Development and analysis of novel alphavirus-based multifunctional gene therapy and expression systems

Date

2013-12-18

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomiga viirused sugukonnast Togaviridea. Looduses levivad alfaviirused lülijalgsete vektorite abil. Selgroogsetel peremeestel põhjustavad nad erinevaid haigusi nagu entsefaliit ja artriit. Tänu oma headele omadustele on alfaviirused kujunenud perspektiivseteks tööriistadeks geeni- ja kasvajavastaste vaktsiinide väljatöötamisel. Uurimus töös kajastati SFV genoomi cDNA-l põhineva infektsioonilise DNA/RNA kihtvektori ning selle alusel valmistatud rekombinantsete vektorite kavandamist, valmistamist ja iseloomustamist. Esmaseks eesmärgiks oli välja selgitada põhjused, mis muudavad pSP6-SFV4 bakterirakkudes geneetiliselt ebastabiilseks. Tehti kindlaks, et seda põhjustab SFV membraanivalkude soovimatust ekspressioonist tulenev toksiline mõju bakterile. See probleem lahendati liites SFV lugemisraami introni, mis takistas toksiliste valkude tootmist bakteris kuid ei mõjutanud negatiivselt loodud DNA/RNA kihtvektorist vabanenud viiruse omadusi. Loodud töövahendit kasutati järgnevates uurimustöödes, mille ühiseks eesmärgiks oli vektorite ohutuse tagamine. Selleks kavandati ja konstrueeriti SFV põhised DNA/RNA kihtvektorid milles rekombinantse SFV genoomi vabanemist takistavad viiruse kodeerivasse alasse sisse viidud defektsed intronid, mis suruvad efektiivselt maha viiruse infektsioonilise RNA vabanemist ja splaisingu mustrit muutvate oligonukleotiidide lisamine vähendab oluliselt või kõrvaldab selliste intronite põhjustatud negatiivse mõju viirus-vektorile. Raku micro-RNAde kasutamine DNA/RNA kihtvektorites võimaldab viiruse paljunemist kontrollida ka peale tema infektsioonilise genoomi vabanemist, mis on saavutatav liites viiruse genoomi raku miRNAde sihtmärk-järjestusi.
Alphaviruses are small positive-strand RNA viruses that make up the genus Alphavirus of the family Togaviridae. Alphaviruses infect a large variety of cell types within organisms. This property makes it possible to use these viruses to develop replication-competent vectors that may have clinical applications. This thesis is based on three studies dedicated to the development and analysis of infectious DNA/RNA layered clone of SFV4 and a panel of vector constructs based on this clone. The first aim was identifying and subsequently eliminating the reasons for the instability of pSP6-SFV4 in bacterial cells. It was found that the instability of this plasmid was caused by the toxic effects of SFV envelope proteins that were cryptically expressed in bacterial cells. The problem was eliminated by interrupting the corresponding reading frame with an intron; this manipulation proved to have no adverse effect on the SFV4 rescued from the obtained DNA/RNA layered vector. A central problem hampering the medical use of alphavirus vectors is concern over their safety issues associated with the fact that alphavirus-based vectors are very difficult to regulate and control. Therefore we were designed, constructed and tested DNA/RNA layered vectors, in which the rescue of replication-competent RNA genome of SFV was efficiently inhibited by aberrantly spliced introns and the delivery of splice-switch oligonucleotides completely or almost completely restored the infectivity of the vector. Using cellular miRNAs to target the genomes of recombinant alphavirus may also represent a viable method to control rescue as well as replication and spread of the vector. It was found that repression of virus replication can be achieved by the insertion of different types of miRNA targets, including those naturally occurring in cellular mRNAs.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.

Keywords

alfaviirus, viirusgeneetika, geeniekspressioon, molekulaarkloonimine, micro RNA, alphavirus, viral genetics, gene expression, molecular cloning

Citation