespetsiifiline ravim, mis on tsütotoksiline isegi mitteaktiivsetele rakkudele ja seega ka gonadotoksiline, tuues kaasa kuni 40%-lise POI riski reproduktiivses eas naiste seas (Clowse et al., 2009). Alküleerivate ühendite, antimetaboliitide, antratsükliliste antibiootikumide, vinka-alkaloidide või prednisolooni ravi läbinud patsientide munasarjade histoloogilised uuringud näitasid kortikaalset fibroosi, veresoonte kahjustusi ja vähenenud folliikulite arvu. Vähivastased ravimid peatavad sageli olulisi rakuprotsesse, peatavad rakkude proliferatsiooni ja seetõttu kahjustavad munasarjade stroomat ja folliikuleid. Kemoteraapia kahjustab kõige rohkem küpseid munasarja folliikuleid ravi ajal, indutseerides apoptoosi granuloosarakkudes. Kuid kahju suuruse väljaselgitamiseks primordiaalsetele ja n-ö puhkavatele folliikulitele on vaja teha veel lisauuringuid (Jin et al., 2012). Kuigi mõnede teadlaste arvates 65-70% POI juhtumitest on ümberpöörduvad pärast ravimite võtmise lõpetamist, siis pikaajalised viljakuse kahjustused on endiselt probleemiks. 26%-l keskmiselt 3,45-aastaselt kogu kõhule kiiritust saanud patsientidest kujunes ca 23,5-aastaselt välja POI. Olgugi, et nähakse palju vaeva kaitsmaks gonaade kiirituse eest vähiravi ajal, siis on ikkagi keeruline säilitada munasarjade funktsiooni puutumatuna. Isegi kraniaalne kiiritus võib mõjutada ovulatsiooni ja viljakust, häirides hüpotalamuse-hüpofüüsi-munasarja telge. Otsene kiiritus kahjustab munasarju sarnaselt kermoteraapiale, tuues kaasa folliikulite suurenenud aktivatsiooni ja põhjustades kiirendatud atreesiat (Jin et al., 2012). 21 Operatsioonid, eriti vaagnapiirkonnas, nagu hüsterektoomia, võivad samuti põhjustada POI-d, mõjutades munasarjade verevarustust või põhjustades lokaalseid põletikke (Amato and Roberts, 2001). 1.6 Viirushaigused POI tekkepõhjusena Mitmeid mumpsi ja munasarjade põletiku juhtumeid on peetud võimalikeks POI põhjusteks (Morrison et al., 1975). Ühendriikide multikeskuse uuring 1139 HIV seropositiivse ja 292 seronegatiivse naise kohta näitas, et HIV seropositiivsetel naistel oli kolm korda suurem tõenäosus läbi elada pikenenud amenorröad (vähemalt 1 aasta) kui HIV seronegatiivsetel (Cejtin et al., 2006). Pilootuuring Prantsusmaal mõõtis 78 HIV seropositiivse naise munasarjade funktsiooni, kasutades markereid, nagu antraalfolliikulite arv (antral follicle count; AFC), FSH, inhibiin B ja AMH. Kõik need neli markerit olid ebanormaalselt kõrgete väärtustega. Need tulemused näitasid, et HIV infektsioon või kaasnev antiretroviirusteraapia võivad kahjustada munasarjade funktsiooni ja viljakust ning tuua kaasa POI väljakujunemise (Ohl et al., 2010). 1.7 Toksiinid ja muud keskkonna ning elustiili faktorid POI tekkepõhjusena 4-vinüültsüklohekseen diepoksiid (4-vinylcyclohexene diepoxide; VCD) on munasarjadele toksiline kemikaal, mida tekib näiteks autorehvide tootmisel. VCD korduvad doosid võivad kiirendada atreesia apoptootilisi protsesse ja selektiivselt hävitada rottide ja hiirte primordiaalseid ja primaarseid folliikuleid. Molekulaarsed uuringud, kus kasutati vastsündinud roti terveid munasarju, näitasid, et VCD interakteerub spetsiifiliselt ja inhibeerib raku kasvuga seotud kriitilise signalisatsiooniraja võtmemolekulide c-kit retseptorite autofosforülatsiooni ja seega häirib normaalset ootsüüdi kasvu. Seega, VCD-ga kokkupuutuvaid naisi peetakse POI tekke riskigruppi (Kappeler and Hoyer, 2012). Suitsetamine võib kahjustada naise viljakust ja loodet raseduse ajal ning põhjustada enneaegset menopausi ja tõsta idiopaatilise POI tekkimise riski. Mõned uuringud väidavad, et 22 suitsetamine on seotud kõrgenenud FSH tasemega ja teatud muudatustega AFC või AMH tasemetes, aga uuringud ja valideerimised suurema uurimisrühma peal on vajalikud (Jin et al., 2012). Tubaka toksiinid võivad mõjutada munasarjade reservi, kiirendades follikulaarset atroofiat ehk mahu vähenemist ja atreesiat läbi suurenenud apoptoosi primordiaalsetes idurakkudes (Schuh-Huerta et al., 2012). Näiteks polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud, mis on tubaka toksilised kemikaalid, mõjutavad aromaatse süsivesinikretseptori (aromatic hydrocarbon receptor; Ahr) kaudu Bax geeni ekspressiooni ootsüütides, millele järgneb apoptoos. Ahr-st sõltuv Bax geeni transkriptsioon on evolutsiooniliselt konserveerunud rakusurma signalisatsioonirada, mis põhjustab keskkonna mürkidest tulenevat munasarjade võimetust (Matikainen et al., 2001). Sharara jt tõdesid kokkuvõtvalt oma artiklis, et keskkonna mürgid, nende seas endokriinsüsteemi kahjustajad, raskemetallid, lahustid, pestitsiidid, plastikud, tööstuskemikaalid ja tubakasuits, on seotud munasarjade võimetuse, reproduktiivsushäirete ja järglaste sünnidefektidega loomade seas, ent nende mürkide toimemehhanisme pole piisavalt kirjeldatud. Samuti leidsid nad vastuolulisi tulemusi inimeste seas nende mürkide kohta (Sharara et al., 1998). Klein jt kirjutasid, et epilepsiat põdevad naised omavad suuremat riski POI kujunemises kui üldpopulatsioon (Klein et al., 2001). Samuti on eluaegset ebaregulaarset menstruaalmustrit ja lastetust peetud POI riskifaktoriks (Testa et al., 2001). 23 2 EKSPERIMENTAALNE OSA Töö eesmärk Minu magistritöö eesmärk oli kromosomaalse mikrokiibianalüüsi abil tuvastada primaarse munasarjade puudulikkuse diagnoosiga patsientidel haigusseoselisi koopiaarvu variatsioone (copy number variations; CNVs) ning vastavates piirkondades esinevaid POI seoselisi kandidaatgeene. 24 2.1 Materjal ja metoodika 2.1.1 Uuritud patsientide fenotüübid Käesolevas uuringus osales 21 primaarse munasarjade puudulikkuse diagnoosiga patsienti, kellel täpne haiguspõhjus on teadmata. Patsiendid pärinesid SA Tartu Ülikooli Kliinikumi naistekliiniku ja Reproduktiivmeditsiini TAK AS poolt koostöös kogutud primaarse munasarjade puudulikkusega patsientide hulgast. Uuuritud patsientide fenotüübid on kokkuvõtlikult toodud tabelis 2. Tabel 2. Uuritud patsientide fenotüübid. Patsiendi kood Vanus BMI Amenorröa FSH (IU/L) B1204 31 19.3 sec 31.1 B1209 19 22.6 sec N/A B1221 34 22 sec 88.6 B1228 41 21.1 sec 125 B1229 37 32.8 sec 57.8 B1230 39 26.2 sec 52 B1231 36 22.9 sec 98 B1232 33 19.3 sec 7.47 B1233 32 19.8 sec 80.4 B1234 34 20 sec 55.7 B1235 33 20.6 sec 33.7 B1236 35 25.2 sec 55.7 B1237 42 22.7 sec 42.7 B1238 30 N/A N/A N/A B1239 31 29.1 sec 29.4 B1240 36 20.9 sec 60.4 B1241 29 22.9 sec 75.4 POF2 41 24.7 sec 89.6 POF20 N/A N/A N/A N/A POF21 N/A N/A N/A N/A POF22 N/A N/A N/A N/A BMI – kehamassiindeks (body mass index); sec – sekundaarne amenorröa 25 2.1.2 Mikrokiibianalüüs CNV-de detekteerimiseks POI patsientidel teostati ülegenoomne SNP genotüpiseerimine Illumina HumanCytoSNP-12 mikrokiibi (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) tehnoloogiat kasutades. Genotüpiseerimise protseduur toimus, järgides tootjafirma poolt välja töötatud standardprotokolle ja kasutades tootja poolt valmistatud reaktiivide komplekte. Antud analüüside eksperimentaalne osa viidi läbi Eesti Biokeskuse Genotüpiseerimise Tuumiklaboris töötavate spetsialistide poolt. HumanCytoSNP-12 BeadChip-il paiknevad SNP proovid katavad kogu inimese genoomi keskmiselt 10 kb suuruste vahedega, võimaldades seeläbi ca 100 kb-st efektiivset lahutusvõimet (see on 10 järjestikust markerit). Antud mikrokiibil on ca 220.000 tsütogeneetiliseks analüüsiks vajalikku ülegenoomset SNP markerit ning lisaks sellele pea 250-le igapäevaselt tsütogeneetikalaboris kontrollitavale genoomsele regioonile spetsiifilised proovid, mille hulgas on subtelomeersed ja peritsentromeersed regioonid, sugukromosoomid ja lisaks ligi 400 haigusseoselist geeni 2 (http://www.illumina.com/products/humancytosnp_12_dna_analysis_beadchip_kits.ilmn) . 2.1.2.1 Genotüpiseerimistulemuste analüüs Genotüpiseerimistulemusi analüüsiti programmidega GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.) ja QuantiSNP versioon 2.3 Beta (Colella et al., 2007). GenomeStudio programm kasutab saadud tulemuste analüüsimiseks kahte parameetrit: signaalide intensiivsuste logaritmiline suhe (log R ratio; LRR) ja alleelide intensiivsuste suhe (B allele frequency; BAF). QuantiSNP genotüpiseerimisandmete analüüsiprogramm põhineb peidetud Markovi mudelil (Hidden Markov model; HMM). HMM on statistiline meetod, mis modelleerib andmeid lähtuvalt Markovi protsessist, kus iga kindla väärtuse esinemise tõenäosus teatud ajahetkel sõltub ainult eelmistel ajahetkedel esinenud väärtustest (Wang et al., 2008). QuantiSNP algoritmi puhul loetakse HMM-i protsessis koopiaarv igas uuritud SNP-s peidetud väärtuseks, mida avaldakse genotüpiseerimiskiipide andmete põhjal, mis koosnevad iga SNP puhul kahest komponendist: LogR väärtusest, mis näitab SNP proovi summaarset fluoressentssignaali intensiivsust, ja B-alleeli sagedusest, mis näitab ühe SNP alleeli signaaliintensiivsuse osakaalu teise alleeli suhtes (Colella et al., 2007). 26 QuantiSNP kasutab SNP markerite summaarseid signaali intensiivsusi koos SNP alleelide osaintensiivsustega ja võimaldab statistilise võimsuse suurendamiseks korraga analüüsida mitme mikrokiibi andmeid. QuantiSNP kasutab Log Bayes faktorit usaldusväärsuse hindamiseks (confidence score) iga identifitseeritud regiooni jaoks. Mida suurem on Log Bayes faktori väärtus, seda tugevam on tõestus CNV olemasolu kohta antud regioonis (Colella et al., 2007). Selles töös kasutati Log Bayes faktori väärtust 10, mis tähendab, et 10% tuvastatud aberratsioonidest on valepositiivsed. Suuremate väärtuste kasutamine võib viia valenegatiivsete tulemuste arvu suurenemisele. Kõiki leitud CNV-sid võrreldi genoomsete ümberkorralduste variantide andmebaasis (Database of Genomic Variants; DGV) 3 (http://projects.tcag.ca/variation/) olevate CNV-dega sorteerimaks välja neutraalsed CNV-d ning samuti DECIPHER-i (Database of Chromosomal Imbalances and Phenotype in Humans 4 using Ensembl Resources) andmebaasis (http://decipher.sanger.ac.uk/) olevate CNV-dega leidmaks haigusseoselisi variante. Samuti, võrreldi olulisemaid tuvastatud CNV-sid Eesti Geenivaramu 1000 üldpopulatsiooni indiviidi CNV-de andmete ja sagedustega (Nelis et al., 2009). 2.1.3 Tulemuste kinnitamine reaalaja kvantitatiivsel PCR meetodil Illumina kogu genoomi genotüpiseerimiskiipide abil leitud olulisemad aberratsioonid kinnitati sõltumatul reaalaja kvantitatiivsel polümeraasi ahelreaktsiooni (real-time quantitative polymerase chain reaction; RT-qPCR) meetodil. CNV-de valideerimiseks disainti praimerid vabavarana saadaval qRTDesigner versioon 1.2 programmi kasutades 5 (http://bioinfo.ut.ee/gwRTqPCR) ja telliti firmast metabion international AG (Martinsried, Saksamaa). Iga deletsiooni või duplikatsioon kinnitamiseks disainiti, kas 5 või 8 praimerpaari, vastavalt kaks või neli aberratsiooni sisse- ja kolm või neli väljapoole. Normaliseerimiseks kasutati kahte referentspraimerpaari. Praimerjärjestused on toodud lisas 1. Praimerite efektiivsused määrati, rakendades standardkõvera meetodit. Standardkõvera loomiseks kasutati lahjenduste rida (32 ng/µl – 0,03125 ng/µl, kokku kuus erinevat lahjendust) viielt tsütogeneetiliselt normaalse naise DNA segust. Andmed analüüsiti SDS 2.2.2. programmi abil (Applied Biosystems, Foster City, USA) ning efektiivsuse arvutamiseks (-1/slope) kasutati järgmist valemit: E = 10 . Edasises töös kasutati ainult praimereid, mille efektiivsused jäid 1,8 – 2,2 piiridesse. 27 Edasine DNA koopiaarvu hindamine toimus huvipakkuvates lookustes. Iga praimerpaariga teostati reaktsioonid, kasutades patsiendi DNA-d ning kontrollina viie tsütogeneetiliselt normaalse naise ja viie tsütogeneetiliselt normaalse mehe DNA segu. Normaalsete indiviidide DNA proove kasutati koopiaarvu arvutamisel kalibreerimiseks. 10 μl reaktsioonisegu sisaldas 2 µl 5x HOT FirePol EvaGreen qPCR Mix Plus’i (ROX) (Solis BioDyne, Tartu, Eesti); 1 µl forward + reverse praimereid kontsentratsiooniga 10 pmol/µl; 2,5 μl genoomse DNA lahust kontsentratsiooniga 1 ng/µl ning ddH2O lõppmahuni. Iga amplifitseerimisreaktsiooni teostati kolme kordusena. Amplifikatsioon viidi läbi ABI 9700 Real Time system (Applied Biosystems) masinal, o kasutades järgmist programmi: DNA polümeraasi aktiveerimine 95 C juures 15 min; 40 o o tsüklit: denaturatsioon 95 C juures 15 s, praimerite seondumine ja süntees 60 C juures 1 min. Esmane tulemuste analüüs toimus SDS 2.2.2. tarkvara abil, kus hinnati katse edukust ning + spetsiifilisust. Järgnevalt analüüsiti andmeid qbase arvutiprogrammiga (Biogazelle, Gent, Belgia), mis rakendab arvutamiseks delta-Ct meetodit (D'Haene et al., 2010). 2.1.4 LOH alades leitud POI-ga seotud geenide sekveneerimine 2.1.4.1 Polümeraasi ahelreaktsioon Heterosügootsuse kaotanud (loss of heterozygosity; LOH) alades leitud POI-ga seotud geenide kodeerivate järjestuste amplifitseerimiseks teostati vastavate praimeritega polümeraasi ahelreaktsioon (polymerase chain reaction; PCR). Amplifitseeriti kolme geeni BMP-15, DACH2 ja MutS homoloog 5 (MSH5) eksonid. PCR reaktsiooni jaoks kasutati BMP-15 geeni kahe eksoni, DACH2 geeni kümne eksoni ja MSH5 geeni teise eksoni spetsiifilisi praimereid. MSH5 geenil amplifitseeriti vaid teine ekson, sest sealt on varasemalt leitud POI-ga seotud mutatsioone ning teist eksonit peetakse mutatsioonide hotspotiks (Mandon-Pepin et al., 2008). Antud praimerid disainiti vabavarana saadaval Primer3web programmi versioon 4.0.0 6 kasutades (http://primer3.wi.mit.edu/) ja telliti firmast metabion international AG. Praimerite järjestused on toodud lisas 2. ® ® PCR-i läbiviimiseks kasutati FIREPol DNA Polymerase reagente FIREPol DNA polümeraas 5 u/μl, (Solis BioDyne); 10x puhver; 25mM MgCl2 (Thermo-Fischer Fermentas, Vilnius, Leedu) ja nukleotiidide segu dNTP Mix, 2mM (Thermo-Fischer Fermentas). Amplifitseerimiseks kasutati 50 ng DNA-d, kogu reaktsiooni ruumala oli 20 µl. 28 Amplifitseerimisel kasutati masinat PTC-200 Thermo Cycler (GMI Inc., USA) ning järgmist programmi: DNA algdenaturatsioon 95˚C juures 5 min; 35 tsüklit: denaturatsioon 95˚C juures 30 sek, praimerite seondumine 59˚C juures 1 min ja süntees 72˚C juures 45sek; lõppsüntees 72˚C juures 10 min. PCR produktide kvaliteeti kontrolliti 1,5% agaroosgeelil, kasutades markerit O’RangeRulerTM 50bp DNA Ladder (Thermo-Fischer Fermentas). 2.1.4.2 Sekveneerimine Mutatsioonide detekteerimiseks sekveneeriti BMP-15 geeni kõik kaks eksonit, DACH2 geeni kümme eksonit ja MSH5 geeni teine ekson ning nende lähedal asuvate intronite osad, kasutades samu praimereid, millega amplifitseeriti DNA. Puhastatud PCR produktid sekveneeriti mõlemas suunas, et kinnitada esinevaid nukleotiidseid muudatusi. Sekveneerimisreaktsioonid teostati ja produktid analüüsiti Eesti Biokeskuse Sekveneerimise Tuumiklaboris masinal 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems). 2.1.4.3 Andmete analüüs ® Järjestuste analüüsimiseks kasutati vabavarana saadaval Bioedit programmi versioon 7.2.0 7 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) . BMP-15, DACH2 ja MSH5 referentsjärjestusteks võeti vastava metsiktüüpi geeni eksonite DNA Ensembl Andmebaasist 8 (www.ensembl.org) . Lisaks võrreldi nii referentsgenoomi kui saadud järjestusi, kasutades ClustalW mitmekesist järjestuste joondamist, et vältida vigade esinemist 9 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) . 29 2.2 Tulemused 2.2.1 Genotüpiseerimistulemused 2.2.1.1 Koopiaarvu variatsioonid Uuringus osales 21 patsienti, kellel oli diagnoositud primaarne munasarjade puudulikkus, kuid haiguse täpne põhjus oli teadmatata. Kõigi patsientide DNA-d analüüsiti HumanCytoSNP-12 BeadChip tehnoloogia abil. Kliiniliselt oluliste CNV-de tuvastamiseks jäeti kõrvale alla 10 Log Bayes faktori väärtusega olevad CNV-d ning neutraalseks peeti 3 DGV andmebaasis esinenud ja POI-ga seotud geenide alas mittepaiknenud CNV-d. Keskmiselt leiti iga uuritud genoomi kohta viis CNV-d, kusjuures enamik neist osutusid neutraalseteks. Kliiniliselt oluliseks peeti nelja CNV-d. Kiibianalüüside olulisemad tulemused on esitatud kokkuvõtlikult tabelis 3. Samuti, võrreldi olulisemaid CNV-sid Eesti Geenivaramu 1000 üldpopulatsiooni indiviidi CNV-de andmete ja sagedustega (Nelis et al., 2009). Antud CNV-de sageduste võrdlus on toodud välja tabelis 4. Võimalikuks haigusseoseliseks CNV-ks peeti patsiendil POF2 esinenud 24,07 Mb suurust deletsiooni X-kromosoomil Xp22.33-p21.3 regioonis (lisa 3). Deleteerunud alas asub 89 ® 1 Inimese Pärilike Haiguste (Online Mendelian Inheritance in Man ; OMIM) andmebaasis refereeritud geeni, nende hulgas ka POI kandidaatgeen ZFX (X-linked zinc finger gene ; ZFX) ning potentsiaalne POI kujunemist mõjutav steroid sulfataasi geen (STS) (Goswami and Conway, 2005; Quilter et al., 2010). Patsiendil POF20 leiti oluline CNV 1q21.1-q21.2 regioonis (lisa 4). Tegu oli 1,35 Mb suuruse deletsiooniga. Antud lookuses esinevat deletsiooni on seostatud närvisüsteemi 10 arenguhäiretega (https://decipher.sanger.ac.uk/syndrome/62) . Leitud deleteerunud alas asub üheksa OMIM andmebaasis refereeritud geeni. Patsiendil B1237 avastati 78 kb suurune duplikatsioon 17q21.31 piirkonnas (lisa 5). Antud regioonis asub munasarja- ja rinnavähiga seotud rinnavähigeen 1 (breast cancer gene; BRCA1). BRCA1 geenis asuvaid mutatsioone on seostatud ka naiste varasema menopausi ja varjatud POI kujunemisega (Lin et al., 2013; Oktay et al., 2010). Patsiendil B1240 leiti võimalik POI seoseline CNV Xp22.31 regioonis (lisa 6). Tegu oli 1,2 Mb suuruse duplikatsiooniga. Antud alasse jääb neli OMIM andmebaasis refereeritud geeni, nende hulgas STS geen, mis võib mõjutada ootsüütide tootmist ja folliikulite küpsemist (Quilter et al., 2010). 30 Illumina kogu genoomi genotüpiseerimiskiipide abil leitud aberratsioonid on kinnitatud sõltumatul RT-qPCR meetodil, välja arvatud 24,07 Mb suurune deletsioon patsiendil POF2, mida on võimalik detekteerida karüotüübi analüüsil. Tabel 3. POI patsientidel mikrokiibi analüüsi käigus leitud olulisemad CNV-d. Patsient POF2 POF20 B1237 B1240 Kromosoom Xp22.33-p21.3 1q21.1-q21.2 17q21.31 Xp22.31 Algusposits. (bp) 2704609 146476526 41196363 6864358 Lõpp-posits. (bp) 26774900 147828939 41274789 8076813 Alg-SNP ID rs5939323 rs6656361 rs8176320 rs5979096 Lõpp-SNP ID rs5944594 rs3009465 rs8176085 rs5978816 Pikkus (Mb) 24,07 1,35 0,78 1,2 Koopiaarv 1 1 3 3 Olulised geenid ZFX ja STS BRCA1 STS 1 OMIM -is refereeritud 89 9 1 4 geenide arv Koopiaarv 1 puhul on tegu deletsiooniga ja koopiaarv 3 puhul on tegu duplikatsiooniga. Tabel 4. POI patsientidel tuvastatud CNV-de võrdlus Eesti Geenivaramu 1000 üldpopulatsiooni indiviidi CNV-de sagedustega (Nelis et al., 2009). Patsient Kromosoom Algus (bp) Lõpp (bp) Pikkus (Mb) Eesti 1000 POF2 Xp22.33-p21.3 2.704.609 26.774.900 24,07 X 6.468.166 8.095.053 1,6 0.008 X 22.728.031 22.788.784 0,06 0.001 POF20 1q21.1-q21.2 146.476.526 147.828.939 1,35 1 147.414.362 147.849.072 0,4 0.015 B1240 Xp22.31 6.864.358 8.076.813 1,2 X 6.468.166 8.095.053 1,6 0.008 B1237 17q21.31 41.196.363 41.274.789 0,78 N/A 31 2.2.1.2 Heterosügootsuse kaotanud alad Antud mikrokiibianalüüsi käigus tuvastati ka mitmeid heterosügootsuse kaotanud alasid. Oluliseks peeti LOH piirkondi, kus asus POI-seoselisi geene. Patsientidel leitud olulisemad LOH alad on esitatud kokkuvõtlikult tabelis 5. Patsiendil POF20 leiti 13,24 Mb suurune LOH ala piirkonnas Xp11.23-p11.1, kus esineb BMP-15 geen. Sama patsiendi X-kromosoomi pikas õlas tuvastati ka 29 Mb pikkune LOH ala Xq12-q21.31 piirkonnas, kus asub POI-seoseline DACH2 geen (lisa 7). Oluliseks leiuks peeti ka patsiendil B1235 esinenud 6,6 Mb suurust LOH ala 6p22.2-p22.32 piirkonnas, kus asub võimalik POI kujunemist mõjutav geen MSH5 (lisa 8). Tabel 5. POI patsientidel mikrokiibi analüüsi käigus leitud LOH alad. Patsient POF20 POF20 B1235 Kromosoom Xp11.23-p11.1 Xq12-q21.31 6p22.2-p22.32 Alguspositsioon (bp) 45089619 62150601 26354572 Lõpp-positsioon (bp) 58339545 91158935 32943151 Alg-SNP ID rs12012827 rs12690363 rs9461245 Lõpp-SNP ID rs2942875 rs5942091 rs635688 Pikkus (Mb) 13,2 29 6,6 Koopiaarv 2 2 2 Olulised geenid BMP-15 DACH2 MSH5 1 OMIM -is refereeritud 137 79 156 geenide arv 2.2.2 Sekveneerimistulemused Mikrokiibi analüüsil tuvastatud LOH alades leidus kolm POI kujunemisega seotud geeni. Eelnevate uuringute käigus on näidatud, et LOH alades paiknevate geenide homosügootsed mutatsioonid võivad esile tuua retsessiivse fenotüübi ja olla geeneetiliselt heterogeensete haiguste põhjuseks (Alkuraya, 2010; Kearney et al., 2011). Et kontrollida, kas leitud LOH alades paiknenud POI tekkega seotud geenis asus mõni mutatsioon, sekveneeriti BMP-15 geeni kõik kaks eksonit, DACH2 geeni kümme eksonit ja MSH5 geeni teine ekson. Sekveneerimistulemuste analüüsimisel ei tuvastatud ühtegi mutatsiooni BMP-15, DACH2 ja MSH5 geeni vastavates eksonites. 32 ARUTELU Primaarne munasarjade puudulikkus põhjustab naistel viljatust ja POI diagnoos on sageli ootamatu ning ebameeldiv uudis. Lisaks viljatusele kaasnevad POI-ga ka hormonaalsed muutused, mis võivad kaasa tuua osteoporoosi, kardiovaskulaarsete ja neurodegeneratiivsete haiguste riski tõusu. Pikaaegne hormoonasendusravi on vajalik, et leevendada menopausi sümptomeid ja ennetada östrogeeni puudujäägist tulenevaid pikaaegseid tagajärgi tervisele. Suur hulk hormoonasendusravi preparaate on olemas, kuid ükski uuring ei ole otseselt võrrelnud erinevaid hormoonravi võimalusi POI-ga naiste jaoks. Üldiselt on 100 µg-ne östradiooli doos päevas transdermaalse plaastri kaudu soovituslik, et tagada tavapärane keskmine seerumi östradiooli tase ja efektiivselt leevendada sümptomeid (Jin, Yu et al. 2012). On tõestatud, et mitmel spontaanse POI-ga naisel on alles munasarja folliikuleid, mis võivad teatud aja tagant funktsioneerida ja naised võivad rasestuda isegi mitmeid aastaid peale diagnoosi. Rasestumine on sageli toimunud tarbides östrogeeni ja progestiini, mis võib olla meetod viljakuse tõstmiseks neil naistel (Popat, Vanderhoof et al. 2008). Kunstlik viljastamine doonormunarakkudega on hetkel siiski ainuke viljatuse raviviis, millel on kõrge õnnestumistase POI-ga naiste seas. Samuti on POI patsientidel raseduse saavutamiseks kasutatud embrüote krüopreservatsiooni, millel on üpriski kõrge 30%-ne õnnestumistase (Goswami and Conway 2007). Kuigi paljudel POI-ga naistel on võimalik erinevate viljatuse raviviiside abil rasestuda, siis peale POI diagnoosi pole normaalset viljakust võimalik enam taastada. Seetõttu on oluline välja töötada paremad POI diagnostikavõimalused, mis lubaks haiguse kujunemist ette ennustada. Kuid selle ülesande teevad keeruliseks POI väga heterogeensed etioloogilised põhjused ning samuti fakt, et pea pooltel POI juhtumitel on haiguse põhjus ja patogeneesi mehhanism teadmata. Samas, võivad POI-ga naisel leitud geneetilised aberratsioonid osutuda kasulikuks perekondlikul nõustamisel, sest nende andmete abil oleks võimalik naissoost sugulastel ette ennustada POI kõrgenenud riski ja viljakuse kaotust noores eas. Need naised saaksid seega planeerida lapse saamise varasemasse ikka enne POI kujunemist. See võimalus on muutumas üha olulisemaks tänapäeval, mil naised saavad lapsi üha enam 30ndates ja 40ndates eluaastates, mil POI kujunemise risk tõuseb (Persani et al., 2010). Käesoleva töö eesmärgiks oli analüüsida primaarse munasarjade puudulikkuse diagnoosiga patsiente, kellel oli haiguse täpne põhjus teadmata. POI-seoseliste koopiaarvu variatsioonide 33 leidmine võib parandada teadmisi POI geneetiliste põhjuste ja selle heterogeense haiguse patogeneesi kohta ning võimaldaks arendada POI geneetilist testimist. Antud töös leiti neli olulist CNV-d, millest kolmel võib olla seos POI kujunemisega (tabel 3). Võrreldes neid nelja CNV-d Eesti Geenivaramu 1000 üldpopulatsiooni indiviidi CNV sagedustega, tuvastati kolme CNV puhul madal esinemissagedus, kusjuures kahe CNV puhul oli tegu vaid osalise katvusega (tabel 4). Seega, niivõrd madala esinemissageduse juures ei saa need neli CNV-d olla neutraalsed, vaid tõenäoliselt on tegu haigusseoseliste CNV-dega. Patsiendil POF2 leiti 24,07 Mb suurune deletsioon piirkonnas Xp22.33-p21.3. Antud deletsioon võib tõenäoliselt olla POI kujunemist mõjutav, sest X-kromosoomi väikse õla deletsioone regioonis X(pter-p21) on varasemalt seostatud POI kujunemisega ning antud regioonis asub POI kandidaatgeen ZFX ja potentsiaalne POI kujunemist mõjutav steroid sulfataasi geen (Quilter et al., 2010; Simpson and Rajkovic, 1999). POI kandidaatgeeni ZFX ekspresseeritakse paljudes kudedes ja see asub Xp22.1-p21.3 piirkonnas. ZFX kodeerib ubikvitineeritult ekspresseeritud teadmata funktsiooniga tsink sõrme seoselist transkriptsioonifaktorit. ZFX klooniti algselt ZFY homoloogina, mis oli kunagine Y-kromosoomil testiseid määrava faktori kandidaatgeen. See geen pääseb X- kromosoomil inaktivatsioonist, nii et deletsioon või mutatsioon ühes koopias võib põhjustada haplopuudulikkust. ZFX knock-out hiired on väiksemad, vähem elujõulised ja viljakad ning neil on vähenenud idurakkude arv munasarjades ja munandites. ZFX geeni seostatakse ka naiste lühikese kasvuga (Goswami and Conway, 2005; Simpson and Rajkovic, 1999). Teine POI-ga seotud geen antud deleteerunud alas oli steroid sulfataasi geen, mis ekspresseerib steroid sulfataasi ensüümi. STS katalüüsib sulfeeritud steroidprekursorite muutmist östrogeeniks raseduse ajal. On teada, et STS ei osale X-kromosoomi inaktivatsioonis ning mutatsioonid STS geenis põhjustavad X-kromosoomiga seotud ihtüoosi meestel. STS ensüümi ületootmine võib põhjustada aga östrogeeni liiga suurt produktsiooni, mis võib omakorda alla suruda LH ja FSH tootmise ning selle kaudu mõjutada ootsüütide tootmist ja folliikulite küpsemist (Quilter et al., 2010). Patsiendil B1240 leiti 1,2 Mb suurune duplikatsioon piirkonnas Xp22.31, kus samuti asub STS geen. Patsiendil B1237 leiti 78 kb suurune duplikatsioon regioonis 17q21.31. Antud duplikatsioon jääb HumanCytoSNP-12 mikrokiibi efektiivse lahutusvõime piirimaile, ent kuna leitud 34 duplikatsioon on kinnitatud RT-qPCR meetodil, siis võib väita, et tegu on tõelise CNV-ga. Tuvastatud piirkonnas asub rinna- ja munasarjavähi tekkega seotud BRCA1 geen. BRCA geenid on kasvaja supressorgeenid ja mängivad olulist rolli kaheahelaliste DNA katkete paranduses. Mitmed varasemad uuringud on näidanud, et BRCA1 geeni haplopuudulikkus toob kaasa genoomse ebastabiilsuse ja võib põjustada ning kiirendada kartsinogeneesi heterosügootsete BRCA1 mutatsiooni kandjatel muutunud DNA paranduse ja DNA-d kahjustavate mõjude ülitundlikkuse kaudu (Konishi et al., 2011; Rennstam et al., 2010). Varasemalt on näidatud olulist seost BRCA1 geeni ja telomeeride pikkuse säilitamise vahel (McPherson et al., 2006). Telomeerid on nukleoproteiinsed kompleksid kromosoomide otstes, mis on vajalikud kromosoomide terviklikkuse säilitamiseks. Hanna jt näitasid, et enneaegse munasarjade vananemisega naistel on lühema pikkusega telomeerid kui normaalse munasarjade funktsiooniga viljakatel naistel. See uuringu tulemus toetab hüpoteesi BRCA mutatsioonide ja enneaegse munasarjade vananemise vahel (Hanna et al., 2009; Tea et al., 2013). Oktay jt näitasid, et BRCA1 mutatsiooniga patsientidel esines munasarjade stimulatsioonile nõrgem vastus in vitro viljastamisravi korral kui BRCA1 mutatsioonita patsientidel ning BRCA1 mutatsiooniga patsientidel oli väiksem arv munarakkse võrreldes kontrollrühmaga (Oktay et al., 2010). Munasarjade stimulatsiooni madalat vastust on varasemates uuringutes seostatud väheneva munasarjade reservi ja viljatusega. Seetõttu pakuti välja hüpotees, et kuna BRCA mutatsiooniga patsientidel on DNA katkete parandus puudulik, siis ootsüüdid võivad olla vastuvõtlikumad DNA kahjustustele. Folliikulid võivad munasarjades olla mitukümmend aastat ja nende ootsüütides võivad kuhjuda letaalsed DNA vead. On näidatud, et tõsiste ja parandamatute DNA kahjustuste korral aktiveeritakse somaatilistes rakkudes apoptoosirada. Seega on võimalik, et puuduliku BRCA funktsiooniga ootsüüdid kõrvaldatakse enneaegselt sarnase mehhanismi abil, tuues endaga kaasa varase munarakkude reservi ammendumise ja POI kujunemise (Oktay et al., 2010). Tea jt võrdlesid BRCA geeni mutatsiooni kandjatel ja tervetel kontrollidel POI tekkega oluliselt seotud geeni FMR1 genotüübi jaotuse mustrit. Uuringu tulemused näitasid FMR1 genotüübi erinevat jaotust BRCA1/2 mutatsiooni kandjatel võrrelduna kontrollrühmaga. Lisaks, BRCA1/2 mutatsiooni kandjatel võib olla tendents lühemale reproduktiiveale, kuna sama töögrupi varasem uuring näitas, et BRCA1/2 mutatsiooni kandjatel esinenud FMR1 genotüüp esines ka viljastumisraskustega naistel. Seega, nende uuringute tulemused toetavad BRCA mutatsioonide seost naise reproduktsioonis (Gleicher et al., 2011; Tea et al., 2013). 35 Lin jt näitasid oma uuringus, et BRCA1/2 mutatsiooniga valgetel naistel kujuneb loomulik menopaus 3-4 aastat varem kui kontrollrühmal ning mutatsiooni kandvatel suitsetajatel veelgi varem (Lin et al., 2013). BRCA1 geeni olulisust reproduktiivfunktsioonis toetavad ka uuringud loomadel. On näidatud, et vanemate emaste hiirte ootsüütides väheneb BRCA1 ekspressioon ja BRCA1 vaigistamine RNA interferentsi abil takistab noorte emaste hiirte ootsüütides kääviniitide moodustumist, mis viitab puutumata BRCA1 funktsiooni olulisusele ootsüütide ellujäämisel (Pan et al., 2008). Kuigi, antud artiklites kirjeldatud patsientidel esines BRCA1 mutatsioonidena peamiselt deletsioonid ja insertsioonid, on võimalik, et käesoleva uuringu käigus tuvastatud duplikatsioon võib patsiendil B1237 BRCA1 geeni transkriptsiooni ja funktsiooni muuta ja seega olla seotud POI kujunemisega, kuid selle tõestuseks on vajalikud edasised uuringud antud mutatsiooni mõju kohta BRCA1 geeni ekspressioonitasemele ja valgu funktsiooni osas. Patsiendil POF20 leiti oluline CNV 1q21.1-q21.2 regioonis. Tegu oli 1,35 Mb suuruse deletsiooniga. Antud lookuses esinevaid deletsioone on varasemalt seostatud närvisüsteemi arenguhäiretega. Mefford jt avastasid 5218 patsiendi skriinimisel 1,35 Mb suuruse deletsiooni 1q21.1 regioonis 25 patsiendil. See mikrodeletsioon oli kaheksal patsiendil tekkinud de novo, kolmel päritud haigestunud vanemalt, kuigi nende haigusfenotüüp ei olnud tõsine, ja kuuel patsiendil päritud näiliselt tervelt vanemalt ning kaheksal patsiendil ei olnud deletsiooni päritolu teada. See deletsioon puudus 4737 kontrollisikul. Antud deletsiooniga kaasnes märkimisväärne fenotüübiline varieeruvus: nõrk kuni keskmine vaimse arengu mahajäämus, mikrotsefaalia, südame väärarengud ja kae (Mefford et al., 2008). Brunetti-Pierri jt kinnitasid 1q21.1 mikrodeletsiooni seost pea kasvuga, deletsiooni puhul seost pea suuruse vähenemisega ja duplikatsiooni korral vastupidiselt pea suuruse suurenemisega. Nad avastasid antud deletsiooni 21 patsiendil, kel esines teiste fenotüübiliste iseärasuste seas ka südame väärarengud (6/21), liigeste hüpermobiilsus või sidemete lõtvus (5/21), hüpotoonia (5/21), krambid (3/21) ja hall kae (3/21) (Brunetti-Pierri et al., 2008). Samuti on 1q21.1 deletsiooni leitud mittesündroomse skisofreeniaga patsientidel. 1q21.1 regiooni genoomsete aberratsioonidega seotud fenotüübiline mitmekesisus, mittetäielik penetrantsus ja kindlate sündroomsete tunnuste puudumine muudab selle regiooni kasutamise geneetilises nõustamises keeruliseks. Siiski, selle regiooniga seotud ümberkorralduste erinev esinemine patsientidel ja kontrollpopulatsioonis muudab selle kliiniliselt oluliseks leiuks, mis näib omavat eelsoodumust närvisüsteemi arenguhäireteks (https://decipher.sanger.ac.uk/ 10 syndrome/62) . 36 Antud töös tuvastati mikrokiibianalüüsil mitmeid heterosügootsuse kaotanud alasid. Oluliseks peeti kolme LOH piirkonda, kus asub varasemalt POI tekkega seostatud geene. Patsiendil POF20 leiti 13,24 Mb suurune LOH ala piirkonnas Xp11.23-p11.1, kus esineb BMP-15 geen. Sama patsiendi X-kromosoomi pikas õlas tuvastati ka 26,2 Mb pikkune LOH ala Xq12-q21.31 piirkonnas, kus asub POI-seoseline DACH2 geen. Oluliseks leiuks peeti ka patsiendil B1235 esinenud LOH ala 6p22.2-p22.32 piirkonnas, kus asub võimalik POI kujunemist mõjutav geen MSH5. BMP-15 on ootsüüdispetsiifiline kasvu- ja diferentsioonifaktor, mis stimuleerib follikulogeneesi ja granuloosarakkude kasvu. Varasemalt on POI patsientidel leitud mitmeid mutatsioone BMP-15 geenis. BMP-15 geeni peetakse üheks olulisemaks POI tekkega seotud geeniks (vaata lehekülgi 12-14 ja joonis 2). DACH2 geeni seostati esmakordselt POI-ga selle avastamisel tasakaalustatud translokatsiooni murdepunktis X-kromosoomi kriitilises regioonis Xq13-q26 POI-ga patsiendil (Prueitt et al., 2002). Dachshund homoloogi geeni kirjeldati esimest korda aga Drosophilal, kus see kodeerib silmade, jäsemete ja genitaaldiski arenguga seotud tuumavalku. Drosophilal on üks DACH geen, kuid hiirel ja inimesel on avastatud kaks DACH geeni: DACH1 ja DACH2. DACH1 ja DACH2 geenid on seotud emase hiire genitaaltrakti arenguga. Inimestel on DACH2 geeni seostatud POI kujunemisega, kuna DACH2 valgu muutused võivad häirida munasarja folliikulite diferentseerumist (Nodin et al., 2012). Bione jt teostasid mutatsiooni analüüsi DACH2 geeni 13 eksonis 257-l itaalia POI patsiendil. Uuringu käigus tuvastati 15 SNP-i, millest viis olid geeni kodeerivas osas ja tõid kaasa aminohappe muutuse. Need kodeerivas regioonis olevad missense mutatsioonid olid sagedasemad POI patsientidel kui kontrollidel (Bione et al., 2004). MSH5 geen kuulub DNA mismatch parandusega seotud geeniperekonda. MSH5 knock-out hiired on elujõulised, kuid viljatud. Nendel hiirtel on meioos häiritud kromosoomide puuduliku paardumise tõttu profaasis I. Nende emaste hiirte munasarjad on sündides normaalse suurusega, ent degenereeruvad järk-järgult väiksemaks ja vanusega väheneb neil ka ootsüütide arv. Mandon-Pépin jt sekveneerisid MSH5 geeni 41 POI patsiendil ja 36 tervel naisel. Analüüsi tulemusel leiti MSH5 geeni teises eksonis heterosügootne missense mutatsioon kahel patsiendil, ent mitte ühelgi kontrollil. See mutatsioon tõi kaasa mittepolaarse 37 aminohappe proliini asendumise polaarse aminohappe seriiniga positsioonil 29 (Mandon- Pepin et al., 2008). Eelnevate uuringute käigus on näidatud, et heterosügootsuse kaotanud alades paiknevate geenide homosügootsed mutatsioonid võivad esile tuua retsessiivse fenotüübi ja olla geeneetiliselt heterogeensete haiguste põhjuseks. Samuti võib homosügootsuse kaardistamine vähendada vajadust sekveneerida geneetiliselt heterogeense haiguse korral mitmeid haigusega seotud geene (Alkuraya, 2010; Kearney et al., 2011). Et kontrollida, kas leitud LOH alades paiknenud POI tekkega seotud geenides asus mõni mutatsioon, sekveneeriti BMP-15 geeni kõik kaks eksonit, DACH2 geeni kümme eksonit ja MSH5 geeni teine ekson. Sekveneerimistulemuste analüüsimisel ei tuvastatud ühtegi mutatsiooni BMP-15, DACH2 ja MSH5 geeni vastavates eksonites. 38 KOKKUVÕTE Primaarse munasarjade puudulikkuse tekkepõhjusi on uuritud mitmeid aastaid, kuid endiselt pole haiguse täpne patogenees ning pea pooltel juhtumitel POI etioloogia teada. Viimastel aastal on üha rohkem uuritud haiguse geneetilisi põhjusi ja leitud mitmeid POI seoselisi kandidaatgeene ning koopiaarvu muutusi. Käesoleva magistritöö raames uuriti 21 primaarse munasarjade puudulikkusega patsienti, et leida haigusseoselisi CNV-sid ja kandidaatgeene. CNV-de tuvastamiseks POI patsientidel teostati ülegenoomne kiibianalüüs, kasutades Illumina kogu genoomi SNP genotüpiseerimiskiipe. Lisaks, sekveneeriti kahel patsiendil kiibianalüüsil tuvastatud LOH alades leitud POI seoseliste geenide eksonid: DACH2 kümme eksonit, BMP-15 kaks eksonit ja MSH5 teine ekson. Antud töös tuvastati neli kliiniliselt olulist CNV-d, millest kolmel võib olla seos POI kujunemisega. Leitud CNV-d olid järgmised: 1) 24,07 Mb suurune deletsiooni Xp22.33-p21.3 regioonis, kus asuvad POI kandidaatgeen ZFX ja potentsiaalne POI kujunemist mõjutav STS geen; 2) 1,2 Mb suurune duplikatsioon piirkonnas Xp22.31, kus asub samuti STS geen; 3) 78 kb suurune duplikatsioon 17q21.31 piirkonnas, kus asub munasarja- ja rinnavähigeen BRCA1, mida on samuti seostatud naiste varasema menopausi ja varjatud POI kujunemisega; 4) 1,35 Mb suurune deletsioon 1q21.1-q21.2 regioonis. Antud lookuses esinevaid deletsioone on varasemalt seostatud närvisüsteemi arenguhäiretega. Leitud CNV-d on kinnitatud sõltumatul RT-qPCR meetodil, välja arvatud 24,07 Mb suurune deletsioon, mida on võimalik detekteerida karüotüübi analüüsil. Samuti leiti kolm LOH ala, kus asus kolm POI seoselist geeni. Tuvastatud LOH alad olid järgmised: 1) Patsiendil POF20 13,24 Mb suurune LOH ala piirkonnas Xp11.23-p11.1, kus esineb BMP-15 geen; ja 2) 29 Mb pikkune LOH ala Xq12-q21.31 piirkonnas, kus asub DACH2 geen; 3) Patsiendil B1235 6,6 Mb suurune LOH ala 6p22.2-p22.32 piirkonnas, kus asub MSH5 geen. Eelnevad uuringud on näidanud, et LOH alades paiknevate geenide homosügootsed mutatsioonid võivad esile tuua retsessiivse fenotüübi ja olla geeneetiliselt heterogeensete haiguste põhjuseks. Et testida, kas antud geenides asub mõni POI seoseline mutatsioon, sekveneeriti DACH2 kümme eksonit, BMP-15 kaks eksonit ja MSH5 teine ekson, kuid ühtegi mutatsiooni nende geenide eksonites ei leitud. 39 DNA copy number variations in women with primary ovarian insufficiency Kati Hiieleek SUMMARY The causes of primary ovarian insufficiency (POI) have been studied for many years, but still the mechanism of the disorder and nearly half of the causing factors of POI remain unknown. In the recent years many studies have focused on the genetic factors of POI which has lead to finding new POI related candidate genes and copy number variations (CNVs). During the current research project 21 patients with POI were screened to find CNVs and candidate genes connected to the disorder. Illumina’s Whole-Genome SNP Genotyping analysis was performed using BeadArray chips to detect these CNVs. In addition, the exons of the POI realated genes in the loss of heterozygosity (LOH) regions discovered by genotyping in two patients were sequenced to find mutations associated with POI. We found four clinically relevant CNVs and three of them could be causing POI. The discovered CNVs were the following: 1) A deletion of 24.07 Mb in Xp22.33-p21.3 region where the POI related genes ZFX and STS are located in; 2) A duplication of 1.2 Mb in Xp22.31 region where also the STS gene is located in; 3) A duplication of 78 kb in 17q21.31 region where the ovarian and breast cancer BRCA1 gene is situated. BRCA1 mutations have also been associated with earlier age at natural menopause and POI; 4) A deletion of 1.35 Mb in 1q21.1-q21.2 region, which is a susceptibility locus for neurodevelopmental disorders. The CNVs have been confirmed by RT-qPCR method, except the 24.07 Mb deletion, which could be detected by karyotyping. In addition, we detected three LOH regions by genotyping where three genes associated with POI are situated. The discovered LOH regions were the following: 1) A LOH region of 13.24 Mb in patient POF20 in Xp11.23-p11.1 region where the BMP-15 gene is situated; 2) A LOH region of 29 Mb in patient POF20 in Xq12-q21.31 region where the DACH2 gene is located in; 3) A LOH region of 6,6 Mb in patient B1235 in 6p22.2-p22.32 region where the MSH5 gene is situated. Recent studies have shown that homozygous mutations in genes located in the LOH region increase the frequency of recessive phenotypes and therefore can be the cause of genetically heterogeneous conditions. We sequenced DACH2 ten exons, BMP-15 two exons and MSH5 second exon to screen for mutations responsible for the development of POI, but we did not identify any mutations in these genes’ exons. 40 TÄNUAVALDUSED Kõige enam soovin tänada oma juhendajat prof. Ants Kurge abistavate nõuannete ja toetuse eest magistritöö kirjutamisel. Samuti suured tänusõnad Olga Tšuiko, Olga Žilina, Margit Nõukas ja Merle Külaotsale väärtuslike õpetussõnade ja soovituste eest. Tänan ka koostööpartnereid prof. Andres Salumetsa ja SA Tartu Ülikooli Kliinikumi naistekliiniku ning Reproduktiivmeditsiini TAK AS töötajaid. Lõpetuseks soovin tänada oma sõpru, perekonda ja kallist Indrekut, kelle toetusel nii kaugele olen jõudnud. 41 KASUTATUD KIRJANDUS Aittomaki, K., Lucena, J. L., Pakarinen, P., Sistonen, P., Tapanainen, J., Gromoll, J., Kaskikari, R., Sankila, E. M., Lehvaslaiho, H., Engel, A. R., Nieschlag, E., Huhtaniemi, I., and de la Chapelle, A. (1995). Mutation in the follicle-stimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure. Cell 82(6), 959-68. Alkuraya, F. S. (2010). Homozygosity mapping: one more tool in the clinical geneticist's toolbox. Genet Med 12(4), 236-9. Amato, P., and Roberts, A. C. (2001). Transient ovarian failure: a complication of uterine artery embolization. Fertil Steril 75(2), 438-9. Bachelot, A., Rouxel, A., Massin, N., Dulon, J., Courtillot, C., Matuchansky, C., Badachi, Y., Fortin, A., Paniel, B., Lecuru, F., Lefrere-Belda, M. A., Constancis, E., Thibault, E., Meduri, G., Guiochon-Mantel, A., Misrahi, M., Kuttenn, F., and Touraine, P. (2009). Phenotyping and genetic studies of 357 consecutive patients presenting with premature ovarian failure. Eur J Endocrinol 161(1), 179-87. Bakalov, V. K., Anasti, J. N., Calis, K. A., Vanderhoof, V. H., Premkumar, A., Chen, S., Furmaniak, J., Smith, B. R., Merino, M. J., and Nelson, L. M. (2005). Autoimmune oophoritis as a mechanism of follicular dysfunction in women with 46,XX spontaneous premature ovarian failure. Fertil Steril 84(4), 958-65. Bharath, R., Unnikrishnan, A. G., Thampy, M. V., Anilkumar, A., Nisha, B., Praveen, V. P., Nair, V., Jayakumar, R. V., and Kumar, H. (2010). Turner syndrome and its variants. Indian J Pediatr 77(2), 193-5. Bione, S., Rizzolio, F., Sala, C., Ricotti, R., Goegan, M., Manzini, M. C., Battaglia, R., Marozzi, A., Vegetti, W., Dalpra, L., Crosignani, P. G., Ginelli, E., Nappi, R., Bernabini, S., Bruni, V., Torricelli, F., Zuffardi, O., and Toniolo, D. (2004). Mutation analysis of two candidate genes for premature ovarian failure, DACH2 and POF1B. Hum Reprod 19(12), 2759-66. Brunetti-Pierri, N., Berg, J. S., Scaglia, F., Belmont, J., Bacino, C. A., Sahoo, T., Lalani, S. R., Graham, B., Lee, B., Shinawi, M., Shen, J., Kang, S. H., Pursley, A., Lotze, T., Kennedy, G., Lansky-Shafer, S., Weaver, C., Roeder, E. R., Grebe, T. A., Arnold, G. L., Hutchison, T., Reimschisel, T., Amato, S., Geragthy, M. T., Innis, J. W., Obersztyn, E., Nowakowska, B., Rosengren, S. S., Bader, P. I., Grange, D. K., Naqvi, S., Garnica, A. D., Bernes, S. M., Fong, C. T., Summers, A., Walters, W. D., Lupski, J. R., Stankiewicz, P., Cheung, S. W., and Patel, A. (2008). Recurrent reciprocal 1q21.1 deletions and duplications associated with microcephaly or macrocephaly and developmental and behavioral abnormalities. Nat Genet 40(12), 1466-71. Cejtin, H. E., Kalinowski, A., Bacchetti, P., Taylor, R. N., Watts, D. H., Kim, S., Massad, L. S., Preston-Martin, S., Anastos, K., Moxley, M., and Minkoff, H. L. (2006). Effects of human immunodeficiency virus on protracted amenorrhea and ovarian dysfunction. Obstet Gynecol 108(6), 1423-31. Chand, A. L., Harrison, C. A., and Shelling, A. N. (2010). Inhibin and premature ovarian failure. Hum Reprod Update 16(1), 39-50. Clowse, M. E., Behera, M. A., Anders, C. K., Copland, S., Coffman, C. J., Leppert, P. C., and Bastian, L. A. (2009). Ovarian preservation by GnRH agonists during chemotherapy: a meta-analysis. J Womens Health (Larchmt) 18(3), 311-9. Colella, S., Yau, C., Taylor, J. M., Mirza, G., Butler, H., Clouston, P., Bassett, A. S., Seller, A., Holmes, C. C., and Ragoussis, J. (2007). QuantiSNP: an Objective Bayes Hidden- 42 Markov Model to detect and accurately map copy number variation using SNP genotyping data. Nucleic Acids Res 35(6), 2013-25. Cordts, E. B., Christofolini, D. M., Dos Santos, A. A., Bianco, B., and Barbosa, C. P. (2011). Genetic aspects of premature ovarian failure: a literature review. Arch Gynecol Obstet 283(3), 635-43. D'Haene, B., Vandesompele, J., and Hellemans, J. (2010). Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods 50(4), 262-70. Davis, C. J., Davison, R. M., Payne, N. N., Rodeck, C. H., and Conway, G. S. (2000). Female sex preponderance for idiopathic familial premature ovarian failure suggests an X chromosome defect: opinion. Hum Reprod 15(11), 2418-22. Di Pasquale, E., Beck-Peccoz, P., and Persani, L. (2004). Hypergonadotropic ovarian failure associated with an inherited mutation of human bone morphogenetic protein-15 (BMP15) gene. Am J Hum Genet 75(1), 106-11. Dong, J., Albertini, D. F., Nishimori, K., Kumar, T. R., Lu, N., and Matzuk, M. M. (1996). Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature 383(6600), 531-5. Forges, T., Monnier-Barbarino, P., Leheup, B., and Jouvet, P. (2006). Pathophysiology of impaired ovarian function in galactosaemia. Hum Reprod Update 12(5), 573-84. Gleicher, N., Weghofer, A., Kim, A., and Barad, D. H. (2012). The impact in older women of ovarian FMR1 genotypes and sub-genotypes on ovarian reserve. PLoS One 7(3), e33638. Gleicher, N., Weghofer, A., Lee, I. H., and Barad, D. H. (2011). Association of FMR1 genotypes with in vitro fertilization (IVF) outcomes based on ethnicity/race. PLoS One 6(4), e18781. Goswami, D., and Conway, G. S. (2005). Premature ovarian failure. Hum Reprod Update 11(4), 391-410. Goswami, R., Goswami, D., Kabra, M., Gupta, N., Dubey, S., and Dadhwal, V. (2003). Prevalence of the triple X syndrome in phenotypically normal women with premature ovarian failure and its association with autoimmune thyroid disorders. Fertil Steril 80(4), 1052-4. Gubbels, C. S., Thomas, C. M., Wodzig, W. K., Olthaar, A. J., Jaeken, J., Sweep, F. C., and Rubio-Gozalbo, M. E. (2011). FSH isoform pattern in classic galactosemia. J Inherit Metab Dis 34(2), 387-90. Hanna, C. W., Bretherick, K. L., Gair, J. L., Fluker, M. R., Stephenson, M. D., and Robinson, W. P. (2009). Telomere length and reproductive aging. Hum Reprod 24(5), 1206-11. Hanrahan, J. P., Gregan, S. M., Mulsant, P., Mullen, M., Davis, G. H., Powell, R., and Galloway, S. M. (2004). Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries). Biol Reprod 70(4), 900-9. Inagaki, K., and Shimasaki, S. (2010). Impaired production of BMP-15 and GDF-9 mature proteins derived from proproteins WITH mutations in the proregion. Mol Cell Endocrinol 328(1-2), 1-7. Jacobs, P. A., Baikie, A. G., Brown, W. M., Macgregor, T. N., Maclean, N., and Harnden, D. G. (1959). Evidence for the existence of the human "super female". Lancet 2(7100), 423-5. Jin, M., Yu, Y., and Huang, H. (2012). An update on primary ovarian insufficiency. Sci China Life Sci 55(8), 677-86. Kappeler, C. J., and Hoyer, P. B. (2012). 4-vinylcyclohexene diepoxide: a model chemical for ovotoxicity. Syst Biol Reprod Med 58(1), 57-62. 43 Kearney, H. M., Kearney, J. B., and Conlin, L. K. (2011). Diagnostic implications of excessive homozygosity detected by SNP-based microarrays: consanguinity, uniparental disomy, and recessive single-gene mutations. Clin Lab Med 31(4), 595- 613, ix. Klein, P., Serje, A., and Pezzullo, J. C. (2001). Premature ovarian failure in women with epilepsy. Epilepsia 42(12), 1584-9. Konishi, H., Mohseni, M., Tamaki, A., Garay, J. P., Croessmann, S., Karnan, S., Ota, A., Wong, H. Y., Konishi, Y., Karakas, B., Tahir, K., Abukhdeir, A. M., Gustin, J. P., Cidado, J., Wang, G. M., Cosgrove, D., Cochran, R., Jelovac, D., Higgins, M. J., Arena, S., Hawkins, L., Lauring, J., Gross, A. L., Heaphy, C. M., Hosokawa, Y., Gabrielson, E., Meeker, A. K., Visvanathan, K., Argani, P., Bachman, K. E., and Park, B. H. (2011). Mutation of a single allele of the cancer susceptibility gene BRCA1 leads to genomic instability in human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 108(43), 17773-8. La Marca, A., Brozzetti, A., Sighinolfi, G., Marzotti, S., Volpe, A., and Falorni, A. (2010). Primary ovarian insufficiency: autoimmune causes. Curr Opin Obstet Gynecol 22(4), 277-82. Latronico, A. C., Chai, Y., Arnhold, I. J., Liu, X., Mendonca, B. B., and Segaloff, D. L. (1998). A homozygous microdeletion in helix 7 of the luteinizing hormone receptor associated with familial testicular and ovarian resistance is due to both decreased cell surface expression and impaired effector activation by the cell surface receptor. Mol Endocrinol 12(3), 442-50. Lin, H. J., Ndiforchu, F., and Patell, S. (1993). Exstrophy of the cloaca in a 47,XXX child: review of genitourinary malformations in triple-X patients. Am J Med Genet 45(6), 761-3. Lin, W. T., Beattie, M., Chen, L. M., Oktay, K., Crawford, S. L., Gold, E. B., Cedars, M., and Rosen, M. (2013). Comparison of age at natural menopause in BRCA1/2 mutation carriers with a non-clinic-based sample of women in northern California. Cancer 119(9), 1652-9. Lofrano-Porto, A., Barra, G. B., Giacomini, L. A., Nascimento, P. P., Latronico, A. C., Casulari, L. A., and da Rocha Neves Fde, A. (2007). Luteinizing hormone beta mutation and hypogonadism in men and women. N Engl J Med 357(9), 897-904. Mandon-Pepin, B., Touraine, P., Kuttenn, F., Derbois, C., Rouxel, A., Matsuda, F., Nicolas, A., Cotinot, C., and Fellous, M. (2008). Genetic investigation of four meiotic genes in women with premature ovarian failure. Eur J Endocrinol 158(1), 107-15. Matikainen, T., Perez, G. I., Jurisicova, A., Pru, J. K., Schlezinger, J. J., Ryu, H. Y., Laine, J., Sakai, T., Korsmeyer, S. J., Casper, R. F., Sherr, D. H., and Tilly, J. L. (2001). Aromatic hydrocarbon receptor-driven Bax gene expression is required for premature ovarian failure caused by biohazardous environmental chemicals. Nat Genet 28(4), 355-60. Matthews, C. H., Borgato, S., Beck-Peccoz, P., Adams, M., Tone, Y., Gambino, G., Casagrande, S., Tedeschini, G., Benedetti, A., and Chatterjee, V. K. (1993). Primary amenorrhoea and infertility due to a mutation in the beta-subunit of follicle- stimulating hormone. Nat Genet 5(1), 83-6. McPherson, J. P., Hande, M. P., Poonepalli, A., Lemmers, B., Zablocki, E., Migon, E., Shehabeldin, A., Porras, A., Karaskova, J., Vukovic, B., Squire, J., and Hakem, R. (2006). A role for Brca1 in chromosome end maintenance. Hum Mol Genet 15(6), 831-8. Mefford, H. C., Sharp, A. J., Baker, C., Itsara, A., Jiang, Z., Buysse, K., Huang, S., Maloney, V. K., Crolla, J. A., Baralle, D., Collins, A., Mercer, C., Norga, K., de Ravel, T., 44 Devriendt, K., Bongers, E. M., de Leeuw, N., Reardon, W., Gimelli, S., Bena, F., Hennekam, R. C., Male, A., Gaunt, L., Clayton-Smith, J., Simonic, I., Park, S. M., Mehta, S. G., Nik-Zainal, S., Woods, C. G., Firth, H. V., Parkin, G., Fichera, M., Reitano, S., Lo Giudice, M., Li, K. E., Casuga, I., Broomer, A., Conrad, B., Schwerzmann, M., Raber, L., Gallati, S., Striano, P., Coppola, A., Tolmie, J. L., Tobias, E. S., Lilley, C., Armengol, L., Spysschaert, Y., Verloo, P., De Coene, A., Goossens, L., Mortier, G., Speleman, F., van Binsbergen, E., Nelen, M. R., Hochstenbach, R., Poot, M., Gallagher, L., Gill, M., McClellan, J., King, M. C., Regan, R., Skinner, C., Stevenson, R. E., Antonarakis, S. E., Chen, C., Estivill, X., Menten, B., Gimelli, G., Gribble, S., Schwartz, S., Sutcliffe, J. S., Walsh, T., Knight, S. J., Sebat, J., Romano, C., Schwartz, C. E., Veltman, J. A., de Vries, B. B., Vermeesch, J. R., Barber, J. C., Willatt, L., Tassabehji, M., and Eichler, E. E. (2008). Recurrent rearrangements of chromosome 1q21.1 and variable pediatric phenotypes. N Engl J Med 359(16), 1685-99. Morrison, J. C., Givens, J. R., Wiser, W. L., and Fish, S. A. (1975). Mumps oophoritis: a cause of premature menopause. Fertil Steril 26(7), 655-9. Nelis, M., Esko, T., Magi, R., Zimprich, F., Zimprich, A., Toncheva, D., Karachanak, S., Piskackova, T., Balascak, I., Peltonen, L., Jakkula, E., Rehnstrom, K., Lathrop, M., Heath, S., Galan, P., Schreiber, S., Meitinger, T., Pfeufer, A., Wichmann, H. E., Melegh, B., Polgar, N., Toniolo, D., Gasparini, P., D'Adamo, P., Klovins, J., Nikitina- Zake, L., Kucinskas, V., Kasnauskiene, J., Lubinski, J., Debniak, T., Limborska, S., Khrunin, A., Estivill, X., Rabionet, R., Marsal, S., Julia, A., Antonarakis, S. E., Deutsch, S., Borel, C., Attar, H., Gagnebin, M., Macek, M., Krawczak, M., Remm, M., and Metspalu, A. (2009). Genetic structure of Europeans: a view from the North- East. PLoS One 4(5), e5472. Nicol, L., Bishop, S. C., Pong-Wong, R., Bendixen, C., Holm, L. E., Rhind, S. M., and McNeilly, A. S. (2009). Homozygosity for a single base-pair mutation in the oocyte- specific GDF9 gene results in sterility in Thoka sheep. Reproduction 138(6), 921-33. Nodin, B., Fridberg, M., Uhlen, M., and Jirstrom, K. (2012). Discovery of dachshund 2 protein as a novel biomarker of poor prognosis in epithelial ovarian cancer. J Ovarian Res 5(1), 6. Ohl, J., Partisani, M., Demangeat, C., Binder-Foucard, F., Nisand, I., and Lang, J. M. (2010). [Alterations of ovarian reserve tests in Human Immunodeficiency Virus (HIV)- infected women]. Gynecol Obstet Fertil 38(5), 313-7. Oktay, K., Kim, J. Y., Barad, D., and Babayev, S. N. (2010). Association of BRCA1 mutations with occult primary ovarian insufficiency: a possible explanation for the link between infertility and breast/ovarian cancer risks. J Clin Oncol 28(2), 240-4. Otsuka, F., McTavish, K. J., and Shimasaki, S. (2011). Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function. Mol Reprod Dev 78(1), 9-21. Palmer, J. S., Zhao, Z. Z., Hoekstra, C., Hayward, N. K., Webb, P. M., Whiteman, D. C., Martin, N. G., Boomsma, D. I., Duffy, D. L., and Montgomery, G. W. (2006). Novel variants in growth differentiation factor 9 in mothers of dizygotic twins. J Clin Endocrinol Metab 91(11), 4713-6. Pan, H., Ma, P., Zhu, W., and Schultz, R. M. (2008). Age-associated increase in aneuploidy and changes in gene expression in mouse eggs. Dev Biol 316(2), 397-407. Persani, L., Rossetti, R., and Cacciatore, C. (2010). Genes involved in human premature ovarian failure. J Mol Endocrinol 45(5), 257-79. Petraglia, F., Hartmann, B., Luisi, S., Florio, P., Kirchengast, S., Santuz, M., Genazzani, A. D., and Genazzani, A. R. (1998). Low levels of serum inhibin A and inhibin B in 45 women with hypergonadotropic amenorrhea and evidence of high levels of activin A in women with hypothalamic amenorrhea. Fertil Steril 70(5), 907-12. Pisarska, M. D., Kuo, F. T., Bentsi-Barnes, I. K., Khan, S., and Barlow, G. M. (2010). LATS1 phosphorylates forkhead L2 and regulates its transcriptional activity. Am J Physiol Endocrinol Metab 299(1), E101-9. Prueitt, R. L., Chen, H., Barnes, R. I., and Zinn, A. R. (2002). Most X;autosome translocations associated with premature ovarian failure do not interrupt X-linked genes. Cytogenet Genome Res 97(1-2), 32-8. Quilter, C. R., Karcanias, A. C., Bagga, M. R., Duncan, S., Murray, A., Conway, G. S., Sargent, C. A., and Affara, N. A. (2010). Analysis of X chromosome genomic DNA sequence copy number variation associated with premature ovarian failure (POF). Hum Reprod 25(8), 2139-50. Rennstam, K., Ringberg, A., Cunliffe, H. E., Olsson, H., Landberg, G., and Hedenfalk, I. (2010). Genomic alterations in histopathologically normal breast tissue from BRCA1 mutation carriers may be caused by BRCA1 haploinsufficiency. Genes Chromosomes Cancer 49(1), 78-90. Rizzolio, F., Bione, S., Sala, C., Goegan, M., Gentile, M., Gregato, G., Rossi, E., Pramparo, T., Zuffardi, O., and Toniolo, D. (2006). Chromosomal rearrangements in Xq and premature ovarian failure: mapping of 25 new cases and review of the literature. Hum Reprod 21(6), 1477-83. Rizzolio, F., Pramparo, T., Sala, C., Zuffardi, O., De Santis, L., Rabellotti, E., Calzi, F., Fusi, F., Bellazzi, R., and Toniolo, D. (2009). Epigenetic analysis of the critical region I for premature ovarian failure: demonstration of a highly heterochromatic domain on the long arm of the mammalian X chromosome. J Med Genet 46(9), 585-92. Rossetti, R., Di Pasquale, E., Marozzi, A., Bione, S., Toniolo, D., Grammatico, P., Nelson, L. M., Beck-Peccoz, P., and Persani, L. (2009). BMP15 mutations associated with primary ovarian insufficiency cause a defective production of bioactive protein. Hum Mutat 30(5), 804-10. Rubio-Gozalbo, M. E., Gubbels, C. S., Bakker, J. A., Menheere, P. P., Wodzig, W. K., and Land, J. A. (2010). Gonadal function in male and female patients with classic galactosemia. Hum Reprod Update 16(2), 177-88. Schuh-Huerta, S. M., Johnson, N. A., Rosen, M. P., Sternfeld, B., Cedars, M. I., and Reijo Pera, R. A. (2012). Genetic variants and environmental factors associated with hormonal markers of ovarian reserve in Caucasian and African American women. Hum Reprod 27(2), 594-608. Sharara, F. I., Seifer, D. B., and Flaws, J. A. (1998). Environmental toxicants and female reproduction. Fertil Steril 70(4), 613-22. Simpson, J. L. (2008). Genetic and phenotypic heterogeneity in ovarian failure: overview of selected candidate genes. Ann N Y Acad Sci 1135, 146-54. Simpson, J. L., and Rajkovic, A. (1999). Ovarian differentiation and gonadal failure. Am J Med Genet 89(4), 186-200. Soules, M. R., Battaglia, D. E., and Klein, N. A. (1998). Inhibin and reproductive aging in women. Maturitas 30(2), 193-204. Tartaglia, N. R., Howell, S., Sutherland, A., Wilson, R., and Wilson, L. (2010). A review of trisomy X (47,XXX). Orphanet J Rare Dis 5, 8. Tea, M. K., Weghofer, A., Wagner, K., and Singer, C. F. (2013). Association of BRCA1/2 mutations with FMR1 genotypes: Effects on menarcheal and menopausal age. Maturitas. 46 Testa, G., Chiaffarino, F., Vegetti, W., Nicolosi, A., Caliari, I., Alagna, F., Bolis, P. F., Parazzini, F., and Crosignani, P. G. (2001). Case-control study on risk factors for premature ovarian failure. Gynecol Obstet Invest 51(1), 40-3. Wang, B., Wen, Q., Ni, F., Zhou, S., Wang, J., Cao, Y., and Ma, X. (2010). Analyses of growth differentiation factor 9 (GDF9) and bone morphogenetic protein 15 (BMP15) mutation in Chinese women with premature ovarian failure. Clin Endocrinol (Oxf) 72(1), 135-6. Wang, K., Chen, Z., Tadesse, M. G., Glessner, J., Grant, S. F., Hakonarson, H., Bucan, M., and Li, M. (2008). Modeling genetic inheritance of copy number variations. Nucleic Acids Res 36(21), e138. Welt, C. K. (2008). Primary ovarian insufficiency: a more accurate term for premature ovarian failure. Clin Endocrinol (Oxf) 68(4), 499-509. Yan, C., Wang, P., DeMayo, J., DeMayo, F. J., Elvin, J. A., Carino, C., Prasad, S. V., Skinner, S. S., Dunbar, B. S., Dube, J. L., Celeste, A. J., and Matzuk, M. M. (2001). Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian function. Mol Endocrinol 15(6), 854-66. Zinn, A. R., Tonk, V. S., Chen, Z., Flejter, W. L., Gardner, H. A., Guerra, R., Kushner, H., Schwartz, S., Sybert, V. P., Van Dyke, D. L., and Ross, J. L. (1998). Evidence for a Turner syndrome locus or loci at Xp11.2-p22.1. Am J Hum Genet 63(6), 1757-66. Kasutatatud veebiaadressid 1 http://www.omim.org/ 2 http://www.illumina.com/products/humancytosnp_12_dna_analysis_beadchip_kits.ilmn 3 http://projects.tcag.ca/variation/ 4 http://decipher.sanger.ac.uk/ 5 http://bioinfo.ut.ee/gwRTqPCR 6 http://primer3.wi.mit.edu/ 7 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html 8 www.ensembl.org 9 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ 10 https://decipher.sanger.ac.uk/syndrome/62 47 LISAD LISA 1. Töös RT-qPCR-ks kasutatud praimerite järjestused Praimerid Kromosoom Forward praimer Reverse praimer POF20_1_1 1q21.1-q21.2 TGCCATTTTGAGCCACACGA TCAGCAGTGAACACGAAAGCCA POF20_1_2 1q21.1-q21.2 TTCCTGGGTCAGGCGTTTCATA AACATTTGTTCCCATGCTCCCC POF20_1_3 1q21.1-q21.2 TCTTTATGGGCCTGTGCCTTCA TTCCATTGCTGGGTTCATGCTC POF20_1_4 1q21.1-q21.2 TGGGTTAATCGCAGGATCAGCA TTTCCCAGGGCGTTGCTTTT POF20_1_5 1q21.1-q21.2 TTTGAATGGCGCAGTGGGAA TCTTGCCTGCACCGTGAGTTTT B1237_17_1 17q21.31 TCAATGTTCAATGTGCCCAGCA CATTCCCAGCAATCTCCGACAA B1237_17_2 17q21.31 TTGCCGAAGTCAAAGAGGACCA TTCCTGATTCCTGAGGCCATGA B1237_17_3 17q21.31 TTTGCCTGCTGCACATGGATT AGCTGGTGATGCTGGGAAAATG B1237_17_4 17q21.31 ATGCCCGGCCATGCAATTAT AAAACCTCGTTTCTGCTTGGGC B1237_17_5 17q21.31 CGCTGCAACTTGCTGTGTCTTTT CAAATCCAGGTGTCCCAAAGCA B1237_17_6 17q21.31 TCAAGGTGGGAACTGCGTCTTTT TTGTGGTAGGCAGCTTTGGGAA B1237_17_7 17q21.31 CCCCGGATGACGTAAAAGGAAA TGCAATAAGCCGCAACTGGAA B1237_17_8 17q21.31 TCCATGCTTTAAGAGCTTCCCCA TTTTACTTCCCAAGCCACCCCA B1240_X_1 Xp22.31 TGGGGAACTGGTAAATTTGGGG AATGAATGGTTTGGGGAGGCA B1240_X_2 Xp22.31 TGCCAATTTAAGAACCACCTGCC TGCATAAAGGTGTCATGTTCGCC B1240_X_3 Xp22.31 ACGCAGAAATCAAGGAGCATGTG AATCGAGAAACAACCCTCAGCCA B1240_X_4 Xp22.31 ACACTGTGCTGATGTTTGCCCA CACCCAATTCGCCCATTTCA B1240_X_5 Xp22.31 TGTTGGGGTTCTTTGGGAATGC TGCAAATATTCGGGAACTGGGG B1240_X_6 Xp22.31 CCAAATCTCCAAATGCCAGCCT ATTTTCCCTCCCCTGCCCATAA B1240_X_7 Xp22.31 TGGGACGTGGAATGAAGTGGAA TGGCAGCATTTGGGGTTTCA B1240_X_8 Xp22.31 TGTTCTGTGCCCATGAAGCAAAT CCTTCATGCAAAGGGTGTTGGA Referents- Kromosoom Forward praimer Reverse praimer praimerid Ref17 1p35.3 TGCGAAACTGCGTGGACATT ATGCGGAAGCCCATTTCCAT ZNF80 3q13.3 CTGTGACCTGCAGCTCATCCT TAAGTTCTCTGACGTTGACTGATGTG 48 LISA 2. Töös PCR-ks ja sekveneerimiseks kasutatud praimerite järjestused Praimeri nimi Järjestus 5' -> 3' DACH2-exon_1F GTTTGTTGAGCTTGAGCGTG DACH2-exon_1R GAAACGAGTGTCTCACCTGG DACH2-exon_2F CCCTTATGGCGCTAATGTTTGCCA DACH2-exon_2R TGCTGGGCAGTACGAAGAGACA DACH2-exon_3F AGCCTGCACTTGTACCCCCA DACH2-exon_3R TCCCACCTCTCTCCTGCCCC DACH2-exon_4F GGCCTTCCCAGAGGCAGCTT DACH2-exon_4R ACACACCCAGTTTTGTGAGGACAG DACH2-exon_5F GGCACAAGGAGACACTAAGAT DACH2-exon_5R TTTGCATGAAATTGACACCTTTG DACH2-exon_6F TCCTTTTGTGTTTCCTTTTGTGT DACH2-exon_6R CCAGCTTTTCCCTCTCCTCT DACH2-exon_7F AGATGCTTAGTAGAGGTGGCT DACH2-exon_7R GGTACAGGAAATGACATGCAGT DACH2-exon_8F ACTGCATGTCATTTCCTGTACC DACH2-exon_8R CTCCTGACCTCGTGATCCTC DACH2-exon_9F ACTGGCATCCCTATTTCATTGC DACH2-exon_9R TGCTTTGTTTACCTTGAGTGTGA DACH2-exon_10F CCCTTTAAATGGAATCAGGAACC DACH2-exon_10R CAGAAGCTCATCCCCACCTC MSH5_2F CCTCTGTGAATCGTTGCTTC MSH5_2R GGCTCCCAACCCTCTTTTAT BMP15_1Fb TTTTCTTGCCCCATCCTTGG BMP15_1Rb TCCACTTCTCTCCCTTCCAG BMP15_2Fb AAACCTCTGCTCTTGTTCCC BMP15_2Rb CTAGCCGTACTGTTGCTGTC 49 LISA 3. Patsiendil POF2 leitud 24,07 Mb suurune deletsioon Pilt on saadud patsiendi POF2 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud deletsiooni detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi X-kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Roosa värviga on tähistatud deletsioon. 50 LISA 4. Patsiendil POF20 leitud 1,35 Mb suurune deletsioon Pilt on saadud patsiendi POF20 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud deletsiooni detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi 1.-kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Roosa värviga on tähistatud deletsioon. 51 LISA 5. Patsiendil B1237 leitud 78 kb suurune duplikatsioon Pilt on saadud patsiendi B1237 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud duplikatsiooni detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi 17.- kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Sinise värviga on tähistatud duplikatsioon. 52 LISA 6. Patsiendil B1240 leitud 1,2 Mb suurune duplikatsioon Pilt on saadud patsiendi B1240 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud duplikatsiooni detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi X- kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Sinise värviga on tähistatud duplikatsioon. 53 LISA 7. Patsiendil POF20 leitud 13,24 Mb ja 29 Mb pikkused LOH alad Pilt on saadud patsiendi POF20 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud LOH alade detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi X-kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Roheka värviga on tähistatud LOH alad. 54 LISA 8. Patsiendil B1235 leitud 6,6 Mb suurune LOH ala Pilt on saadud patsiendi B1235 genotüpiseerimistulemuste analüüsil programmiga GenomeStudio versioon 2011.1 (Illumina Inc.). Pildil on toodud LOH ala detekteerimine, kasutades parameetrina vastavalt alleelide intensiivsuse suhet (B Allele Frequency) (üleval) ja normaliseeritud signaaliintensiivsusi (logR ratio) (all). Graafiku X-teljel paiknevad HumanCytoSNP-12 kogu genoomi BeadChip mikrokiibi 6.-kromosoomil leiduvad SNP proovid. Y-teljel on SNP-idele vastavad signaaliintensiivsused. Roheka värviga on tähistatud LOH ala. 55 Lihtlitsents lõputöö reprodutseerimiseks ja lõputöö üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Mina, Kati Hiieleek (sünnikuupäev: 06.05.1988), 1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) enda loodud teose DNA koopiaarvu muutused primaarse munasarjade puudulikkusega naistel, mille juhendaja on prof.Ants Kurg, Ph.D, 1.1. reprodutseerimiseks säilitamise ja üldsusele kättesaadavaks tegemise eesmärgil, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace-is lisamise eesmärgil kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni; 1.2. üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Tartu Ülikooli veebikeskkonna kaudu, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace´i kaudu kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni. 2. olen teadlik, et punktis 1 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile. 3. kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei rikuta teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse seadusest tulenevaid õigusi. Tartus, 27.05.2013 56