Pagaripärmis töötavad promootorid

Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae ekspressioonisüsteemides kasutatavad promootorid võib jagada:

1. konstitutiivsed promootorid (vt. tabel 9)

Sellesse rühma kuuluvad näiteks glükolüüsis osalevate ensüümide promootorid: ADH1 (alkohol-dehüdrogenaas I), PGK1 (3-fosfoglütseraat kinaas) ja TDH (glütseeraldehüüd-3-fosfaat dehüdrogenaas). Algselt kirjeldati neid kui konstitutiivseid promootoreid. Hiljem selgus, et nad on glükoosi poolt indutseeritavad. Need promootorid tagavad kõrge ekspressioonitaseme. Mõned promootorid on konstitutiivsed vaid teatud rakutüüpides. Näiteks -faktorit koderiva geeni MF1 promootor töötab vaid MAT paardumistüübiga rakkudes.

Tabel 9. Pagaripärmis kasutatavad konstitutiivsed promootorid.

Promootor
Päritolu
Ekspressiooni tase
Eripära
ADH1
alkohol-dehüdrogenaas I
kõrge
 
PGK1
3-fosfoglütseraat kinaas
kõrge
glükoosi poolt indutseeritav (10 korda); kuumašoki poolt indutseetitav
PYK1
püruvaat kinaas
kõrge
glükoosi poolt indutseeritav (20 korda)
MF1
feromoon -faktor
  töötab ainult MAT rakkude

2. reguleeritavad promootorid (vt. tabel 10) 

Reguleeritavad promootorid jagatakse omakorda:

Galaktoosi poolt reguleeritud. GAL1 promootor on kõige enam kasutatatud indutseeritav promootor pagaripärmis. See promootor on hästi kontrollitav ning tagab kõrge ekspressioonitaseme. Promootor sisaldab UASG elementi, millele seostub transkriptsioonifaktor Gal4. Kui galaktoosi söötmes ei ole, siis Gal80 seostud Gal4-ga. Galaktoosi lisamisel Gal4 vabaneb ning aktiveerib transkiptsiooni. GAL promootor on tugevasti represseeritud glükoosi poolt.

Ekspressiooni induktsiooni on võimalik teostada kolmel erineval viisil:

  • rakke kasvatatakse mitte-represseerivates tingimustes (näit. kasutatakse süsiniku allikana rafinoosi), galaktoosi lisamisel toimub kiire induktsioon
  • rakke kasvatatkse glükoosi sisaldavas söötmes, rakud pestakse ja külvatakse galaktoosi sisaldavasse söötmesse
  • rakke kasvatatakse söötmes, mis sisaldab glükoosi ja galaktoosi, rakud kasutavad eelistatult glükoosi, kui seda söötmes enam ei ole, siis toimub galaktoosi poolt induktsioon.

Fosfaadi poolt reguleeritud. PHO5 promootor on reguleeritav anorgaanilise fosfaadi poolt. Ta on kõrgelt ekspresseeritud kui fosfaadi tase rakus on madal ning represseeritud kui fosfaati rakus on palju. PHO5 promootorelement on 400 nukleotiidi pikkune ning sisaldab kahte UAS järjestust, millele seonduvad transkriptsioonifaktorid Pho4 ja Pho2.

Glükoosi poolt represseeritud. Sellesse rühma kuuluvad geenide, mis osalevad sahharoosi ja galaktoosi metabolismis, promootorid - ADH2, CYC1, SUC2. ADH2 promootorelement sisaldab kahte UAS järjestust. Kui söötmes puudub fermenteeritav süsiniku allikas (näit. glükoos), siis nendele järjestusele seostuvad transkriptsioonifaktorid Adr1 ja Cat8 ning aktiveeritakse Adh2 ekpressioon. Glükoosi lisamisel Adr1 ja Cat8 rakkudes enam ei ekspresseerita, mistõttu ei aktiveerita ka Adh2 ekspressiooni.

Tabel 10. Pagaripärmis kasutatavad reguleeritavad promootorid.

Promootor
Päritolu
Regulatsioon
Ekspressiooni tase
Eripära
GAL1
galaktokinaas
galaktoosi poolt indutseeritav (1000 korda)
kõrge
glükoosi poolt represseeritav
ADH2
alkohol-dehüdrogenaas II
glükoosi poolt represseeritav (100 korda)
keskmine  
PHO5
happeline fosfataas
fosfaadi poolt represseeritav (200 korda)
nõrk/keskmine
 
CUP1
metallotioniin
Cu2+ poolt indutseeritav (20 korda)
nõrk
 
MET25
metioniini ja tsüsteiini süntaas
metioniini ja tsüsteiini poolt represseeritav
nõrk