Cell-penetrating peptide mechanism studies: from peptides to cargo delivery

Date

2014-05-19

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Aastatepikkune molekulaar- ja biokeemia areng koos inimese genoomi sekveneerimisprojektiga on oluliselt suurendanud meie arusaama paljude haiguste mehhanismidest ning on aidanud tuvastada mitmeid haigustega seotud geene. Nende haiguste raviks võib kasutada geeniteraapiat, mis seisneb geeni ekspressiooni inhibeerimises, vigase geeni väljavahetamises või geeni transportimises soovitud rakkudesse. Kuna paljud ravimimolekulid ei ole ise võimelised rakkudesse sisenema, tuleb kasutada transportmolekule, mis jagunevad viirusel põhinevateks ja mitte-viiruslikeks. Viirustel põhinevad transporterid on efektiivsed, kuid omavad tihti kõrvaltoimeid. Enim uuritud mitte-viiruslikud ravimite transportvektorid põhinevad hüdrofoobsetel süsteemidel, nagu liposoomid, polümeerid ja mitsellid. Viimasel ajal on üha enam hakatud kasutama rakkudesse sisenevaid peptiide (RSP), mis on võimelised transportima rakkudesse efektiivselt ja ilma kõrvaltoimeteta erinevaid bioloogiliselt aktiivseid molekule, alates madalmolekulaarsetest ravimitest kuni kõrge molekulmassiga negatiivselt laetud nukleiinhapeteni. Alates nende avastamisest 20 aastat tagasi on loodud üle saja erineva RSP, mis erinevad üksteisest füsikokeemiliste omaduste ja rakkudesse sisenemise mehhanismide poolest. Selleks, et sõeluda välja kõige efektiivsemad transportvektorid on vajalik välja selgitada nende täpne sisenemismehhanism, sisenemiskineetika ja teised molekulide transpordi efektiivsust määravad omadused. RSP-de rakku transportimises osalevad mitmed erinevad mehhanismid, mille kasutuse ulatus oleneb paljudest erinevatest asjaoludest, sealhulgas RSP tüüp ja kontsentratioon, transporditava molekuli tüüp, uuritava raku membraani struktuur, rakusisene sihtmärk ning muud katsetingimused. Samuti on kindlaks tehtud, et mitu mehhanismi võivad olla aktiivsed samaaegselt. Antud töös uuriti mitme laialdaselt kasutatava RSP rakkudesse sisenemise mehhanisme kasutades fluorestsentsil ja bioluminestsentsil põhinevaid meetodeid, mis võimaldavad määrata RSP-de tsütoplasmasse jõudmise kineetikat. Lisaks uuriti, kuidas mõjutavad hüdrofoobsed interaktsioonid ja nanoosakeste omadused RSP-de võimet transportida erinevaid nukleiinhappeid rakkudesse. Koos kasutati nii RSP-de rakkudesse sisenemise kineetika määramist võimaldavaid meetodeid kui ka lähenemist, mille abil saab hinnata, millist endotsütoosi rada antud RSP rakku sisenemiseks vajab. Kahe meetodi koostöö tulemusel saab detailsemat informatsiooni RSP-de sisenemise mehhanismide kohta kui lihtsamate lõpppunkti mõõtmistega, kuna sama lõpptulemust omavad RSP-d võivad omada täiesti erinevaid kineetilisi profiile. Leidsime, et endotsütoosi radade inhibeerimine mõjutab nii üldist rakku sisenemise taset kui ka kineetilist profiili. Iga uuritud RSP puhul oli mõju ulatus erinev. Samuti selgus, et valitud peptiidide rakku sisenemise profiil võib olla väga erinev, sõltudes RSP kontsentratsioonist ja endotsütoosi inhibiitoritest. Mõlemad tulemused näitavad, et nende peptiidide rakku sisenemisel on samaaegselt kasutuses mitu endotsütoosi rada. RSP-de abil on võimalik suure molekulmassiga negatiivselt laetud nukleiinhappeid pakkida kindla suurusega nanoosakestesse. Kuna need kompleksid moodustuvad läbi mitte-kovalentsete sidemete, määrati ka nende füsikokeemilised omadused. Uuriti, kuidas mõjutavad erinevad hüdrofoobsed modifikatsioonid RSP transportan 10 võimet transportida rakkudesse splaissingut muutvaid oligonukleotiide. Määrati moodustunud osakeste suurus ning RSP hüdrofoobsuse vahemik, kus oligonukleotiidide transport on kõige efektiivsem. Et teha kindlaks, kuidas moodustuvad RSP-siRNA nanokompleksid, määrati nende osakeste suurus ja moodustumisel eralduva soojuse hulk ning korreleeriti saadud tulemused siRNA transpordi efektiivsusega erinevatel RSP kontsentratsioonidel. Viies läbi mõõtmisi nii endosoomide happelise pH kui ka raku füsiloogilise pH juures, selgus, et komplekside suurus ei olene pH muutusest. Samas varieerub RSP hulk kompleksis umbes kaks korda, millest järeldasime, et RSP ja siRNA vahel on dünaamiline, pH-st sõltuv, tasakaal. Antud doktoritöös esitatud tulemused toovad välja RSP-de rakku sisenemise mehhanismide uurimisel kasutatavate kineetiliste meetodite eelised ning mitte-kovalentselt moodustunud RSP-nukleiinhappe nanoosakeste füsikokeemiliste parameetrite olulisuse RSP-de aktiivsuse jaoks. Kokkuvõtvalt käsitletakse doktoritöös olulisi aspekte, mis on vajalikud uudsete transpordivektorite arendamiseks ja kasutuseks biotehnoloogilistes ning kliinilistes rakendustes.
Advances in biochemistry and molecular biology over the years, together with the human genome sequencing project, have increased our understanding of the genetics of numerous diseases and has led to the identification of many disease-causing genes. In order to treat these diseases by inhibiting, modulating or introducing new genes to the affected cells, appropriate drugs need to be transported into their point of action. Due to their physicochemical properties, many drugs are unable to enter cells and require delivery vectors which are efficient, safe, and resistant to degradation. Generally, there are two types of vehicles, viral and non-viral. The most studied non-viral delivery vectors are liposome-, polymer- and micelle- based systems, and more recently, cell-penetrating peptides (CPPs) have gained interest as well. CPPs are short amino acid sequences, consisting of up to 30 amino acids, capable of delivering bioactive cargos inside cells in an efficient and non-toxic fashion. As of today, more than one hundred CPPs are available with varying physicochemical properties and internalization mechanisms. In order to sift out the most effective delivery vectors, their exact uptake mechanisms, kinetics and cargo delivery properties need to be determined. Several cellular internalization pathways have been proposed for these molecules and the majority of studies conclude that CPPs utilize several uptake routes simultaneously with some favored more than others. The reports vary as internalization depends on the type and concentration of the CPP, the nature of the cargo, the specific cell membrane composition of the studied cell line, the intracellular target and other experimental conditions. In the present thesis, uptake mechanisms of several common CPPs are characterized by studying their cytosolic uptake kinetics using fluorescent and bioluminescent cargos. In addition, transfection mechanisms of non-covalent CPP-oligonucleotide nanocomplexes are investigated by assessing the effects of hydrophobic CPP modifications and complex formation on their efficacy. Kinetic uptake studies coupled with endocytic pathway studies enable to determine the involvement and extent of each uptake route in CPP internalization in a more transparent fashion compared to single-endpoint methods. We therefore assessed the cytoplasmic uptake kinetics and mechanisms of several common CPPs using a quenched fluorescence assay and a semi-biological bioluminescence assay. The chosen peptides displayed very different and concentration dependent uptake kinetic profiles that were strongly affected by endocytosis inhibitors. Both of the studies support the simultaneous involvement of several endocytotic pathways in their cellular uptake. Physicochemical studies of CPP-cargo complexes can reveal the uptake mechanisms of these dynamic non-covalent conjugates that can be used in the further development of more potent delivery vectors. We assessed the role of CPP hydrophobicity in the delivery of splice-correcting antisense oligonucleotides (SCOs). In addition, we characterized the interactions between CPPs and siRNA to shed light on their transfection mechanism. To study the hydrophobic effects on transportan 10 mediated splice-correcting antisense oligonucleotide delivery, we conjugated different fatty acids to the peptide and measured how these modifications affect the hydrodynamic size and transfection efficacy of CPP-oligonucleotide complexes. We determined the optimal hydrophobic CPP modification and nanocomplex size for maximal splice correction efficiency. In order to elucidate the role of complex formation in CPP-mediated siRNA transfections, we utilized isothermal calorimetry in conjunction with dynamic light scattering studies. The results revealed that although the complexes are with the same size at acidic and physiological pH, the amount of CPPs in the nanocomplexes varies, indicating that the dynamic equilibrium between the peptides and the cargo is pH-dependent. The results presented in this thesis exemplify the advantage of kinetic assays as well as the importance of studying the physicochemical properties of non-covalent CPP-oligonucleotide nanocomplexes in understanding CPP and CPP-cargo uptake mechanisms. This thesis brings out crucial aspects that have to be accounted for when designing novel delivery vectors for biotechnological and clinical applications.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.

Keywords

peptiidid, penetratsioon, bioloogiline transport, endotsütoos, kineetika, peptides, penetration, biological transport, endocytosis, kinetics

Citation