Allosteric effects in reactions catalyzed by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit

Date

2009-03-30T05:35:50Z

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Allosteric regulation of enzyme activity is widely used by living cells to control diverse physiological phenomena. In this dissertation attention has been paid to the possibility of allosteric regulation within monomeric proteins, using the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit (PKA, EC 2.7.11.11) as a model enzyme. Bisubstrate character of the PKA catalyzed reaction and highly dynamic structure of this protein made this enzyme an excellent candidate for this study. Kinetic methods of analysis were adopted for characterization of allosteric cooperativity between different binding sites of PKA and were used in the case of peptide substrates as well as reversible inhibitors of PKA. The allosteric effects were quantified in terms of the interaction factor which reflects the magnitude of the allosteric feedback between distinct binding sites, and the principle “better binding: stronger allostery” was formulated on the basis of these data. This interrelationship was further formalized in terms of linear free-energy relationships which characterize the role of allostery in enzyme specificity. It was revealed that the enzyme affinity for good substrates can be additionally enhanced by allostery, while inversion of the type of the allosteric effect occurred with bad substrates. Similar kinetic analysis was performed with three inhibitors, which all revealed asymmetric inhibitory effect relatively the two substrates of the PKA catalyzed reaction, demonstrating the presence of allosteric interactions between all these enzyme-bound ligands. These data also revealed that binding effectiveness of inhibitors was governed not only by structure of these molecules, but also by binding properties of substrates present. Finally, common linear free-energy relationship was obtained to describe allosteric effects for different pairs of ligands, independently whether their binding with the enzyme results in the phosphorylation reaction or blocks the active site. Thus the allosteric mechanism provides functionally flexible way for up- or down-regulation of enzyme activity and may have multiple implications in control of cellular processes in general. Ensüümide aktiivsuse allosteerilise regulatsiooni teel kontrollivad elusrakud mitmesuguseid füsioloogiliselt olulisi protsesse. Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida allosteerilise regulatsiooni võimalikkust monomeersete ensüümide korral, kasutades cAMP-sõltuvat proteiinkinaasi katalüütilist alaühikut (PKA, EC 2.7.11.11) kui selleks sobilikku mudelensüümi. See ensüüm katalüüsib bi-substratset reaktsiooni ja teda iseloomustab struktuuri suur dünaamilisus, mis on allosteeria esinemise eelduseks. Uuringute teostamiseks kasutati ensüümkineetika meetodeid, muutes neid sobilikuks substraatide fosforüleerimise reaktsioonil ja ensüümi inhibeerimisel ilmnevate allosteeriliste efektide iseloomustamiseks. Allosteerilisi toimeid iseloomustati kvantitatiivselt interaktsioonifaktorite abil, mis võrdlevad substraatide või inhibiitorite sidumise efektiivsust vabale ensüümile ja ensüümi kompleksile ühega neist ligandidest. Saadud tulemustest lähtudes formuleeriti seaduspärasus „parem sidumine: tugevam allosteeria“. Allosteeria ja ligandi sidumise efektiivsuse vahelise seose kirjeldamiseks kasutati vabaenergia lineaarsuse põhimõttel koostatud kvantitatiivseid sõltuvusi, mis võimaldasid täpsustada allosteeria rolli ensüümi toime spetsiifilisuses. Ilmnes, et allosteeria suurendab ensüümi afiinsust heade substraatide suhtes. Samas toimub aga halbade substraatide korral allosteerilise efekti inversioon, mis vähendab ensüümi afiinsust nende suhtes. Seega täidab allosteeria monomeerse ensüümi korral sama rolli, mida märgivad ära klassikalised multimeersete ensüümide jaoks loodud mudelid: suurendab/vähendab ensüümi toime efektiivsust kui seostub õige ligand. Sama kineetiline analüüs tehti ka allosteeriliste efektide iseloomustamiseks kolme erineva PKA inhibiitori korral, mille toime oli asümmeetriline erinevate substraatide suhtes. Leiti, et inhibeeriv toime oleneb lisaks inhibiitori struktuurile ka reaktsioonil osalevate teiste ligandide struktuurist. Koostati vabaenergia sõltuvus, mis seob allosteeriat kahe ligandi seostumise efektiivsusega, sõltumatult nende ligandide toime iseloomule. Tehti järeldus, et allosteeria saab olla aktiivsuse regulaator ka monomeerse ensüümi korral ning see mehhanism võib omada olulist rolli biokeemiliste nähtuste regulatsiooni seisukohast ka üldisemas plaanis.

Description

Keywords

Citation