Characterization of cell-penetrating peptides: assessment of cellular internalization kinetics, mechanisms and bioactivity

Date

2011-05-18

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Üha enam uusi farmakoloogiliselt huvipakkuvaid molekule või ravimikandidaate, näiteks oligonukleotiidid ja terapeutilised valgud, omavad toimet rakusiseses keskkonnas. Paraku enamik neid molekule ei suuda ilma vastavate transportvektorite abita rakumembraani ületada ega jõua seega oma sihtmärkideni. Erinevaid võimalikke transportsüsteeme, millega nende molekulide rakkudesse jõudmist parandada, on mitmeid. Nendest üheks on rakkusisenevad peptiidid (RSP-d). Nende lühikeste amfipaatsete/katioonsete peptiidide rakkudesse sisenemise mehhanismid on aga siiani arutluse all. Mehhanisme tuleb täpselt tunda, kuna rakkudesse sisenemise tee võib sõltuda näiteks RSP tüübist, sellega seondunud lastmolekulist, uuritava rakutüübi membraani koostisest ja sihtmärgiks olevast raku piirkonnast. Käesolevas doktoritöös on kirjeldatud mitme erineva laialdaselt kasutusel oleva RSP tsütoplasmasse jõudmise kineetikat ja mehhanisme, kasutades fluorestsentsi kustutamisel ja bioluminestsentsil põhinevat meetodit. On püstitatud hüpotees, et erinevad sisenemisteed võivad üksteist kompenseerida, mistõttu on RSP-de mehhanismide uurimisel kineetilised mõõtmised informatiivsemad kui ühes ajapunktis sooritatud eksperimendid. Me leidsime, et teatud juhtudel mõjutab kindlate endotsütoosiradade inhibeerimine ainult RSP-de rakkudesse sisenemise kineetilist profiili, kuid mitte nende summaarset sisenemist (või vastupidi). Erinevat tüüpi RSP-de sisenemisprofiilid võivad olla väga erinevad, meenutades teatud juhtudel isegi rakumembraane vabalt läbivaid väikseid molekule. Sellest hoolimata sõltub kõikide testitud RSP-de rakkudesse jõudmine väga tugevalt endotsütoosi inhibiitoritest. Sellest tulenevalt võib järeldada, et erinevad rakkudesse sisenemise teed on samaaegselt aktiivsed. Lisaks, kasutades rakkusisenevat tsütokroom c sarnast peptiidi, näitasime, et loomuomase aktiivsusega RSP-de disainimine võib olla edukas viis suurendamaks RSP-de rakendusalasid.
Cell-penetrating peptides (CPPs) are relatively short cationic and often amphipathic peptides capable of crossing the cell membrane and delivering their associated cargo molecules to respective intracellular targets. However, which exact pathways are of the most vital importance in this process remains under discussion to date because the comprised routes may depend for example on the CPP type, nature of the delivered cargo molecule, cell membrane constituents of a given cell line and the target cellular compartment. In this thesis, several commonly used CPPs are characterized in terms of their cytoplasmic cargo delivery kinetics and mechanisms using two different – quenched fluorescence and bioluminescence based – assays. Because different uptake routes may compensate each other, as it has been hypothesized, the kinetic assays provide more valuable information in shedding light on the CPP mechanisms as compared to end-point studies. Indeed, we found that in some cases inhibition of an uptake route in serum-devoid environment results only in a change in internalization kinetic profile, not the total uptake level, or vice versa. Further it was discovered that in complete cell growth media different types of CPPs display clearly distinct concentration dependent uptake profiles, which in some cases resemble the internalization of a membrane permeable positive control. CPP uptake rate kinetic profiles vary remarkably and depend strongly on the used endocytosis inhibitors. This supports the hypothesis of several uptake pathways being active simultaneously. By using a cell permeable cytochrome c mimicking apoptosis inducing peptide, it is also demonstrated in this thesis that CPPs can be designed to have significant inherent biological activities. This strategy would in principle allow implementation of drug delivery systems in which the delivered cargo and the delivery vector can be designed to have synergistic effects – either the desired therapeutic (e.g. apoptosis inducing) or other (e.g. increased endosomal release) effects.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatisoone.

Keywords

dissertatsioonid, rakumembraan, bioloogiline transport, peptiidid, endotsütoos, penetratsioon, dissertatsioonid, cell membrane, membrane transport, peptides, endocytosis, penetration

Citation