Fenotüübid
Fenotüüp on tunnuste vaadeldav kogum või kitsamas mõttes üksiku uuritava tunnuse ilmetüüp e. variant. Tunnused võivad olla nii morfoloogilised, füsioloogilised, keemilised jne. Fenotüüp kujuneb genotüübis sisaldava info realiseerumise tulemusena ja tihti sõltuvalt keskkonna tingimustest.
Fenotüüpe kasutatakse mutantse alleeli jälgimisel tüvede ristamisel, mutatsiooni sisaldava geeni kindlaks tegemisel ja suppressorite isoleerimisel. Fenotüüpide iseloomustamisel kasutatakse erinevaid söötmeid: rikas sööde (YPD), mittefermenteeritavat süsiniku allikat sisaldav sööde (YPG) sünteetiline sööde (SC) või selektiivsööde (näiteks -Ura).
Mõned sagedamini kasutatavd fenotüübid:
1. Temperatuurist sõltuvad fenotüübid. Sellesse rühma kuuluvad nii temperatuuritundlikud (ts) kui ka külmatundlikud (cs) mutandid. Esimesel juhul ei suuda rakud kasvada kõrgetel temperatuuridel (35 oC-38 oC), teisel juhul madalatel temeperatuuridel (11 oC-24 oC). Temperatuuri sõltuvust testitakse nii rikkal kui ka sünteetilisel söötmel.
Temperatuuritundlikud mutatsioonid esinevad sagedasti geenides, mis kodeerivad raku eluks hädavajalikke valke. Sellesse rühma kuuluvad valgud, mis on olulised replikatsioonil, transkriptsioonil, translatsioonil, rakutsükli regulatsioonil, tsütoskeleti moodustamisel jne. Külmatundlikkus on tihti seotud mitmest subühikust koosneva kompleksi moodustumise defektidega (näiteks ribosoomi kokkupanek). Aravatakse, et mutatsioonid, mis põhjustavad cs fenotüüpi rikuvad valk-valk vahelisi interaktsioone.
Hädavajalike geenide
temperatuuritundlike alleelide fenotüübid on kogutud andmebaasi PhenoM
("phenomics of yeast mutants"). Andmebaas sisaldab 775
temperatuuritundliku alleeli analüüsi. Kokku kirjeldatakse 491
hädavajalikku geeni.
2. Rakutsükli defektid. Rakutsükli mutandid tehakse kindlaks raku morfoloogiat ja jagunemist jälgides. Analüüsitakse raku suurust, punga suurust, DNA värvimisega tuuma asukohta, DNA sisaldust, vastust feromoonile jne. Tavaliselt peatuvad need mutandid mõnes kindlas rakutsükli faasis. Eristatakse G1 peatuvaid (väikesed, pungata rakud), G1 mittepeatuvaid (statsionaarse faasi rakud, kellel on erineva suurusega pungad) ja G2/M peatuvaid (suure pungaga rakud) mutante. Mõned neist mutantidest on ka temperatuuritundlikud, teised aga mitte.
3. Paardumise ja sporulatsiooni defektid. Haploidsete rakkude paardumine ja diploidsete rakkude sporulatsioon on reguleeritud teatud geenide poolt. Seega võivad defektid paardumises ja sporulatsioonis olla seotud vigase transkriptsiooni regulatsiooniga. Paardumise defekte analüüsitakse tüvede ristamise katses. Segatakse teatud kindel arv vastaspaarumistüübiga mutandi rakke, lastakse neil 24 tundi ristuda rikkal söötmel ning seejärel selekteeritakse diploidid. Selliste tüvede ristamisel saadakse vähem homosügootseid diploide kui metsiktüübiga ristamisel. Paardumise defekte analüüsitakse ka kasutades "Halo" testi. Mõõdetakse feromooni poolt põhjustatud kasvu inhibitsiooni ulatust. Sporulatsioonidefekte hinnatakse askuste arvu lugemise teel. Diploidsed rakud läbivad meioosi ja moodustavd spoorid kui nad satuvad lämmastiku nälga ning kasvukeskonnas on mittefermenteeritav süsiniku allikas. Mõned mutatsioonid põhjustavad diploidsete rakkude sporuleerumist aga ka rikkal söötmel.
4. Suhkrute metabolismi defektid. Pagaripärm kasutab glükoosi kui eelistatud süsiniku allikat. Mutandid, kes ei ole võimelised kasutama alternatiivseid süsiniku allikaid (näiteks galaktoos, sahharoos, rafinoos, maltoos jne.) omavad mutatsioone nende suhkrute metabolismirajas töötavates ensüümides või geenides, mis kodeerivad transportereid. Samuti võivad mutatsioonid esineda regulatoorsetes geenides, mis on vajalikud geenide transkriptsiooni aktivatsioonil või derepressioonil.
Siia rühma kuuluvad ka hingamisahela mutandid. Need tüved ei ole võimelised kasvama mittefermenteeritaval süsiniku allikal (näiteks glütserool, etanool, laktaat). Hingamisahela mutandid kasvavad glükoosi sisaldaval söötmel aeglasemalt ja moodustavad nn. petite kolooniaid. Eristatakse mitokondriaalse genoomi kaotanud (rho0) või mutantse mitokondriaalse genoomiga (rho-) tüvesid. Tuumagenoomis olevaid mutatsioone, mis asuvad hingamiseks vajalikes geenides, nimetatakse PET mutantideks.
5. Raku morfoloogia mutandid. Pagaripärmi haploidseid rakke iseloomustab aksiaalne pungumismuster, st. järgmine pung moodustub eelmise punga tekkekoha kõrvale. Diploidsed rakud punguvad bipolaarselt, st. järgmine pung moodustub eelmise punga tekkekoha vastu. Eraldatud on rida mutante, kellel on pungumismustri defekt (nn. BUD mutandid).
6. Stressi vastuse mutandid. Eristatakse tundlikkust kuumatöötluse, nälja, kahevalentsete katioonide ja raskemetallide suhtes.
7. Tundlikkus antibiootikumide ja mürkide suhtes. Kanavaniin on arginiini analoog, mida transpordib rakku CAN1 poolt kodeeritud arginiini permeaas. Rakku sattudes lülitatakse kanavaniin valkude koostisesse, mis inaktiveerib valgud. Restentsuse põhjustab mutatsioon can1 lookuses.
Kasutatakse ka antibiootikumidele tundlike mutante (tundlikud genetitsiini, hügromütsiin B, neomütsiini, tsükloheksimiidi jne. suhtes).
Seda loetelu võib jätkata. Fenotüübi valik sõltub eelkõige rakus toimuvast protsessist rakus, mida uuritakse.