Mutantide eraldamise meetodid
Mutantide eraldamise meetodid jagatakse kaheks:
- meetodid, mis alustavad kindlast fenotüübist. Mutatsioonid indutseeritakse üle terve genoomi juhuslikult ning selekteeritakse mutandid, kellel on just see kindel fenotüüp. Seejärel tehakse kindlaks mutatsiooni omavad geenid.
- meetodid, mis alustavad geeni järjestusest. Muudetakse kas geeni ekspressioonitaset või indutseeritakse mutatsioonid selle geeni järjestuses ning analüüsitakse tekkivaid fenotüüpe.
Juhusliku mutageneesi puhul otsitakse teatud funktsiooni täitvaid geene. Mutageenide kasutamine ei
eelda mingit eelnevat teadmist geenide järjestustest ega nende poolt
kodeeritavatest valkudest. Peab täpselt määratlema sobiva fenotüübilise
muutuse, mille järgi mutante selekteerida. Seda meetodit ei saa
kasutada kui soovitakse saada spetsiifilist mutatasiooni mõnes kindlas
geenis. Puuduseks võib pidada ka ühes rakus mitmes erinevas geenis samaaegset mutatsioonide tekkimist.
Spetsiifilise mutageneesi korral muudetakse kindlat geeni järjestust. Võimalik on geen deleteerida, mõjutada selle geeni transkriptiooni või indutseerida mutatsioone selle geeni kodeerivas järjestuses. Geeni deleteerimiseks kasutatakse homoloogilist rekombinatsiooni, mille käigus geeni kodeeriv järjestus asendatakse markergeeniga. Geeni ekspressiooni saab muuta kui asendada geeni promootor mõne reguleeritava promootoriga. Promootori indutseerimisel saavutatakse üleekspressioon. Promootori repressioonil transkriptsiooni ei toimu. Uuritavas geenis on mutatsioone kerge teha kasutades vigu tegevat PCR
meetodit. Seda meetodit kasutades tekivad geeni järjestusse mutatsioonid juhuslikult. Suunatud mutageneesi käigus muteeritakse aga kindel aminohape, järjestus või deleteeritakse funktsionaalsed domeenid.
Geeni mutantseid alleele on võimalik rakus uurida plasmiidi-vahetamise
meetodi abil. Seda meetodit kasutatakse nii individuaalse valgu funktsiooni uurimiseks kui ka uuritava geeni konditsionaalsete alleelide isoleerimiseks.
Plasmiidi-vahetamise meetodi puuduseks on spetsiaalse tüve vajalikkus.
See tüvi peab sisaldama uuritava geeni deletsiooni. Kasutatavad
plasmiidid on madala koopiaarvuga tsentromeersed plasmiidid.
Vaatamata sellel võib nende plasmiidide arv raku kohta olla kuni 4.