Studies on the Role of Papillomavirus E2 Proteins in Virus DNA Replication

Date

2016-11-11

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Papilloomiviirused on selgroogsete seas laialt levinud väikesed, koespetsiifilised DNA viirused, mis nakatavad naha või limaskesta epiteelkoes asuvaid keratinotsüüte. Inimese papilloomiviiruse (HPV) suurim meditsiiniline tähtsus seisneb tema võimes põhjustada mitmeid pahaloomulisi kasvajaid, sealhulgas emakakaelavähki, mis on naiste seas esinemissageduselt teisel kohal rinnavähi järel ning kõrge suremusega. HPV-d jagunevad kõrge ja madala vähitekke riskiga viirusteks. Madala riskiga viirused (HPV11, HPV6 jt) põhjustavad healoomulisi vohandeid, näiteks soolatüükaid ja kondüloome, mis tervetel inimestel kaovad immuunsüsteemi toimel aasta või paari jooksul. Pahaloomulised kasvajad võivad aja jooksul areneda rakkudest, mis on nakatunud kõrge riski HPV-dega (HPV16, HPV18 jt). Praeguseks saadaolevad HPV-vastased vaktsiinid on küll efektiivsed uue nakkuse ärahoidmisel, kuid ei paku paraku kaitset kõigi kõrge riskiga HPV-de osas, samuti on nad kulukad ning halvasti kättesaadavad arengumaades, kus leiab aset 80% emakakaelavähist tingitud surmadest. Kuigi maailmas on miljoneid HPV-ga nakatunud inimesi, ei ole tänaseks veel välja töötatud spetsiifilist viirusvastast ravi. Seetõttu on HPV-alane uurimistöö endiselt päevakorral, et paremini mõista viiruse onkogeensust ja leida uusi viise nakkuse ärahoidmiseks ning olemasolevate ravivõtete täiendamiseks. Papilloomiviiruse E2 valk osaleb viiruse DNA replikatsiooni algatamisel koos viiruse peamise replikatsioonivalguga E1. Lisaks reguleerib E2 valk viiruse varajaste geenide avaldumist ning mängib olulist rolli viiruse genoomi episomaalsel säilimisel kinnitades rakkude jagunemise käigus viiruse genoomid raku kromosoomide külge. Samas ekspresseerib papilloomiviirus lisaks täispikale E2 valgule ka sama valgu lühikesi vorme, mille ülesandeks on reguleerida täispika E2 valgu funktsioone. Eelnevalt on meie grupp näidanud, et täispikast ja transaktivatsiooni domeeni mitteomavast lühikesest E2 valgust moodustunud E2 heterodimeerid on võimelised toetama viiruse varajaste geenide transkriptsiooni ja DNA replikatsiooni. Antud töö esimeses publikatsioonis uurisin detailsemalt E2 heterodimeeri paiknemist rakus ning selle rolli viiruse DNA replikatsioonil veise papilloomiviiruse tüüp 1 (BPV1) E2 näitel. Leidsin, et BPV1 E2 heterodimeer paikneb sarnaselt täispika E2 homodimeerile rakulise kromatiini fraktsioonis, mis on kooskõlas E2 heterodimeeri võimega toetada viiruse geenide transkriptsiooni ja DNA replikatsiooni. Lisaks näitasin, et BPV1 E2 heterodimeer on võimeline siduma viiruse E1 valgu replikatsiooni alguspunktile viiruse genoomis ning toetama viiruse DNA replikatsiooni initsiatsiooni. Samas ei suutnud E2 heterodimeer säilitada viiruse genoomi jagunevates rakkudes pikema aja jooksul. Käesoleva tööga seotud järgnevas publikatsioonis uurisin HPV18 ja HPV11 E2 heterodimeeride osalust viiruse DNA replikatsioonil ning leidsin, et sarnaselt BPV1 E2 heterodimeerile toetab ka HPV E2 heterodimeer viiruse DNA replikatsiooni initsiatsiooni, kuid pole võimeline tagama viiruse genoomi pikaajalist säilimist rakus. Seega on E2 heterodimeeri võime toetada viiruse genoomi replikatsiooni initsiatsiooni konserveerunud erinevate papilloomiviiruste seas ning täispika E2 homodimeeri ja E2 heterodimeeri vaheline dünaamika on oluline reguleerimaks viiruse DNA paljundamist ja säilumist viirusega nakatunud rakkudes. HPV E2 heterodimeer oli võimeline ka maha suruma viiruse varajaste geenide avaldumist samas ulatuses kui täispika E2 homodimeer. Lisaks leidsin, et HPV18 on võimeline kodeerima transaktivatsiooni domeeni mitteomavat E8^E2 valku, mille üheks rolliks on inhibeerida HPV18 genoomi replikatsiooni, käitudes seega sarnaselt teiste papilloomiviiruste seas tuvastatud E8^E2 valkudega. Käesoleva töö kolmandaks tahuks on papilloomiviiruse DNA replikatsiooni toimumiskoha uurimine rakus. Leidsin, et HPV replikatsioonikeskuste paiknemine raku tuumas kattub osaliselt tuumsete struktuuriüksuste ND10 asetusega. Nimelt paiknesid HPV18 ja HPV11 replikatsioonivalgud E1 ja E2 kas osaliselt koos või kõrvuti ND10 struktuursete valkudega PML ja DAXX, viidates sellele, et sarnaselt teistele raku tuumas replitseeruvatele DNA viirustele (herpesviirused, adenoviirused jt) algatab ka HPV oma replikatsioonitsükli ND10 läheduses. Kuigi ND10 mängib olulist rolli rakku sisenevate viiruste replikatsiooni inhibeerimisel, on mitmed viirused leidnud viise ND10 inhibeerivast toimest vabanemiseks, sealhulgas ND10 struktuuri lõhkumise või ND10 struktuursete valkude lagundamise läbi. Üks ND10 valkudest, mis inhibeerib mitmete ND10 läheduses paljunevate viiruste replikatsiooni, on DAXX valk. Oma töös leidsin, et DAXX valk moduleerib ka HPV18 ja HPV11 varajaste geenide avaldumist ja DNA replikatsiooni. Üllatuslikult ei omanud aga DAXX valk negatiivset toimet, vaid mõjutas positiivselt HPV geeniekspressiooni ja genoomi lühiajalist replikatsiooni uuritavates rakkudes. Kokkuvõtvalt uurisin töö käigus papilloomiviiruse peamise regulaatorvalgu E2 rolli viiruse DNA replikatsioonil ning viiruse replikatsiooni toimumiskohta rakus ja sellega seotud ühe rakulise faktori, DAXX valgu, mõju viiruse replikatsioonile.
Papillomaviruses are small double-stranded DNA viruses that infect the epithelial tissue of a wide variety of vertebrates. The viruses are tissue-specific and infect the keratinocytes either in the cutaneous or internal mucosal epithelium. Human papillomaviruses (HPVs) are highly prevalent pathogens of tremendous medical importance due to their association with several human cancers, including cervical cancer which is the second most common cancer in women worldwide and has a high mortality rate. HPVs are divided into low-risk and high-risk categories based on the spectrum of lesions they are associated with and the potential of these lesions to progress to cancer. Low risk HPVs (i.e. HPV11, HPV6) cause benign epithelial hyper-proliferative conditions (i.e. warts, condylomas) which in healthy individuals are frequently cleared by the immune system in less than a year or two. Persistent infections by high-risk HPVs (i.e. HPV16, HPV18) can at low frequency progress to high grade dysplasias and carcinomas. Available prophylactic HPV vaccines are effective against new infections, but have several limitations, including incomplete coverage of all high-risk HPVs, high cost and limited availability in developing countries, which account for 80% of the deaths due to cervical cancer. In addition, they cannot cure the millions of people that are already infected. There is also no virus-specific treatment currently available. Thus, there is still a need for ongoing biomedical research into HPVs and their associated diseases to lead to the development of better strategies for prevention and disease treatment, which are necessary to complement current methods of disease management. The papillomavirus life cycle is regulated by a family of proteins encoded by the E2 gene. The full-length E2 protein participates in the initiation of viral DNA replication by loading viral helicase E1 onto the viral origin of replication and in viral genome episomal maintenance by tethering viral genomes to host mitotic chromosomes during cell division. E2 also regulates transcription of viral early promoters. In addition to the full-length E2 protein, all papillomaviruses encode shorter forms of E2 which regulate the functions of the full-length E2 protein. Previously, our group has shown that E2 heterodimer formed between the full-length and truncated E2 proteins functioned as an effective transcriptional activator and was able to support papillomavirus DNA replication. In the first publication of this thesis I investigated in detail the cellular localization and the replication function of the E2 heterodimer by using the bovine papillomavirus type 1 (BPV1) E2 protein as a model. I determined that BPV1 E2 heterodimer with single transactivation domain localized similarly to the full-length E2 homodimer into cellular chromatin which is in agreement with the results that the E2 heterodimer is able to support papillomavirus DNA replication and transcription. I found that BPV1 E2 heterodimer is able to load the viral helicase E1 to the origin of replication in order to initiate viral DNA replication. Although the E2 heterodimer was able to initiate papillomavirus DNA replication, it could not maintain it for a long time. In the second publication I studied the replicative activity of HPV18 and HPV11 E2 heterodimers and found that HPV E2 heterodimer supports the initiation of viral DNA replication similarly to the BPV1 E2 heterodimer, but is not able to ensure the stable maintenance of viral genomes in dividing cells. Thus, the replication initiation function of E2 heterodimers is conserved between different types of papillomaviruses. The dynamic change in the balance between the full-length E2 homodimers and E2 heterodimers are important for the regulation of virus DNA replication and viral genome maintenance in virus-infected cells. The HPV E2 heterodimer was also able to repress expression of viral early genes to the same extent as the full-length E2 homodimer. In addition, I determined that HPV18 has the capacity to encode a truncated E2 protein, E8^E2, which serves as a negative regulator of HPV18 genome replication similarly to E8^E2 proteins of other papillomaviruses identified so far. In the third part of the thesis I studied the cellular site of papillomavirus DNA replication. I found that HPV replication compartments partially co-localize with subnuclear structures ND10 in the cell nucleus. Specifically, HPV18 and HPV11 replication proteins E2 and E1 partially co-localized or were located adjacent to ND10 structural proteins PML and DAXX. This suggested that similarly to other nuclear replicating DNA viruses, HPV also begins its replicative cycle near the ND10. The ND10 has been implicated in cellular response dedicated to counter invasion of viruses by inhibiting their replication. However, several viruses encode proteins that cause major changes in ND10 by a variety of mechanisms that either affect ND10 structural integrity or involve degradation of restrictive ND10 proteins. One of the ND10 proteins, that inhibit the replication of several viruses at ND10, is the DAXX protein. In this study, I found that the DAXX protein also modulates early gene expression and transient DNA replication of HPV18 and HPV11. Surprisingly, however, DAXX did not play a restrictive role but appeared to have a positive role in the regulation of HPV transcription and replication in our model system. In summary, I studied the role of the master regulator E2 protein in papillomavirus DNA replication, the cellular site where virus DNA replication takes place and the effect of one of the proteins associated with this site, the DAXX protein, on virus replication.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.

Keywords

papilloomiviirused, valgud, viirusvalgud, DNA, replikatsioon, Papillomavirus, proteins, viral proteins, DNA, replication

Citation