Genoomi mutagenees
Pärmides on spontaansete
mutatasioonide tekkesagedus väike. Et indutseerida pärmigenoomis
mutatsioonide teket kasutatakse erinevaid mutageene:
- ultraviolet kiirgus (UV)
- etüülmetaan-sulfonaat (EMS)
- metüül-nitro-nitrosoguanidiin (MNNG)
- dietüülsulfaat (DES)
1. Ultraviolet kiirgus (UV) on lühema lainepikkusega kui nähtav valgus ning on vahemikus 10 nm kuni 400 nm. UV kiirgus põhjustab kovalentsete sidemete teket kõrvuti paiknevate pürimidiinide vahel. Näiteks, kõrvuti paiknevate tümidiinide vahel tekivad tümidiini (T-T) paarid. Reeglina sellised vead parandatakse kiiresti. Mõnedel juhtudel jäävad nad aga parandamata. Tümidiini paar käitub DNA replikatsioonil kui üks nukleotiid. Replikatsiooni tulemusena tekib ühe nukleotiidiline deletsioon, mis põhjustab raaminihke teket.
2. Etüül-metaansulfonaat (EMS) on mutageenne ja kartsinogeenne ühend valemiga CH3SO3C2H5.
Ta põhjustab nukleotiidi asendusi juhuslikult kogu genoomi ulatuses. EMS-i etüülrühm reageerib DNA-s guaniini alusega. Selle tulemusena tekib O6-metüülguaniin. DNA replikatsioonil lülitab DNA polümeraas uue ahela sünteesimisel sellesse positsiooni tsütosiini asemel tümiini. Seega algse G:C paari asemel tekib A:T paar. Tekib punktmutatsioon, mis võib põhjustada ühe aminohappe muutumist või stop koodoni teket.
3. Metüül-nitro-nitrosoguanidiin (MNNG) on mutageen ja kartsinogeen valemiga C2H5N5O3.
Ta reageerib guaniini O6 ja tümiini O4 positisoonidega ning põhjustab sarnaselt EMS-ga G:C paari muutumist A:T paariks.
4. Dietüül-sulfaat (DES) on väga toksiline ja arvatavasti ka kartsinogeenne ühend, mille valemiks on (C2H5)2SO4.
Enamasti põhjustab DES nukleotiidi vahetusi, vähesel määral ka deletsioone. Ta reageerib guaniini O6 positisooniga. Selle tulemusena toimub G:C paari vahetus A:T paari vastu.
Nende mutageenide kasutamisel on
mutatsioonide tekkesagedus 5 x 10-4 kuni 1 x 10-2/ geeni kohta.
Genoomi mutagenees ja mutantide eraldamine algab rakkude töötlemisega mutageeniga (Joonis 3). Kasutatakse mutageeni kontsentratsioone, mis jätab ellu 10-50% töödeldud rakkudest. Seejärel kasvatatakse rakke mõned põlvkonnad mitteselektiivses vedelsöötmes, et kinnistada mutatsioonid genoomis. Mõne mutageeni puhul (näiteks MNNG) toimub mutatsioonide teke genoomis DNA replikatsiooni käigus. Mutatsiooni kinnistumiseks peab see kanduma edasi ka järgmisele põlvkonnale. Lisaks antakse rakkudele aega taastuda mutageeni poolt tekitatud kahjustustest. Rakud külvatakse rikkale söötmele ning kasvatatkse kuni moodustuvad kolooniad. Mutantide leidmiseks kasutatakse selektsiooni. Kolooniad tembeldatakse kahele tassile. Üks neist pannakse kasvama lubatud tingimustele. Sellel tassil kasvavad üles kõik kolooniad. Teine tass pannakse kasvama piiratud tingimustele. Sellel tassil ei kasva otsitavat mutatsiooni omavad rakud. Väljavalitud mutandid ristatakse mitmeid kordi metsiktüüpi tüvega, et selekteerida ainult ühte mutatsiooni sisaldavad tüved. Seda kontrollitakse tetraadide analüüsi kasutades.
Joonis 3. Genoomi mutagenees ja mutantide eraldamine.